Abstract
gaffelhodeboks M1 (FoxM1) onkogene transkripsjonsfaktor representerer en attraktiv terapeutisk mål i kampen mot kreft, fordi det er overuttrykt i et flertall av humane tumorer. Nylig, ved bruk av et cellebasert assay system vi identifisert tiazol antibiotikum Siomycin A som en inhibitor av FoxM1 transkripsjonen aktivitet. Her rapporterer vi at strukturelt ligner thiazole antibiotika, Thiostrepton også hemmer transkripsjonen aktivitet av FoxM1. Videre fant vi at disse thiopeptides ikke hemme transkripsjonen aktivitet av andre medlemmer av gaffelhode familie eller noen ikke-relaterte transkripsjonsfaktorer. Ytterligere eksperimenter viste at tiazol antibiotika også hemme FoxM1 uttrykk, men ikke ekspresjonen av andre medlemmer av gaffelhodefamilien boksen. I tillegg fant vi at tiazol antibiotika effektivt hemmet veksten og induserte potent apoptose i humane kreftcellelinjer av ulik opprinnelse. Tiopeptid-indusert apoptose korrelert med undertrykkelse av FoxM1 uttrykk, mens overekspresjon av FoxM1 delvis beskyttet kreftceller fra tiazol antibiotika-mediert celledød. Disse dataene antyder at Siomycin A og Thiostrepton kan spesifikt mål FoxM1 å indusere apoptose i kreftceller og FoxM1 hemmere /tiazol antibiotika muligens kunne være utviklet som nye kreftmedisiner mot menneske neoplasi
Citation. Bhat UG, Halasi M, Gartel AL (2009) thiazole Antibiotika Target FoxM1 og indusere apoptose i humane kreftceller. PLoS ONE 4 (5): e5592. doi: 10,1371 /journal.pone.0005592
Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Ordway Research Institute, USA
mottatt: 20 mars 2009; Godkjent: 14 april 2009; Publisert: 18 mai 2009
Copyright: © 2009 Bhat et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd 1RO1CA1294414-01A1 og 1R21CA134615-01 og IDPH billett til Cure stipend til ALG. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
gaffelhodeboks M1 (FoxM1) [1], en transkripsjonsfaktor av gaffelhodefamilien [2] er en av de viktigste positive regulatorer av cellesyklusen. Både uttrykket og den transkripsjonelle aktivitet av FoxM1 er forbundet med proliferativ tilstand av celler [1]. Den uttrykkes i alle embryonale vev og i prolifererende celler av epitelial og mesenchymal opprinnelse [3], [4]. FoxM1 spiller en rolle i utviklingen av nervesystemet [5], og det er nødvendig for hepatoblast differensiering mot galle epiteliale celleslektsnavn [6] og for embryoutvikling av den pulmonale vaskulatur [7]. FoxM1 uttrykk er også indusert under vev regenerering og reparasjon lunge og lever. Den transkripsjonelle aktivitet av FoxM1 avhenger av onkogene Ras-MAPK og sonic hedgehog trasé [8], [9]. FoxM1 transkripsjonelt oppregulerer målgener som er involvert i cellesyklusprogresjon, og det er avgjørende for G1 /S og G2 /M overgang, og også for utførelsen av den mitotiske programmet fordi FoxM1-uttømte celler mislykkes i å fremme utover prophase fasen av mitosen [10] .
Mens FoxM1 er en av de mest overuttrykte gener i menneske solide tumorer (anmeldt i [11], [12]), er dens uttrykk slått av i terminalt differensiert, ikke-delende celler [1]. FoxM1 er overuttrykt i levercellekarsinom [13], bukspyttkjertelen karsinom [14], brystkreft [15], [16], ikke-småcellet karsinom [17], anaplastiske astrocytomas og glioblastomas [18], basalcellekreft [9] og intrahepatiske cholangiocarcinomas [19]. Siden funksjonen av FoxM1 hemmes av flere tumor dempere, så som p19-ARF, pRb, p16 og p53 og aktivert av flere onkogene signaliseringsreaksjonsveier, kan FoxM1 bli klassifisert som et proto-onkogen. Inhibering av FoxM1 ekspresjon av små interfererende RNA [20], [21], eller av et peptid inneholdende aminosyrer 24-46 av p19
ARF [22], [23] redusert forankringsuavhengig cellevekst in vitro og forsinket levertumor vekst hos mus. Tilsvarende, undertrykkelse av FoxM1 i bukspyttkjertelcancerceller hos RNA-interferens førte til inhibering av metastatisk potensiale [24]. Disse studiene har vist at FoxM1 er viktig for kreftcelle levedyktighet og dens hemming kan hindre utvikling av kreft, noe som tyder på at målretting FoxM1 av små molekyler kan representere en ny strategi for å utvikle nye legemidler mot kreft [25], [26], [27] , [28].
