Abstract
Dickkopf-en (DKK1) er en hemmer av Wnt /β-catenin signalveien. Imidlertid er rollen til DKK1 i progresjonen fra ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) ikke fullt ut forstått. I denne studien ble RT-PCR og Western blot anvendes for å undersøke ekspresjon av DKK1 i et panel på ti humane NSCLC-cellelinjer og vev NSCLC. DKK1 uttrykk ble svært transactivated i de aller fleste av disse kreft linjer. Ekspresjon av DKK1 ble oppregulert på både mRNA og proteinnivåene i NSCLC vev sammenlignet med de tilstøtende normale lungevev. Immunhistokjemi og immunofluoresence avslørte at DKK1 er hovedsakelig lokalisert i cytoplasma i begge karsinom vev og cellelinjer. DKK1 protein uttrykk ble også evaluert i parafinsnitt fra 102 pasienter med NSCLC ved immunhistokjemi, og 65 (63,73%) svulster var DKK1 positive. Relativ analyse viste en signifikant sammenheng mellom DKK1 positivt uttrykk og lymfeknutemetastase (
P
0,05). Pasienter med DKK1-positive tumorer hadde dårligere DFS enn de med negative ESCC (5-års DFS, 15,4% versus 27%, p = 0,007). For ytterligere å utforske de biologiske effektene av DKK1 hos NSCLC celler, vi over-uttrykt DKK1 i NSCLC 95C celle ved hjelp av eukaryote ekspresjonsvektor pCMV-Tab-2b og utført en knockdown av DKK1 i LTEP-en-to celle ved hjelp av en kort hårnål RNA ekspresjonsvektor pSilencer 5.1. DKK1 ikke har noen effekt på spredning, men så ut til å spille en rolle i migrasjon og invasjon evne. Overekspresjon av DKK1 fremmer trekkende og invasiv aktivitet av 95C, mens DKK1 knockdown resulterte i undertrykkelse av migrasjons og invasjons potensialer av LTEP-en-2-celle. Samlet utgjør disse resultatene indikerer at DKK1 kan være en avgjørende regulator i utviklingen av NSCLC. DKK1 kan være en potensiell terapeutisk mål i NSCLC
Citation. Li S, Qin X, Guo X, Cui A, Han Y, Wei S, et al. (2013) Dickkopf-en Er onkogene og Involvert i Invasive Vekst i ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 8 (12): e84944. doi: 10,1371 /journal.pone.0084944
Redaktør: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: 26 april 2013; Godkjent: 19 november 2013; Publisert: 31.12.2013
Copyright: © 2013 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ikke småcellet lungekreft (NSCLC) er en av de mest vanlige ondartede sykdommer og forekomsten er økende [1-4]. Til tross for fremskritt i tidlig oppdagelse og forbedringer i behandlingen, langsiktig overlevelse av NSCLC er fortsatt ikke tilfredsstillende. Tumor tilbakefall og metastasering er de viktigste påvirkningsfaktorene prognose. Biomarkører som kan forutsi risikoen for tilbakefall og metastasering er ekstremt presserende. Derfor er det nødvendig å identifisere nye mål som deltar i tumorprogresjon og design passende behandlingsstrategier for NSCLC.
Dickkopf-en (DKK1) er et utskilt protein som er involvert i Wnt signalveien fungerer som en inhibitor. I den konvensjonelle Wnt /β-catenin, binder Wnt-1 proteinet til frizzled reseptor (Fz) og low-density lipoprotein-reseptor-relatert protein-5/6 (LRP5 /6), utløser signaler for spredning via β-catenin [ ,,,0],5,6]. DKK1 binder seg til LRP5 /6 og blokkerer interaksjon med Wnt-1, noe som resulterer i β-catenin nedbrytning og retardasjon av proliferasjon [7-10]. Uttrykket og roller i DKK1 er forskjellig i ulike krefttyper, har nåværende studier har rapportert at overekspresjon av DKK1 finnes i mange ondartede svulster blant annet brystkreft, lungekreft, esophageal karsinomer og leverkreft (HCC) [11-15], noe som indikerer en potensiell onkogene funksjon av DKK1 [16]. På tross av disse studiene, har det lite blitt rapportert om betydningen av DKK1 uttrykk i NSCLC progresjon og prognose.
