Abstract
Bakgrunn
Protein tyrosin fosfatase reseptor type D (PTPRD ) er en antatt tumor suppressor i flere krefttyper, inkludert hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC). STAT3 er en hyppig hyperactivated onkogen i HNSCC. Som STAT3 er en direkte substrat av PTPRD, forsøkte vi å finne ut de genetiske eller epigenetiske endringer av
PTPRD
som bidrar til overaktiv STAT3 i HNSCC.
Metoder
Vi analyserte data fra Kreft Genome Atlas (TCGA) og vår forrige hel-exome sekvense studier og oppsummert mutasjonen, metylering, og kopiere antall status for
PTPRD
i HNSCC og andre kreftformer.
In vitro
studier involvert standard transfeksjon og MTT protokoller, samt metylering spesifikke PCR.
Resultater
Våre funn tyder på at
PTPRD
mutasjon, snarere enn metylering eller kopitall endring, er den primære mekanismen som PTPRD funksjon går tapt i HNSCC. Vi viser at overekspresjon av vill-type PTPRD i HNSCC-celler inhiberer vekst og STAT3 aktivering betraktelig PTPRD mutanter ikke, noe som tyder på at mutasjon kan føre til tap av funksjon og påfølgende hyper-fosforylering av PTPRD substrater, spesielt STAT3. Viktigere, fant vi ut at HNSCC celler som en endogen
PTPRD
mutasjon er mer følsomme for STAT3 blokade enn
PTPRD
villtype celler. Vi i tillegg funnet at
PTPRD
mRNA uttrykket ikke korrelerer med pSTAT3 uttrykk, noe som tyder på at endringer som manifesterer gjennom endret mRNA uttrykk, inkludert hypermethylation og genkopitallet endringer, ikke bidra vesentlig til STAT3 overaktivering i HNSCC.
Konklusjon
PTPRD
mutasjon, men ikke metylering eller kopiere antall tap, kan tjene som en prediktiv biomarkør av følsomhet for Stat3 hemmere i HNSCC
Citation.: Peyser ND, Du Y, Li H, Lui V, Xiao X, Chan TA, et al. (2015) Tap-of-Funksjon
PTPRD
Mutasjoner fører til økt STAT3 Aktivering og følsomhet til STAT3 Hemming i hode- og halskreft. PLoS ONE 10 (8): e0135750. doi: 10,1371 /journal.pone.0135750
Redaktør: Qian Tao, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hongkong
mottatt: 26 mars 2015; Godkjent: 25 juli 2015; Publisert: 12. august 2015
Copyright: © 2015 Peyser et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: Genomisk og proteomikk data er tilgjengelige fra Kreft Genome Atlas (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/dataAccessMatrix.htm) og Kreft Proteome Atlas (https://app1.bioinformatics.mdanderson.org/tcpa/_design /basic/index.html)
finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (www.nih.gov) finansiering P50CA097190 og R01CA77308 til JRG, og F31DE024007 til NDP, American Cancer Society (www .cancer.org) til JRG, China Scholarship Council (https://en.csc.edu.cn) til YD, og General forskningsfond fra stipend Council of Hong Kong (http: //www.ugc. edu.hk/) 17114814 og Seed midler til grunnforskning til VL
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Protein tyrosin fosfatase reseptor type D (PTPRD) er et medlem av reseptor-type protein tyrosin fosfatase (PTPR) familie. PTPRs er membran-integral enzymer som katalyserer fjerning av fosfatgrupper fra spesifikke proteiner, noe som påvirker cellesignalisering. Feilregulering av PTPR signalering av genetiske og /eller epigenetiske mekanismer kan derfor til slutt føre til kreft fenotyper. [1] Flere PTPR familiemedlemmer, inkludert PTPRD, har blitt rapportert å fungere som tumor suppressors der tap av funksjonsendringer kan drive tumorvekst. [2,3] Genetiske arrangementer, inkludert mutasjon, genet sletting, eller epigenetisk lyddemping kan føre til redusert fosfatase aktivitet PTPRs og forbedret onkogene signalisering. [1]
Vi har nylig rapportert den kumulative mutasjon profil av
PTPR
genet familie i kreft med fokus på
PTPRT
mutasjon fører til STAT3 aktivering i hode og nakke plateepitel cell carcinoma (HNSCC). [4] Vår analyse viser at 15 solide tumortyper næret mutasjoner av minst en
PTPR
genet.