Tidligere, ved hjelp av et celle-basert screening system som er utviklet av vårt laboratorium har vi identifisert en tiopeptid, Siomycin A (NSC-285116) som en potent inhibitor av FoxM1 [25]. I tillegg viste vi at Siomycin A og en annen lignende tiazol antibiotikum, tiostrepton, som allerede har blitt godkjent av FDA for bruk av dyr, hemmer FoxM1 og indusere apoptose i melanomceller [26], [29]. Her viste vi at tiazol antibiotika, Siomycin A og Thiostrepton hemme FoxM1 transkripsjonen aktivitet og uttrykk. Vi har også funnet direkte sammenheng mellom suppresjon av FoxM1 ekspresjon og induksjon av apoptose av thiopeptides i forskjellige humane kreftcellelinjer. Videre etablerte vi at FoxM1 kunne beskytte mot celledød indusert av tiazol antibiotika, noe som tyder på at disse stoffene kan delvis utøve sin anticancer aktivitet via undertrykkelse av FoxM1.
Resultater
Nylig har vi innhentet bevis på at en annen tiazol antibiotikum, tiostrepton, som strukturelt skiller seg fra Siomycin A av bare to rester (fig. 1A) i besittelse av anti-kreft [30] og anti-FoxM1 egenskaper [29] lik Siomycin A. for å evaluere effekten av tiostrepton videre FoxM1 transkripsjonen aktivitet og også å studere hvordan tiazol antibiotika påvirke transkripsjonen aktivitet av andre medlemmer av gaffelhode familien, har vi utviklet C3-Luc2.3-FoxO1 cellelinje. C3-Luc2.3-FoxO1 celler er et derivat av U2OS osteosarkom celler med en doksycyklin-induserbar FoxM1-GFP fusjonsprotein [25], en tamoxifen-induserbar konstitutivt aktiv FoxO1 (AAA) -er fusjonsprotein og et FoxM1 /FoxO1 avhengig ildflue luciferase. I dette system var vi i stand til selektivt å indusere enten FoxM1 transkripsjonen aktivitet ved tilsetning av doksycyklin eller FoxO1 transkripsjonen aktivitet ved tilsetning av tamoxifen. Først, for å teste hvordan tiostrepton påvirker FoxM1 transkripsjonen aktivitet i forhold til Siomycin A, ble cellene behandlet med en kombinasjon av doksycyklin og tiazol antibiotika og 16 timer senere luciferaseaktiviteten ble målt. Vi har funnet at undertrykkelse av FoxM1 transkripsjonen aktivitet av tiostrepton er sammenlignbar med Siomycin A (fig. 1B), noe som indikerer at begge tiazol antibiotika hemmer FoxM1 transkripsjonen aktivitet. Deretter for å fastslå om tiazol antibiotika inhibere transkripsjonen aktivitet av andre gaffelhodefamiliemedlemmer, for eksempel FoxO1 [31], vi behandlet C3-Luc2.3-FoxO1 cellelinje med en kombinasjon av tamoksifen og thiopeptides. Vi har funnet at tilsetning av tamoxifen førte til induksjon av FoxO1 avhengig luciferase-aktivitet, men behandlingen med tiazol antibiotika ikke redusere denne verdien (Fig. 1B). Ettersom alle medlemmer av gaffelhode familien dele et konservert gaffelhode /winged-helix DNA-bindende domene som er ansvarlig for binding til konsensus nettsteder, våre data tyder på at thiopeptides ikke målrette dette domenet, og de kan ha negativ regulere bare FoxM1, men ikke andre gaffelhodefamiliemedlemmer