I denne studien har vi først analysert uttrykket av et panel av humane NSCLC cellelinjer og 102 resected eksemplarer NSCLC, og utforsket sammenhengen mellom DKK1 uttrykk og clinicapathological faktorer. Deretter vi har oppdaget de biologiske effektene av DKK1 om migrasjon og invasjon i dyrkede bukspyttkjertelen carcinoma celler.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble godkjent av de etiske komiteer av Second Hospital of Hebei Medical University og Tianjin Chest Hospital.All deltakerne gitt sitt skriftlige samtykke til å delta i denne studien.
Cell kultivert og transfeksjon
lunge andenocarcinoma cellelinje A549 og lunge stor cellelinje NCI-H460 ble anskaffet fra ATCC. De lunge andenocarcinoma cellelinjer SPC-A-1, LTEP-en-2, GLC82 A2 og PC-9; lunge squamous cellelinjer YTMLC-9 og lunge store cellelinjer 95C, 95D er begavet fra Tianjin lungekreft institutt [14]. Cellene ble dyrket i RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) medium inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS, GIBCO), 100 IU /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin holdt ved 37 ° C i fuktet luft som inneholdt 5% CO
2.
Cellene ble dyrket til 80% samløpet og transfektert med saman eukaryote vektor og tom vektor bruker Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA, USA) i henhold til produsentens anbefaling.
Pasientprøver
i denne studien ble 102 pasienter formalinfiksert NSCLC vevsprøver brukes for immunhistokjemi flekker som ble hentet fra andre sykehus i Hebei Medical University. Ti pasienter friske vev inkludert primær NSCLC og matchet tilstøtende normalt vev ble oppnådd fra Tianjin Chest Hospital. Alle vev ble lagret i flytende nitrogen før bruk. Vevsprøver ble slipt i flytende nitrogen for å isolere total RNA og protein.
Plasmid bygging
Den eukaryote ekspresjonsvektor pCMV-Tag-2b (Invetrogen) ble rekonstruert til å uttrykke DKK1. 815 basepar lang DKK1 sekvens (NM: 012242,2) inkludert
EcoRI
og
BamHI
restriksjonsenzymseter ble forsterket fra genomisk DNA. Primersekvensene var: Videre 5′-TGGATCCATGATGGCTCTGGGCGCAGCGGGAG-3 «, omvendt: 5′-CGAATTCTTAGTGTCTCTGACAAGTGTGAAGCCTAGAAG-3». Det PCR-amplifiserte produkt ble subklonet inn i pCMV-Tag-2b vektor. Rekombinant vektor ble betegnet som pCMV-Tag-2b-DKK1. Knockdown-vektoren ble konstruert ved anvendelse av en eukaryot ekspresjonsvektor pSilencer 5,1 (Ambion). Målsekvensen av DKK1 gen var 5′-AATAAGTACCAGACCATTGAC-3 «, og den resulterende vektor ble betegnet som pSilencer-DKK1. Den negative kontrollsekvens var 5»-CTACCGTTGTTATAGGTG-3 «. Den negative kontroll siRNA plasmid (pSilencer-NC) koder for et siRNA, som ikke har noen signifikant sekvenslikhet til humane gensekvenser. Alle bygge sekvenser ble utformet i henhold til Ambion online siRNA Target Finder. Sekvensanalyse ble utført for å verifisere resulterte vektorer.