PTPRD
er en av de mest muterte
PTPR
familiemedlemmer i HNSCC og PTPRD har blitt rapportert å fungere som en tumor suppressor i denne malignitet. [5]
PTPRD
er også mutert, slettet eller hyper-metylert i glioblastom (GBM), mens genet er unmethylated og uttrykt i normalt hjernevev. [6] Videre,
PTPRD
mutasjoner ble funnet å være assosiert med forhøyet ekspresjon av fosforylert STAT3, en direkte PTPRD substrat, i GBM. I tillegg til GBM, 13% og 25% av HNSCC-tumorer ble analysert i ovennevnte studien harboured
PTPRD
mutasjon eller promoter metylering, respektivt. Homozygot sletting av
PTPRD
har i tillegg blitt rapportert i strupekreft, noe som tyder på at genetiske avvik som påvirker PTPRD funksjon kan være en vanlig hendelse på tvers av mange kreftformer. [5]
Disse kumulative funnene førte oss til hypoteser som genetisk og /eller epigenetisk endring av
PTPRD
kan bidra til økt signalering og vekst i HNSCC der sentrale deler av veien kan tjene som plausibel terapeutiske mål. Her kan vi oppsummere det genetiske og epigenetisk profilen til
PTPRD
i HNSCC fra Kreft Genome Atlas (TCGA) og vår før HNSCC mutasjons landskapet studien. [7] Vi deretter testet konsekvensene av
PTPRD
endringer funnet i menneskelige HNSCC svulster i relevante prekliniske modeller for å vurdere STAT3 aktivitet og følsomhet for STAT3 hemming.
Materialer og metoder
Cell kultur, medikamentell behandling, og transfeksjon
Alle HNSCC cellelinjer ble genotypisk verifisert som tidligere beskrevet. [4] Cal27 celler ble erholdt fra ATCC (Manassas, VA). PE /CA-PJ34clone12 og PE /CA-PJ49 celler ble oppnådd fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). 686LN celler ble oppnådd fra Georgia Chen ved MD Anderson Cancer Center (Houston, TX). Cal27 celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) (Mediatech, Inc., Manassas, VA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA). 686LN-celler ble dyrket i DMEM /F12 (Life Technologies, Grand Island, NY) supplert med 10% FBS. PE /CA-PJ34clone12 og PE /CA-PJ49 ble dyrket i Iscoves Modification of DMEM (Mediatech Inc, Manassas, VA) supplert med 10% FBS og 2 mM L-glutamin (Life Technologies, Grand Island, NY). Alle celler ble opprettholdt i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO
2. JSI-124 (Calbiochem, Billerica, MA) ble oppløst i DMSO. Transfeksjon ble utført med Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Grand Island, New York) eller Fugene HD (Promega Corporation, Madison, WI) i henhold til produsentens instruksjoner med 4 mikrogram DNA fortynnet i Opti-MEM (Life Technologies, Grand Island, New York).
Seterettet rettet~~POS=HEADCOMP mutagenese
PTPRD
mutasjoner (K1502M, S384R, T1100M og L1147F) ble samlet inn villtype plasmid bruker Phusion seterettet mutagenese kit ( Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) etter produsentens protokoll og bekreftet av Sanger-sekvensering. Plasmid presiseringer ble utført ved hjelp av QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) eller orkanen Maxi Prep Kit (GerardBIOTECH, Oxford, OH) i henhold til produsentens instruksjoner.
Immunoblotting
Primær antistoffer for pSTAT3 (Y705) og STAT3 ble hentet fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). P-tubulin primært antistoff ble kjøpt fra Abcam (Cambridge, MA). Sekundære antistoffer ble kjøpt fra Bio-Rad (Hercules, CA). Blottene ble kvantifisert ved densitometri ved hjelp ImageJ programvare.
MTT-analysen
MTT-analyser ble utført ved å inkubere cellene i 5 mg /ml 3- [4,5-dimetyltiazol-2-yl] -2 , 5 difenyl tetrazoliumbromid i PBS ved i 30 min ved 37 ° C og 5% CO
2. Etter inkubering, ble løsningen aspirert og erstattet med DMSO. Absorbans av denne løsningen ble målt ved 570 nm på et spektrofotometer.