(A) den kjemiske strukturen til tiazol antibiotikum, tiostrepton som skiller seg fra A Siomycin av bare to rester (Thiostrepton-R1-R2:. isoleucin-alanin; Siomycin- R1-R2: valine- dehydroalanin). (B) luciferase-analyser etter behandling av de C3-Luc2.3-FoxO1 cellelinje med en kombinasjon av enten 1 pg /ml doksycyklin (Doxy) eller 300 nM tamoxifen (Tam) og 3 uM av Siomycin A (SiO) eller (tiostrepton tio), henholdsvis avslørte at tiostrepton er også en negativ regulator av FoxM1 transkripsjonen aktivitet og tiazol antibiotika hemmer FoxM1 transkripsjonelle aktivitet blant de gaffelhodefamiliemedlemmer. (C) thiazole antibiotika downregulated FoxM1 protein nivåer, men ikke FoxA1, FoxO1 og FoxO3a nivåer som oppdaget av immunblotting. (D) HCT116-p53RE-Luc cellelinje som stabilt uttrykker ildflue luciferase under kontroll av multiple p53 responselementer som ble behandlet med den angitte konsentrasjon av Siomycin A eller tiostrepton. Etter over natten behandling luciferaseaktiviteten ble målt. (E) SW480 kolon cancer-cellelinjen ble transient transfektert med TCF /Lef avhengig TOPFlash og kontroll FOPFlash-konstruksjonene. Tjuefire timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med 3 uM av Siomycin A eller tiostrepton. Den neste dag luciferaseaktiviteten ble målt. (F) A549 lungekreftceller ble transient transfektert med GLI-avhengige GLIBS-Luc, kontroll miniTK reporter-konstruksjoner og GLI ekspresjonsplasmidet. Celler ble behandlet med den angitte konsentrasjon av thiopeptides 24 timer etter transfeksjon og luciferase-aktiviteten ble målt på følgende dag. Barer i B, D-F er representative gjennomsnittsverdier av tredoble eksperimenter +/- SD.
I våre tidligere rapporter har vi funnet uventet at Siomycin A ikke bare downregulated FoxM1 transkripsjonen aktivitet, men det er også redusert mRNA og proteinnivåer av FoxM1 [25], [29]. I denne studien demonstrerte vi at tiostrepton nedregulerer også FoxM1 proteinnivåer i en tilsvarende grad Siomycin A (Fig. 1C). I tillegg fant vi at tiazol antibiotika ikke redusere protein nivåer av andre medlemmer av gaffelhode familien som FoxA1, FoxO1 og FoxO3a (Fig. 1C), ytterligere støtte ideen om at tiazol antibiotika Siomycin A og Thiostrepton er spesifikke hemmere av FoxM1. For ytterligere å undersøke potensialet spesifisiteten av antibiotika for FoxM1 avhengig transkripsjon, testet vi hvordan Siomycin A og tiostrepton påvirke transkripsjonen aktivitet av andre transkripsjonsfaktorer slik som p53, Tcf /Lef og GLI. Til dette formål, HCT116-p53RE-Luc cellelinje (med vill-type p53 og flere p53 responselementer oppstrøms for luciferasegenet), SW480 kolon kreftcellelinje (transient transfektert med TCF /Lef avhengig TOPFlash konstruere [32] , en gave fra Dr. Randall Moon) og A549 lungekreftceller (transient transfektert med GLI avhengige GLIBS-Luc reporter konstruere og GLI ekspresjonsplasmidet, gaver fra Dr. David Robbins) ble behandlet med Siomycin A eller Thiostrepton og luciferase -aktiviteten ble målt 16 timer etter behandling. Vi fant at behandling med antibiotika ikke redusere p53, Tcf /Lef eller GLI- avhengig transkripsjon (Fig. 1D-F). Men våre videre eksperimenter viste at tiazol antibiotika påvirker også NF-kB aktivitet, men ikke aktiviteten til andre studerte transkripsjonsfaktorer (data ikke vist).