Western blotting
Western blot ble utført for å påvise uttrykk for DKK1 i resected NSCLC prøver og NSCLC cellelinjer. Frosset NSCLC-prøver ble slipt i flytende nitrogen; cellelinjer ble dyrket til 80% konfluens og høstet. Vevsprøver og celler ble lysert i RIPA-lyseringsbuffer (fosfat-buffret saltvann inneholdende 1% Triton X-100 og 1 nM PMSF) ved 4 ° C i 30 minutter og sentrifugert ved 12,000rpm i 15 min. Proteinkonsentrasjonen ble kvantifisert ved hjelp av BCA-proteinanalyse (Pierce, Rockford, IL). Like mengder protein ble lastet og electrophoreses i en 10% SDS-PAGE-gel, som deretter ble overført til nitrocellulose (NC) membran. Membranen ble inkubert i 60 minutter i PBS inneholdende 0,1% Tween-20 og 5% skummet melk for å blokkere ikke-spesifikk binding; Dette ble etterfulgt av inkubasjon ved 4 ° C med anti-human DKK1 kanin polyklonalt antistoff (Life, WA, USA, 1: 500 fortynninger). Membranen ble vasket tre ganger i 10 minutter i PBS med 0,1% Tween-20 og så inkubert i 1 time med HRP-konjugert bovin-anti-kanin (1: 5000 fortynninger) sekundært antistoff (BOOSTER Bioteknologi, Wuhan, Kina) ved omgivelses temperatur. De immumoreactive proteiner ble deretter oppdaget ved hjelp av ECL underlaget følge produsentens anbefaling. β-aktin ble benyttet som et endogent protein for normalisering. IPP bildeanalyse programvare ble brukt for kvantifisering.
RT-PCR og real-time PCR
For analyse av DKK1 uttrykk i NSCLC celler, total RNA ble isolert med Trizol. Lik mRNA fra hver prøve ble reverstranskribert til cDNA ved anvendelse av tilfeldig-primer. GAPDH ble benyttet som intern kontroll, ble PCR-reaksjoner utført ved å bruke de følgende primere: DKK1, Forward 5′-CAACGCTATCAAGAACCTGC-3 «, revers 5′-GATCTTGGACCAGAAGTGTC-3′; GAPDH, Forward 5»-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3 «, Omvendt 5′-TGGXGTGTGAACCACGAGAA-3». PCR ble optimalisert for det antall sykluser for å sikre produktets styrke for å være innenfor den lineære fase av amplifikasjon ble PCR-produktene deretter analysert ved elektroforese i 2% agarose-gel.
Sanntids-PCR ble utført ved anvendelse av SYBR
® Grønn (Kode DRR041A, Takara) i et totalvolum på 30 ul i løpet av en to-trinns syklus ved hjelp av følgende temperatur-protokollen: 10 sek ved 95 ° C etterfulgt av 42 sykluser på 95 ° C i 15 s og 55 ° C for 30-årene. Reaksjonene ble plassert i en 96-brønns plate (ABI) ved anvendelse av en forvarmet sanntids instrument (ABI 7500HT). De relative nivåer av uttrykk ble kvantifisert og analysert ved hjelp av Bio-Rad iCycler iQ programvare. Tre uavhengige eksperimenter ble utført for å analysere relative genekspresjon, og hver prøve ble testet i tre eksemplarer. Ct-verdiene ble anvendt for å beregne ekspresjon av mRNA-nivåer. Den mengden av target-genekspresjon (2-Ct) ble normalisert ved hjelp av den endogene GAPDH referanse, ble mengden av mål-genet i kontrollprøven angitt som kalibratoren ved 1,0. Primer sekvenser for real-time PCR ble oppført i tabell S1.
spredningsanalyse
MTT analysen ble brukt til å analysere cellevekst. Etter 24 timer av transfeksjon ble cellene sådd ut i 96-brønns plate ved 5,0 x 10
3 celler /ml og dyrket i henholdsvis 24 timer, 48 h, 72h og 96h. På hvert tidspunkt ble 10 ul MTT-reagens (5 mg /ml, Sigma) tilsatt til hver brønn, og inkubert i 4 timer ved 37 ° C. 200 ul DMSO (Invitrogen) ble tilsatt for å oppløse formazankrystaller i 30 minutter etter kassering av supernatanten. Spektrofotometrisk absorbans ble målt ved en bølgelengde på 490 nm på mikroplateleser (Spectra Max M5, MD, USA). For å sikre at resultatene hver prøve ble testet i tre eksemplarer, og alle forsøk ble utført tre ganger.