Metylering spesifikk PCR
Tumor og normalt vev ble oppnådd i regi av en Institutional Review Board godkjent protokollen ved Universitetet i Pittsburgh. DNA ble isolert fra formalin-fiksert paraffin innleiret vev ved hjelp av QIAamp DNA FFPE Tissue Kit, og cellelinje DNA ble isolering ved hjelp av QIAamp DNA Mini Kit. Bisulfite konvertering ble utført ved hjelp av EpiTect Bisulfite Kit og metylering spesifikke polymerase chain reaction (MSP) ble utført ved bruk av EpiTect MSP Kit. Alle sett ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner (Qiagen, Hilden, Tyskland). MSP primere ble utformet ved hjelp MethPrimer programvare. [8] For metylering, forover- og revers primer sekvenser var henholdsvis GTTTTATTTTGGATTTTTGGAATC og TACCTAACGCGACCTAAACG,. For unmethylation, forover- og revers primer sekvenser var henholdsvis TATTTTGGATTTTTGGAATTGT og AACTACCTAACACAACCTAAACAAA,. Primere var spesifikke for den tiltenkte metylering status som bestemmes ved hjelp av EpiTect kontroll DNA Set (Qiagen, Hilden, Tyskland).
Data nedlasting og analyse
Mutation, kopiantall endring, og RNA-Seq dataene ble samlet fra cBio Portal [9,10] og publiserte rapporter. [6,7,9] DNA metylering data ble innhentet gjennom TCGA datamatrise (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/dataAccessMatrix.htm). DNA og proteinsekvenser og domene merknader ble hentet fra National Center for Biotechnology Information (https://www.ncbi.nlm.nih.gov). Omvendt fase protein array-data ble hentet fra Kreft Proteome Atlas (https://app1.bioinformatics.mdanderson.org/tcpa/_design/basic/index.html). Statistiske tester ble utført med GraphPad Prism 5-programvaren (GraphPad, La Jolla, CA).
trypanblått Eksklusjons
PE /CA-PJ34clone12 celler ble sådd ut på seks-brønns plater på 100.000 celler per godt. Etter 24 timer ble celler transfektert med vektor kontroll, vill-type PTPRD, eller PTPRD mutanter in triplo ved bruk av 4 ug av plasmid-DNA, 12 ul Fugene HD (Promega Corporation, Madison, WI), og 200 ul Opti-MEM (Life Technologies , Grand Island, NY) per brønn tilsatt direkte til brønner inneholdende 3 ml fullstendig medium. Etter 72 timer ble cellene trypsinisert og resuspendert i PBS som inneholdt 0,2% trypanblått (MP Biomedicals, LLC, Santa Ana, CA). Hver celle suspensjon ble regnet i fire felt på en hemacytometer og gjennomsnittlig ble brukt til å beregne det totale antall celler tilstede.
Resultater
PTPRD mutasjoner forekommer ofte i HNSCC og andre kreftformer
somatisk mutasjon er en vanlig hendelse som fører til endret gen og proteinfunksjon i kreft. Atten ikke synonymt
PTPRD
mutasjoner har blitt identifisert hittil i HNSCC svulster. [6,7,9,10] Disse mutasjonene vises spredt over hele genet og protein sekvens. (Fig 1 A) De er alle ikke-tilbakevendende, med hver forekommer i en enkelt HNSCC tumor, noe som tyder på at disse er sannsynligvis være tap-av-funksjon mutasjoner. Av disse 18 mutasjoner, 12 forekomme i det ekstracellulære domene, er en lokalisert til det katalytiske domenet, og 5 er i den transmembrane region hvor det ikke konserverte domene har blitt identifisert. I tillegg til HNSCC,
PTPRD
mutasjoner er også mye observert i andre krefttyper. (Fig 1B) I Kreft Genome Atlas (TCGA) samling,
PTPRD
er oftest mutert i kutan melanom (59/344 tilfeller, 17,2%), etterfulgt av lunge adenokarsinom (33/230 tilfeller, 14,3% ), og magen adenokarsinom (30/289 tilfeller, 10,4%). [9,10] Som i HNSCC,
PTPRD
mutasjoner i disse kreftformene ser ikke ut til å klynge inn hotspot regioner eller rester, noe som tyder på at tap av PTPRD funksjon ved somatisk mutasjon er et felles arrangement på tvers av flere kreftformer.