For å vurdere anticancer potensialet i tiazol antibiotika vi analysert deres effekter på humane kreftcellelinjer av ulik opprinnelse som hadde forhøyet uttrykk nivå FoxM1. Først undersøkte vi hvorvidt den ytre eller indre apoptotisk reaksjonsvei er involvert i den tiopeptid-indusert apoptose. Vi behandlet caspase-8 mangelfulle og utblandede NB7 neuroblastom cellelinjer med antibiotika for 24 timer (Fig. 2A). Vi har funnet at caspase-8 manglende NB7 celler som ikke kan gjennomgå apoptose extrinsic var nesten like følsomme overfor thiopeptides som rekonstituerte NB7 celler med aktiv caspase-8, noe som tyder på at den tiopeptid-indusert apoptose innebærer i hovedsak den indre apoptotiske reaksjonsvei.
(A) Behandling av caspase-8 mangelfulle og utblandede NB7 neuroblastom cellelinjer med tiazol antibiotika avdekket at tiopeptid-indusert apoptose innebærer i hovedsak den indre apoptotiske sti. (B) Leukemi kreft cellelinjer CEM [IC
50 /iM: Sio-0,73 (0,08); Tio-1,47 (0,1)], HL60 [IC
50 /iM: Sio-0,68 (0,06); Tio-1,78 (0,4)], og U937 [IC
50 /iM: Sio-0,53 (0,1); Tio-0,73 (0,3)], og leverkreft cellelinjer Hep-3B [IC
50 /iM: Sio-3,6 (1,3); Tio-2,3 (0,8)], Huh7 [IC
50 /iM: Sio-2,3 (0,5); Tio-1,8 (0,2)], og SK-Hep [IC
50 /iM: Sio-3,7 (0,4); Tio-6,0 (1,4)], viste følsomhet i lavt mikromolområde til tiazol antibiotika som bestemmes av veksthem analyser. (C-D) Siomycin A og Thiostrepton hemme FoxM1 uttrykk og indusere potent apoptose i leukemi og lever kreftceller.
For å vurdere kvantitativt graden av følsomhet for ulike menneskelige kreftcellelinjer til de tiazol antibiotika Siomycin A og Thiostrepton vi utførte veksthemming analyser på ulike leukemi (CEM, HL60, U937) og lever (Hep-3B, Huh7, SK-Hep) kreftceller. Disse kreftcellelinjer ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av antibiotikaene i 48 timer, og graden av veksthemming ble bestemt ved å telle antallet levende celler (Fig. 2B). Alle cellelinjene viste IC
50s i den lavt mikromolområde, noe som tyder på at disse humane kreftceller er ganske følsomme for thiopeptides. I tillegg har vi evaluert apoptotiske respons på Siomycin A og Thiostrepton i disse humane kreftceller ved immunoblotting for kløyvde caspase-3. Vi har funnet at både Siomycin A og tiostrepton undertrykke FoxM1 proteinekspresjon, og indusere apoptose i disse leukemi og leverkreftceller (Fig. 2C, D). Disse dataene støtter videre vår konklusjon at tiazol antibiotika ikke bare motvirke trans evne FoxM1, men de kan også hemme dens uttrykk på grunn av FoxM1 positiv feedback loop [33]. Videre observerte vi direkte sammenheng mellom FoxM1 undertrykkelse og caspase-3 cleavage (kjennetegn på apoptose) etter behandling med disse forbindelsene. Den nære koblingen mellom FoxM1 undertrykkelse og induksjon av apoptose antyder at thiopeptides kan utøve sin proapoptotiske aktivitet i det minste delvis gjennom hemming av FoxM1 i humane kreftceller.