Sårtilheling analysen
migrasjon evne ble bestemt ved bruk sårhelende analysen. Ekvivalente celler ble sådd ut i 12-brønners plater uten antibiotika. Etter 24 timer av transfeksjon ble celler såret med en steril plast 100 ul mikropipette spissen, og det flytende avfall ble vasket med PBS, og dyrket i serumfritt medium. Bredden av såret ble målt ved ulike tidspunkt. 3-4 forskjellige steder ble visualisert og fotografert under et fasekontrast invertert mikroskop (40 × objektiv, TE2000-E, Nikon, Japan).
Boyden kammeret analysen
Boyden kammeret analysen ble brukt å undersøke celle invasjon evne. Celler ble transfektert med lipofectmine 2000. Etter 16 timer ble cellene trypsinisert og resuspendert. 5,0 x 10
4 celler i 300 ul RPMI-1640 medium ble plassert i det øvre kammeret (porestørrelse 8-um, BD Biosciences). De nedre kamre ble fylt med 500 pl komplett medium med 10% FBS. Etter inkubasjon i 48 timer ved 37 ° C ble cellene på den øvre overflaten av filteret fjernet med en bomullspinne. Vandrende celler på den nedre overflate av innsatsene ble fiksert og farget med 0,1% krystallfiolett i 30 min ved 37 ° C og vasket to ganger med PBS. De fargede cellene ble deretter visualisert under et mikroskop og celle nummer ble regnet i fem tilfeldige felt (forstørrelser 100 ×). Boyden kammeret ble gjennomført i to eksemplarer i to separate eksperimenter.
Immunohistochemistry og immunofluoresence
For å undersøke status for DKK1 protein i kliniske NSCLC prøvene som hadde blitt forankret i parafinblokker, ble IHC farging utført i henhold til følgende prosedyre. Parafinsnitt ble deparaffinized med xylen og rehydrert i graderte etanol løsninger. Aktivitet av endogen peroksidase ble blokkert med 3% H
2o
2 i 15 min ved romtemperatur og deretter ble seksjonene oppvarmet med 0,01 M sitrat (pH = 6,0) ved 95 ° C i 15 minutter i mikrobølgeovnen for antigen gjenfinning . Etter inkubasjon med anti-DKK1 kanin polyklonalt antistoff (ab22827, Abcam Inc, Cambridge, MA, fortynning 1: 200) i 2 timer ved romtemperatur, negative kontroller uten det primære antistoff. Snittene ble inkubert med HRP-merket anti-kanin-IgG sekundært antistoff. Intensiteten av DKK1 farging ble evaluert ved bruk av følgende kriterier [12,14]: sterkt positiv (2+), mørkebrun farging 50% av tumorcellene i cytoplasma; svakt positiv (1+), noen mindre grad av brune flekker i tumorceller; fraværende (scoret som 0), immunoreaktivt til DKK1 10% eller mindre av tumorcellene. Poengene ble vurdert av to patologer uten å vite det clinicopathological dataene.
TE13-celler ble dyrket på dekkglass, som deretter ble fiksert med 4% paraformaldehyd og permeabiliserte med 0,2% Triton X-100 i PBS i 10 min ved værelses temperatur. Cellene ble deretter blokkert med 3% BSA i 30 minutter ved romtemperatur, og deretter inkubert med primære antistoffer fortynnet i PBS inneholdende 3% BSA i 60 min ved romtemperatur. Etter å ha blitt vasket med PBS, ble cellene farget med FITC-konjugert sekundært antistoff (Santa Cruz Biotechnology) i 30 minutter ved 37 ° C. Til slutt, ble objektglassene vasket med PBS og kjerner ble montert med DAPI og visualisert med konfokal laser scanning mikroskop.