(A) Lokalisering av PTPRD protein mutasjoner rapportert i HNSCC svulster. Red: TCGA svulster [9,10]; Grønn: fra [6]; Blå: fra [7]. IG, immunoglobulin; IG2, Second immunoglobulin (lg) -lignende domene av reseptoren protein tyrosin fosfatase (RPTP) -F; FN3, Fibronektin type 3 domene; PTPc, protein tyrosin fosfatase, katalytisk domene. (B) Frekvens av
PTPRD
mutasjoner i kreft hos mennesker som bestemmes av TCGA, med HNSCC vist i rødt.
Den eneste mutasjon påvises i HNSCC som tidligere er blitt identifisert i en annen kreft er T1100M, som ble rapportert i kronisk lymfatisk leukemi. [11] Det er interessant flere andre mutasjonsstedene i HNSCC har en annen aminosyre-substitusjon rapportert i andre kreftformer. For eksempel, mens K204E er observert i HNSCC, K204Q er rapportert hos kreftfaren. [12] I tillegg er en gjennomgang av den kosmiske database (https://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/) demonstrerer påvisning av L503V i leverkreft (sammenlignet med L503I i HNSCC) og L1036M i tykktarm adenokarsinom (sammenlignet med L1036P i HNSCC). Ding
et al
tillegg rapporterte en mutasjon på dette nettstedet (L1036Q) i lunge adenokarsinom. [13] Interessant, mens K1502M er den eneste katalytiske domenet mutasjon identifisert hittil i HNSCC, TCGA har identifisert en K1502 * tull mutasjon i lunge adenokarsinom. Sammen utgjør disse funnene tyder på at mens den spesifikke
PTPRD
mutasjoner funnet hittil i HNSCC er unik, kan aminosyre områder der de oppstår representerer viktige rester som er utsatt for genetiske endringer. Faktisk indikerer multippel sekvenssammenstilling analyse at disse rester er høyt konservert over arter, noe som tyder på at de kan ha en kritisk rolle i riktig PTPRD funksjon (analyse ikke vist).
HNSCC-avledede PTPRD mutanter fører til økt cellevekst
PTPRD har blitt rapportert å tjene som en tumor suppressor i menneskelig kreft. [3,5,6] For å bestemme de funksjonelle konsekvensene av
PTPRD
mutasjon i HNSCC, vi genererte flere representative HNSCC-avledet PTPRD mutanter av seterettet mutagenese, inkludert en mutasjon i det ekstracellulære domenet (S384R), en i det katalytiske domenet (K1502M), og to i transmembranområdet (T1100M og L1147F). Transient overekspresjon av disse konstruerer i en HNSCC cellelinje uten endogen
PTPR
familie mutasjoner (PE /CA-PJ34clone12) viste at alle de PTPRD mutanter testet ført til økt vekst som bestemmes av MTT-analyse i forhold til PTPRD vill -type-transfekterte celler. (Fig 2A) MTT analyseresultatene ble ytterligere bekreftet med representative mutanter av trypan blå eksklusjon analysen i PE /CA-PJ34clone12 celler (figur 2B). Sammen er disse resultatene tyder på at
PTPRD
mutasjoner inaktivere tumor undertrykkende funksjon av PTPRD uavhengig av deres lokalisering i hele genet, som fører til økt vekst /proliferasjon i HNSCC-celler.
(A) Cellevekst ble bedømt ved MTT-analyse 48 timer etter transfeksjon og normalisert til vektor-transfiserte kontroller. Enveis ANOVA P = 0,0007. Avbildede P-verdier representerer resultatene av parvise to-halet uparede t-tester. Eksperimentet ble gjennomført tre ganger med lignende resultater. (B) Celleformering ble bestemt ved trypan blå eksklusjon analyse 72 timer etter transfeksjon. Enveis ANOVA P 0,0001. Avbildet P verdiene representerer resultatene av parvise tosidige uparede t-tester.