Statistical Analysis
Statistisk analyse ble utført med SPSS 10,0 programvare. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD. T-test og enveis variansanalyse ble benyttet. Relasjoner mellom variabler gruppert ble analysert ved hjelp av chi-kvadrat test. Overlevelseskurver ble fremstilt i henhold til metoden beskrevet av Kaplan og Meier. Forskjeller mellom kurvene ble beregnet med log-rank tester. P-verdier og 0,05 ble betraktet som signifikant. Alle forsøkene ble utført i hvert fall i tre paralleller [15].
Resultater
DKK1 uttrykk i dyrkede humane NSCLC-cellelinjer
uttrykk for DKK1 ble preget i en rekke av menneskelig NSCLC-cellelinjer. DKK1 protein kunne påvises i alle cellelinjer (figur 1). Høyere ekspresjon ble observert i LTEP-a-2 og GLC-82 cellelinjer. Lavere ekspresjon ble observert i A2 og 95C kreftcellelinjer. DKK1 mRNA-ekspresjon ble også undersøkt ved hjelp av RT-PCR, resultatene var i samsvar med resultatene av Western blot (Figur 1. B). Den subcellulære lokalisering av DKK1 ekspresjon i NSCLC-cellelinjen ble definert ved immunfluorescerende farging. Resultatene viste at DKK1 ekspresjon ble for det meste distribuert i cytoplasma med et granulært utseende (figur 1. C).
(A) Uttrykk for DKK1 på mRNA nivå (RT-PCR: 28 sykluser av forsterkning). GAPDH mRNA ble benyttet som intern kontroll. (B) Uttrykk for DKK1 på proteinnivå. β-aktin ble benyttet som intern kontroll. (C) subcellulær lokalisering av endogent DKK1 protein i NSCLC celle. DKK1, beiset med rhodamin B, var i cytoplasma av cellen som vises finkornet materiale. Cellekjernen dukket opp som blå fluorescens farget med DAPI (forstørrelse 100 ×).
DKK1 Expression hos NSCLC vev
For å undersøke uttrykket av DKK1 protein i NSCLC ble 102 NSCLC pasienter parafinsnitt vurdert av immunhistokjemisk analyse. Av disse var 46 (45,1%) viste en sterk positiv DKK1 ekspresjon, hovedsakelig i cytoplasma av tumorceller, med mørk brun granulær fordeling. 19 (18,63%) prøver var svakt positive uttrykk med bleke gule partikler. mens de resterende 37 (36,27%) var negative. Den totale frekvensen av positiv farging var 63,73%. I motsetning til dette ingen av normal epitel viste betydelig grad av immunhistokjemisk farging (figur 2A). Vi analyserte videre sammenhengen mellom DKK1 uttrykk og clinicopathological parametre; Det er interessant å merke seg at de positive uttrykk for DKK1 ble i hovedsak fulgt med lymfeknuter metastaser (tabell 1). Den totale fem års sykdomsfri overlevelse (5-års DFS) frekvensen av pasienter med DKK1-negative var 27%, mens pasienter med DKK1-positive svulster viste dårligere DFS enn de med negative tumorer (5-års DFS, 15,4% versus 27%, P = 0,007) (figur S1). Disse resultatene indikerer at DKK1 overekspresjon er en hyppig hendelse i human NSCLC, som kan ha en potensiell forhold til metastasering av NSCLC.
(A) Expression ved immunhistokjemisk farging. DKK1 sterk positiv uttrykk i lungekreft viser flekker hovedsakelig i cytoplasma av tumorceller (forstørrelse 100 ×). Representant DKK1 svak positiv lungekreft med bleke gule partikler i tumorceller (forstørrelse 100 ×). DKK1 negativ lungekreft celle viser nesten ingen merkbar farging av tumorceller (forstørrelse 100 x). Normal lungevev uten flekker. (B) Uttrykk for DKK1 mRNA hos NSCLC vev og matchet normal lunge vev. (C) Expression of DKK1 protein i NSCLC vev og matchet normal lunge vev. N, Normal vev; T, Tumor vev. Positive uttrykk for DKK1 ble i hovedsak fulgt med lymfeknuter metastaser.
Parametere
n
DKK1 uttrykk
χ
2
P
value
Positive(%)
Negative(%)
Age(years) 606439(60.9%)25(39.1%)0.5780.2940 ≥603826 (68,4%) 12 (31,6%) GenderMale8151 (63,0%) 30 (37,0%) 0.0990.4820 Female2114 (66,7%) 7 (33,3%) DifferentiationWell3221 (65,6%) 11 (34,4%) 0.0640.8003
*
Moderate4327 (62,8%) 16 (37,2%) Poor2717 (63,0%) 10 (37,0%) TT1117 (63,6%) 4 (36,4%) 0.12130.7276
**
T23623(63.9%)13(36.1%)T31824(66.7%)12(33.3%)T41911(57.9%)8(42.1%)N(Metastasis)Positive(N1+N2)5447(87.0%)7(13.0%)26.9760.0000 Negativ (N0) 4818 (37,5%) 30 (62,5%) Tabell 1. Sammenheng mellom DKK1 og ulike clinicopathological parametere
*
Vel gruppe vs moderat;
**
T3 vs T4.
CSV ned CSV
neste observert uttrykk for DKK1 i kirurgisk resected NSCLC vev og matchet normalt vev. Blant 10 tilfeller av NSCLC, 7 viste signifikant oppregulert ekspresjon av DKK1 mRNA i kreftvevet sammenlignet med tilsvarende normale vev (figur 2B). Western blot resultatene viste samme tendens på DKK1 proteinnivå (figur 2C).
Effekt av DKK1 overekspresjon om migrasjon og invasjon i 95C
For å teste biologiske rolle DKK1 i NSCLC celle, vi undersøkte konsekvens av overekspresjon av DKK1 på cellemigrering og invasjon evne i 95C cellelinje som faktisk har et meget lavt nivå av endogen DKK1. Eukaryote ekspresjonsvektor pCMV-Tag-2b-DKK1 ble konstruert for å overuttrykker genet DKK1. En betydelig økning i nivåene av både DKK1 protein og mRNA ble observert i 95C-cellelinje transfektert med pCMV-Tag-2b-DKK1 sammenlignet med blank kontroll og negativ kontroll (figur 3 A). Deretter ble MTT-analysen viste at overekspresjon av DKK1 ikke endret celleproliferasjon evne (data ikke vist). Men migrasjonen evnen til ble markedsført i den til sårheling analysen (figur 3 B, C). Boyden kammer ble brukt til å teste invasivitet, ble 95C celle transfektert med enten pCMV-Tag-2b-DKK1 eller pCMV-Tag-2b, og blank kontrollgruppe ble lagt transfeksjon reagens uten plasmid. Etter 18 timer transfeksjon ble cellene sådd på nytt på toppen av innsatsen. Celler som invaderte gjennom barrieren og nådd den andre siden av kammeret innskuddet ble registrert etter 48 timer inkubering. Boyden kammer Resultatene viste at de cellene som passerte gjennom membranen i pCMV-Tag-2b-DKK1 gruppe var høyere enn de to andre gruppene (figur 3. D). Disse observasjonene indikerer at overekspresjon av DKK1 betydelig grad kan fremme invasjon evnen til 95C celler (figur 3. E).