PTPRD mutasjon er assosiert med økt pSTAT3 uttrykk
STAT3 er hyper-aktiveres ved konstituerende fosforylering av tyrosin 705 ( Y705) i mange krefttyper, inkludert HNSCC. [14,15] Viktigere pSTAT3 (Y705) er en kjent direkte substrat av PTPRD. [6] For å bestemme effekten av
PTPRD
mutasjon på STAT3 fosforylering i HNSCC, vi først undersøkte 200 HNSCC svulster med både hel exome sekvensering og RPPA analyser utført av TCGA og Kreft Proteome Atlas (TCPA). HNSCC svulster med ikke-synonyme
PTPRD
mutasjoner uttrykke betydelig høyere nivåer av pSTAT3 (Y705) i forhold til svulster med vill-type
PTPRD plakater (figur 3A). Spesielt,
PTPRD
er den eneste
PTPR
familiemedlem som denne sammenheng er observert. For å teste sammenhengen mellom
PTPRD
mutasjon og pSTAT3 uttrykk direkte, vi transfektert en HNSCC cellelinje med kjent endogen
PTPRD
mutasjon (Cal27 husing mutasjon S387L) med villtype
PTPRD
eller vektorkontroll, og fant at overekspresjon av vill-type PTPRD fører til signifikant redusert pSTAT3 uttrykk (P ≤ 0,05). (Fig 3B og 3C) Videre overekspresjon av mutant PTPRD i HNSCC celler uten endogen
PTPR
familie mutasjoner (PE /CA-PJ34clone12) fører til økt pSTAT3 (Y705) uttrykk i forhold til PTPRD villtype-overekspresjon celler for nesten alle mutasjoner testet. (Fig 3D og 3E) Sammen utgjør disse resultatene viser at
PTPRD
mutasjon fører til økt STAT3 signalisering i HNSCC celler og svulster.
(A) HNSCC svulster husing
PTPRD
mutasjoner uttrykkelig økt pSTAT3 (Y705) i forhold til
PTPRD
vill type svulster som bestemmes av hele exome sekvensering og revers-fase protein array (RPPA). Tosidige uparede t-test. (B) Overekspresjon av villtype PTPRD i en
PTPRD
-mutant cellelinje (Cal27) fører til redusert pSTAT3 (Y705) uttrykket (C) Kvantifisering av tre replikate eksperimenter som er vist i B. tosidige uparede t-test. (D)
PTPRD
-wild-type HNSCC celler (PE /CA-PJ34clone12) forbigående overekspresjon mutant PTPRD utstillings økt pSTAT3 (Y705) uttrykk i forhold til villtype-uttrykke celler. (E) Kvantifisering av tre replikere eksperimenter som vist i D. To-tailed uparet t-test.
HNSCC celler med endogen PTPRD mutasjon er mer følsomme for STAT3 pathway hemming
Siden
PTPRD
mutasjoner øke STAT3 aktivering i HNSCC, vi neste søkt å fastslå om
PTPRD
mutasjon fører til økt følsomhet for STAT3 sti hemming. For å teste vår hypotese, ansatt vi HNSCC celler som havn en endogen
PTPRD
mutasjon (PE /CA-PJ49). Behandling med JAK /STAT inhibitor JSI-124 fryder at disse
PTPRD
mutante celler viser forbedret sensitivitet i forhold til
PTPR
familie villtype celler (PE /CA-PJ34clone12), noe som tyder på at
PTPRD
mutasjon kan tjene som en prediktiv biomarkør for respons på STAT3 sti-inhibitorer (figur 4).
Celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av JSI-124 i 24 timer, fulgt av MTT-analyse. Eksperimentet ble utført tre ganger med samme resultat.
PTPRD mRNA uttrykk ikke korrelerer med pSTAT3 uttrykk
Arrangøren hypermethylation og genkopitallet tap representerer ytterligere to mekanismer som kan føre til tap av funksjon av
PTPRD
via nedregulering av mRNA uttrykk. Viktigere,
PTPRD
mRNA uttrykk ikke korrelerer med pSTAT3 uttrykk i TCGA HNSCC prøver, noe som tyder på at metylering og kopiere antall tap ikke bidra vesentlig til STAT3 overaktivering i HNSCC (S1A fig). Faktisk viser en mer detaljert analyse at mens
PTPRD
metylering ikke korrelerer med mRNA uttrykk som forventes for noen genet (S1B figur), ser vi ingen sammenheng mellom metylering og pSTAT3 uttrykk (S1C figur), og heller ikke vi observere eventuelle tilfeller av avvikende promoter hypermethylation (her definert som metylering nivå større enn tre standardavvik over gjennomsnittet metylering av samme genetiske locus i organ matchet normale prøver). For å validere disse funnene, utførte vi metylering spesifikk PCR på selvstendig kohort av HNSCC svulster og funnet bevis for
PTPRD
promoter metylering i 75% av svulster analysert (30/40) (representant analyse i S2 fig ). Viktigere, vi også observert
PTPRD
promoter metylering i fem sammenkoblede normale munnslimhinnen prøver fra disse HNSCC pasienter (S3 Fig), videre tyder på at
PTPRD
metylering observert i HNSCC er ikke tumorspesifikt .