(A) RT-PCR og Western blot-analyse av den DKK1 uttrykket. DKK1 nivå i 95C celle transfektert med pCMV-Tag-2b-DKK1 er betydelig høyere enn den i pCMV-Tag-2b og blank kontrollgruppe. (B) De sårede og helbredende 95C celler. (C) Måling av migrasjon avstand (*
P
0,05). (D) Invasjonen evne 95C transfektert med pCMV-Tag-2b-DKK1 ble betydelig forbedret. (E) Antallet celler som migrerer gjennom Matrigel-belagte filtre ble statistisk analysert. Analysene ble utført i tre eksemplarer brønner (*
P
0,01).
knockdown av endogen DKK1 av siRNA redusert migrasjon og invasjon i LTEP-a-2
Vi har analysert virkningene av DKK1 knockdown om migrasjon og invasjon i LTEP-en-to cellelinje . For å bestemme knockdown effekten av shRNA, det DKK1expression nivå i LTEP-en-2-cellelinjer ble undersøkt ved både RT-PCR og Western blot. Den spesifikke siRNA effektivt reduseres den endogene ekspresjon av DKK1 i cellene som var transfektert med pSilencer-DKK1 sammenlignet med de celler som ble transfektert med pSilencer-NC-vektoren (figur 4. A).
(A) RT- PCR og Western blot-analyse av den DKK1 uttrykket. DKK1 nivå i LTEP-en-2-celle transfektert med pSilencer-DKK1 er betydelig lavere enn den i pSilencer-NC og blank kontrollgruppe. (B) De sårede og helbredende LTEP-a-2 celler. (C) Måling av migrasjon avstand (*
P
0,05). (D) Den invasjonen evne LTEP-en-2-transfektert med pSilencer-DKK1 ble betydelig undertrykt. (E) Antallet celler som migrerer gjennom Matrigel-belagte filtre ble statistisk analysert. Analysene ble utført i tre eksemplarer brønner (*
P
0,01).
knockdown av endogen DKK1 av siRNA påvirket ikke LTEP-en-to spredning (data ikke vist) men betydelig undertrykt migrasjon evne i sårheling assay. Migrasjonen frekvensen av pSilencer-DKK1 celler i sårheling var signifikant lavere etter transfeksjon 48h enn den for pSilencer-NC og blank kontrollgruppe (Figur 4. B, C). Når dyrket i Boyden kammer, ble antallet celler som migrerte gjennom Matrigel-belagte porøse filtere betydelig redusert i DKK1 knockdown pSilencer-DKK1-celler sammenlignet med pSilencer-NC og blank kontrollgruppe (Figur 4. D, E).
overuttrykte DKK1 endret forbundet gener uttrykk
for å utforske mekanisme DKK1 i kreft progresjon lunge, ble real-time PCR utføres for å påvise effekten av DKK1 overekspresjon på uttrykk for relative gener involvert i kreftutvikling. Overekspresjon av DKK1 endret ikke uttrykk for cellesyklusen relatert protein cyclinD1 og apoptose relaterte proteiner BCL-2 og Box. Akt-1 assosiert med signalveien var minimal oppregulert i 95C celle transfektert med pCMV-Tag2b-DKK1. Ekspresjonen av MMP2 og VEGFC i 95C celle transfektert med pCMV-Tag2b-DKK1 ble økt 7,78 ganger og 2,13 ganger sammenlignet med kontroll 95C-celler (Tabell S2).