PTPRD
kopiere tall endringer skje i vesentlig grad i HNSCC og andre kreftformer (figur 5A), der genet kopi tap, spesielt heterozygot tap, forekommer oftere enn gevinst i HNSCC og alle kreft analysert med unntak av kolorektal og livmorhalskreft. Viktigere, har vi ikke observerer en signifikant korrelasjon mellom kopitall endringer og mRNA uttrykk i HNSCC (figur 5B). Sammen utgjør disse funnene tyder på at arrangøren hypermethylation og genkopitallet tap ikke bidra vesentlig til STAT3 overaktivering i HNSCC.
(A) Kopier nummer endring av
PTPRD
i humane kreftformer som bestemmes av TCGA . (B)
PTPRD c
iering antall endringer korrelerer ikke med endret
PTPRD
mRNA uttrykk i HNSCC. En Jonckheere-Terpstra testen ble utført ved hjelp StatXact programvare (Cytel, Cambridge, MA).
Diskusjoner
STAT3 er et onkogen som er hyper-aktivert i mange kreftformer, inkludert HNSCC, hvor STAT3 hyper-aktivering er assosiert med redusert overlevelse og resistens overfor EGFR-målrettet terapi. [9,16,17] Potensielle mekanismer som kan føre til økt STAT3 aktivering i kreft inkluderer økt signalering gjennom oppstrøms reseptor eller ikke-reseptor tyrosin kinaser som EGFR og JAK, og /eller inaktivering av negative regulatorer av STAT3, inkludert protein tyrosin fosfataser . [18,19] Vi har nylig rapportert at reseptor-type protein tyrosin fosfatase (PTPR) familie er hyppig mutert i HNSCC og andre kreftformer og vist at HNSCC-avledet mutasjoner av PTPRT indusere STAT3 fosforylering og kjøre HNSCC celle overlevelse. [4] Som PTPRD representerer en ytterligere reseptor-lignende fosfatase som direkte rettet mot STAT3, forsøkte vi å finne ut om genetisk eller epigenetisk tap av PTPRD funksjon kan bidra til STAT3 overaktivering i HNSCC.
I denne studien, må vi først identifisert 18 tidligere uncharacterized
PTPRD
mutasjoner i HNSCC svulster. Disse mutasjonene er alle ikke-tilbakevendende og er lokalisert over hele genet, et mønster som er forenlig med at generelt sett for tumorsuppressorgener. Vi har vist at overekspresjon av vill-type PTPRD fører til veksthemming i HNSCC-celler, mens overekspresjon av representative mutanter ikke gjør det, og dermed etablere en funksjonell følge av
PTPRD
mutasjon i HNSCC modeller. Disse funnene er i samsvar med de foregående
in vitro
studier på tvers av flere krefttyper, inkludert glioblastom, melanom, tykktarmskreft, og neuroblastom, hvor villtype PTPRD har blitt observert å undertrykke kolonidannelse og cellevekst i tillegg som forsterke apoptose, mens kreft-avledede PTPRD mutanter ikke. [3,6,20] Disse kumulative funnene tyder på at
PTPRD
mutasjoner i kreft fører til tap av sin svulst undertrykkende funksjon.