diskusjon
familien til menneske DKK proteiner er sammensatt av DKK1, DKK-2, DKK-3, DKK-4 og en unik DKK3-relatert protein, kalt Soggy [17]. DKK1, som koder for et utskilt protein, er en antagonist av Wnt /β-catenin signalering som er involvert i tumorprogresjon [13,18-22]. DKK1 er uttrykt i mange humane kreftformer; det kan spille forskjellige biologiske roller i tumorceller avhengig av hvilken celletype som er involvert. DKK1 er oppregulert i noen typer humane tumorer inkludert NSCLC, leverkreft, bukspyttkjertelkreft [12,14,19,23]. Det virket som DKK1 kan spille viktige roller under utviklingen av disse typer svulster, men de biologiske effektene av DKK1 i NSCLC er ikke avklart. I dette studiet bekreftet vi at DKK1 er uttrykt i et panel av NSCLC-cellelinjer. Immunoflouresence viste at DKK1 subcellulære plassering uttrykk ble hovedsakelig distribuert i cytoplasma av NSCLC celler. IHC studie av DKK1 uttrykk i 102 NSCLC eksemplarer seksjoner avslørte at den positive uttrykk for DKK1 er korrelert med lymfeknuter metastaser; det kan være en prediktor for kreft metastasering. Med hensyn til prognose, positivt uttrykk for DKK1 protein korrelert med en forferdelig kamp 5-års overlevelse. DKK1 er oppregulert i NSCLC vev sammenlignet med matchede normalt vev. Slik at det er mulig at DKK1 er involvert i utviklingen av NSCLC.
DKK1 er et utskilt protein som inneholder en signal peptidsekvens og to cysteinrike domener og fungerer som en negativ regulator av Wnt signale [6, 7]. I tillegg ble DKK1 rapportert å være en nedstrøms mål for β-catenin /T-celle-faktor, og deltar i en negativ tilbakekoblingssløyfe i den Wnt signalisering i colon cancerceller [24,25]. Studier har indikert at overekspresjon av DKK1 var assosiert med dårlig prognose [14,19,21], mens lite er kjent om funksjonen til DKK1 i NSCLC. For ytterligere å studere biologiske effekter av DKK1 i ivtro, for det første, bekreftet vi at overekspresjon av DKK1 fremmer migrasjon og invasjon i human NSCLC cellelinje 95C. I mellomtiden, overekspresjon av DKK1 oppregulert uttrykk for metastaserelaterte proteiner, men den detaljerte mekanisme må være videre studier. Videre bruker eukaryote uttrykk for DKK1 shRNA, viste vi at knockdown av DKK1 undertrykker migrasjon og invasjon av NSCLC cellelinje LTEP-a-2.Den Resultatene tyder på at DKK1 kan ha en positiv rolle i utviklingen av NSCLC, men mekanismen involvert i invasjonen trenger videre studier.
Men noen studier har rapportert at DKK1 undertrykker cellevekst og migrasjon [16,26] som antyder at det kan være andre roller DKK1 i Wnt /β-catenin signalering. DKK1 kan spille ulike biologiske roller i ulike typer kreftceller. En retrospektiv analyse av DKK1 uttrykk viste at DKK1 ble endret under PCa progresjon [27]. Så langt har bare noen få studier blitt rapportert om rollene til DKK1 i NSCLC, med hovedvekt diagnose og prognose verdier [12,21,28-30]. Rollen DKK1 i NSCLC, virkningsmekanismen funksjon og kliniske aspekter må videre studier.
I sammendraget, selv om den detaljerte funksjon DKK1 i NSCLC progresjon ikke er godt avklart, tyder våre resultater de potensielle roller DKK1 i markedsføringen av migrasjon og invasiv vekst hos NSCLC cellelinjer, og at det kunne tjene som en roman terapeutisk mål for NSCLC.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Sykdomsfri overlevelse kurven klassifisert i henhold til DKK1 uttrykk for alle pasienter er plottet med Kaplan-Meier metoder.
doi: 10,1371 /journal.pone.0084944.s001 plakater (TIF)
Tabell S1.
Primere sekvens brukes for real-time PCR.
doi: 10,1371 /journal.pone.0084944.s002 plakater (DOC)
Tabell S2.
differencial uttrykket av gener i 95C transfektert med pCMV-Tag2b-DKK1 forhold til 95C transfektert med pCMV-Tag2b.
doi: 10,1371 /journal.pone.0084944.s003 plakater (DOC)