For å finne ut om
PTPRD
mutasjon påvirker aktiviteten til STAT3, en PTPRD substrat, analyserte vi TCGA og TCPA data og fant at HNSCC svulster med
PTPRD
mutasjoner uttrykke signifikant forhøyet pSTAT3 (Y705) i forhold til
PTPRD
-wild-type svulster. Vi har tidligere rapportert en lignende sammenheng mellom pSTAT3 (Y705) uttrykk og mutasjon av en gruppe antatt
PTPR
tumorsuppressorgener, inkludert
PTPRD
. [4] Når hvert gen blir vurdert individuelt og ikke som en gruppe,
PTPRD
er den eneste
PTPR
familiemedlem som mutasjon er signifikant assosiert med pSTAT3 (Y705) uttrykk (S4 fig) . Dette resultatet tyder på at mens antall svulster huse en mutasjon i ett enkelt
PTPR
familiemedlem kan være tilstrekkelig til å påvise en signifikant forskjell i pSTAT3 (Y705) uttrykk,
PTPRD
mutasjon i særdeleshet unikt assosiert med en økning i pSTAT3 (Y705) uttrykk som er tilstrekkelig stor for å detektere statistisk signifikans. Videre ber overekspresjon av vill type PTPRD i HNSCC cellelinjer husing endogen
PTPRD
mutasjoner fører til nedregulering av pSTAT3 (Y705), noe som bekrefter at PTPRD regulerer STAT3 aktivering i HNSCC modeller. Selv om vill-type PTPRD fører til nedregulering av pSTAT3 (Y705) i HNSCC-celler, betyr overekspresjon av de fleste HNSCC-avledede mutanter ikke forandre pSTAT3 (Y705) ekspresjon relativt til vektorkontroll, noe som tyder på at disse mutasjonene fører til tap av funksjon, men ikke i en dominant negativ måte. I tilfellet med den L1147F mutasjonen testet heri overekspresjon i HNSCC-celler fører til økt vekst, men ikke øket pSTAT3 (Y705) ekspresjon (se figurene 2A og 3D), noe som indikerer at visse mutasjoner kan føre til kreft fenotyper i en STAT3 uavhengig . Disse mutasjonene kan manifestere seg gjennom alternative mekanismer som kan omfatte ekstracellulære interaksjoner eller endring av relative affinitet for alternative enzymatiske substrater.
Som
PTPRD
mutasjon fører til økt STAT3 aktivering i HNSCC, vi neste testet om celler husing en
PTPRD
mutasjon kan være mer følsomme for STAT3 sti hemming. Her viser vi at HNSCC celler med en endogen
PTPRD
mutasjon er mer følsomme for JAK /STAT inhibitor JSI-124 enn HNSCC celler husing noen
PTPR
familie mutasjoner, som tyder på at HNSCC svulster med
PTPRD
mutasjoner kan være utsøkt sensitive til Stat3 hemmere som er i preklinisk og klinisk utvikling. For å utvikle en optimal behandlingsstrategi for HNSCC pasienter med
PTPRD
mutasjoner, videre studier av tilleggs PTPRD-samspill proteiner som kan tjene som terapeutiske mål kan være berettiget. Spesielt
PTPRD
mutasjon kan i tillegg gi følsomhet for aurora kinase A-hemmere nå i klinisk utvikling, der aurora kinase A fosforylering og stabilitet er normalt regulert av PTPRD. [3]
En annen mekanisme som
PTPRD
funksjon kan gå tapt gjennom mRNA downregulation, blant annet ved å promoter hypermethylation eller genkopitallet tap. Først må vi fastslått at
PTPRD
mRNA uttrykket ikke korrelerer med pSTAT3 uttrykk i HNSCC, noe som tyder på at disse mekanismene er ikke sannsynlig å bidra vesentlig til STAT3 overaktivering i HNSCC. Det bør bemerkes at denne analysen kan kompliseres ved flere tilfeller der lite eller intet
PTPRD
mRNA ble detektert. Faktisk våre overekspresjon studier i HNSCC celler tyder på at uttrykk for PTPRD kan forventes å påvirke pSTAT3 (Y705) uttrykk. Likevel har denne sammenhengen ikke dukket opp på HNSCC svulster analysert for å date.
En mer detaljert analyse av disse mekanismene ved siden avslørte at
PTPRD
arrangøren ikke hypermethylated i HNSCC forhold til organ matchet normalt vev, et funn vi validert i en uavhengig kohort av HNSCC svulst og matches normale parene ved metylering spesifikke PCR. Forskjellen mellom våre nåværende funn og tidligere rapporter om
PTPRD
promoter metylering i HNSCC er sannsynligvis på grunn av tidligere mangel på sammenligning mellom tumor og normalt vev. [6] Den lave
PTPRD
promoter metylering observert i HNSCC er i tillegg ikke forbundet med endret pSTAT3 (Y705) uttrykk, videre tyder på at denne hendelsen ikke bidra vesentlig til kreft fenotype i HNSCC. En tilsvarende mangel på avvikende
PTPRD
promoter hypermethylation har også blitt rapportert i kutant plateepitelkarsinom, noe som tyder på dette kan være en uvanlig hendelse i flere epiteliale kreftformer. [21]
Vår analyse av TCGA data viser at nesten halvparten av HNSCC svulster havn en kopi antall endring av
PTPRD Hotell og at kopien antall tap er hyppigere enn kopiantall gevinst i HNSCC og tvers nesten alle kreft analysert.
PTPRD
homozygot eller heterozygot delesjon har også blitt rapportert i kutant plateepitelkarsinom [21,22], GBM [6,20,23,24], lungekreft [25,26], neuroblastom [27], metastatisk melanom [28,29], plateepitelkarsinom vulva [30], leverkreft [31], og laryngeal plateepitelkarsinom [5]. Viktigere var ingen signifikant sammenheng oppdaget mellom
PTPRD
kopiere nummer endring og
PTPRD
mRNA uttrykk i HNSCC, noe som tyder på at kopiantall tap er ikke den primære mekanismen for tap av PTPRD funksjon i HNSCC.
i konklusjonen har vi vist her som somatisk mutasjon av
PTPRD
er den primære mekanismen som PTPRD tap av funksjon skjer i HNSCC. Vi foreslår at nesten alle disse mutasjonene fører til tap av katalytisk aktivitet og følgelig redusert defosforylering av substratet pSTAT3 (Y705). Mens arrangøren metylering og kopiere antall tap kan påvises ved
PTPRD
locus, er disse hendelsene ikke forbundet med oppregulering av pSTAT3 (Y705) uttrykk. I kontrast, somatisk mutasjon av
PTPRD
fører til økt STAT3 aktivering i HNSCC svulster og cellelinjer, samtidig med økt cellevekst og følsomhet for STAT3 sti hemming. Disse funnene tyder på at
PTPRD
mutasjon kan representere en prediktiv biomarkør for utsøkt respons på STAT3 målrettet terapi i HNSCC.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig.
PTPRD
arrangøren metylering korrelerer med
PTPRD
mRNA uttrykk, men ikke korrelerer med pSTAT3 (Y705) uttrykk i HNSCC. Product: (A)
PTPRD
mRNA uttrykk er ikke signifikant assosiert med pSTAT3 (Y705) uttrykk. n = 172, Pearson r = 0,05157, P = 0,5017, R
2 = 0,002659. (B)
PTPRD
arrangøren metylering korrelerer med
PTPRD
mRNA uttrykk. n = 172, Pearson r = -0,5242, P 0,0001, R
2 = 0,2747. (C)
PTPRD
arrangøren metylering er ikke signifikant assosiert med pSTAT3 (Y705) uttrykk. n = 211, Pearson r = 0,0008795, P = 0,9899, R
2 = 7.735e-007
doi:. 10,1371 /journal.pone.0135750.s001 plakater (TIF)
S2 Fig. MSP analyse av representative tumorprøver HNSCC.
Metylering ble observert i 30/40 (75%) HNSCC tumorer analysert. M betegner primere forsterke denaturert sekvenser, mens U betegner primere forsterke unmethylated sekvenser
doi:. 10,1371 /journal.pone.0135750.s002 plakater (TIF)
S3 Fig.
PTPRD
arrangøren er ikke hyper-metylert i HNSCC svulster sammenlignet med tilstøtende normal slimhinne.
Fem HNSCC svulster og matchet normal slimhinne fra de samme pasientene ble samlet inn og analysert av MSP. M betegner primere forsterke denaturert sekvenser, mens U betegner primere forsterke unmethylated sekvenser
doi:. 10,1371 /journal.pone.0135750.s003 plakater (TIF)
S4 Fig.
PTPRD
er det eneste familiemedlemmet som mutasjon er assosiert med pSTAT3 (Y705) uttrykk i HNSCC.
Whole exome sekvensering og omvendt-fase protein array-data indikerer at ingen andre
PTPR
familie mutasjoner er signifikant assosiert med pSTAT3 (Y705).