For å undersøke potensielle rolle FoxM1 i tiopeptid-mediert apoptose, behandlet vi U2OS osteosarcom-celler med 10 pM av Siomycin A og høstes cellene ved forskjellige tidspunkter (fig. 3A). Vi har funnet betydelig reduksjon i FoxM1 proteinekspresjon så tidlig som 18 timer, som ble korrelert med forekomsten av robuste spaltede caspase-3 bånd. Vi har også observert korrelasjon mellom sterkere nedregulering av FoxM1 og mer intens apoptose etter 24 timers behandling med tiostrepton i nærvær av den velkjente translasjonell inhibitor cykloheksamid (Chx) i forhold til individuell behandling med narkotika, igjen indikerer at undertrykkelse av FoxM1 kan være påkrevet for den tiopeptid-indusert apoptose (fig. 3B). For ytterligere å undersøke hvilken rolle FoxM1 i tiopeptid-mediert apoptose vi utnyttet C3 cellelinje [25]. FoxM1 ekspresjon ble indusert ved tilsetning av doksycyklin og den påfølgende dag ble cellene behandlet med cykloheksamid og tiostrepton for (3C Fig.) 24 timer. Vi har observert at ekspresjonen av endogene FoxM1 redusert i en tidsavhengig måte etter behandling, mens nivåene av eksogene FoxM1 ikke ble påvirket (fig. 3C). Vi fant også at overekspresjon av FoxM1 beskyttet mot celledød indusert av tiostrepton som påvist ved immunblotting for spaltede caspase-3 (fig. 3C). Disse data understøtter ideen om at nedregulering av FoxM1 kan bidra til tiopeptid-indusert apoptose. Likeledes fant vi at C3-celler som overuttrykker FoxM1 var resistente mot behandling med Siomycin A som analysert ved immunblotting for spaltet caspase-3 (Fig. 3D). Ytterligere eksperimenter viste at overekspresjon av FoxM1 beskytter også mot Siomycin A-indusert apoptose i nærvær av cykloheksamid (fig. 3E). Tatt sammen, alle disse data at nedregulering av FoxM1 ved Siomycin A og tiostrepton kan være nødvendig for tiopeptid-indusert apoptose.
(A) Immunoblot-analyse etter behandling med Siomycin A avdekket nær sammenheng mellom nedregulering av FoxM1 og induksjon av apoptose. (B) Ved å følge behandling med tiostrepton, tiopeptid-indusert apoptose og inhibisjon av FoxM1 proteinekspresjon er mer fremtredende i nærvær av cykloheksamid (Chx) som vist ved immunoblotting for FoxM1 og spaltet caspase-3. (C) Ekspresjon av endogene FoxM1 redusert i en tidsavhengig måte i nærvær av tiostrepton og Chx, mens nivåene av eksogene FoxM1 ikke ble påvirket. Overekspresjon av FoxM1 beskyttet mot celledød indusert av tiostrepton som påvist ved immunblotting for spaltede caspase-3. (D) FoxM1 overekspresjon celler var resistente mot behandling med økende mengde Siomycin A som analysert ved immunblotting for spaltede caspase-3. (E) Immun analyse viste at overekspresjon av FoxM1 også beskyttet mot Siomycin A-indusert apoptose i nærvær av Chx.
Diskusjoner
Vi har tidligere rapportert at tiazol antibiotika Siomycin A [ ,,,0],25] og tiostrepton [29] hemme FoxM1 og indusere apoptose i humane kreftceller. I denne studien viste vi at tiazol antibiotika hemmer FoxM1 transkripsjonen aktivitet, har de også nedregulere ekspresjon FoxM1 og indusere celledød i neuroblastom, leukemi og leverkreftceller. Det er kjent at antibiotika tiazol utføre sin antibakterielle aktivitet ved å inhibere bakteriell oversettelse via interaksjon med den 23S ribosomale RNA, men at de ikke blokkerer eukaryot proteinsyntese [34]. Den eksakte mekanismen for inhibering av FoxM1 transkripsjonen aktivitet er ikke klarlagt, men det er ikke relatert til deres evne til å inhibere proteinsyntese. Interessant nok har vi funnet at også tiazol antibiotika undertrykke ikke bare den transkripsjonelle aktivitet, men også ekspresjonen av FoxM1 (fig. 1, 2), noe som tyder på at FoxM1 kan positivt regulere sin egen transkripsjon [33].
Her har vi funnet at antibiotika tiazol-indusert apoptose i kreftceller av forskjellig opprinnelse ble korrelert med nedregulering av FoxM1 (fig. 2, 3). De thiopeptides hemmet cellevekst med lignende IC
50 og indusert celledød med tilsvarende konsentrasjoner i så ulike celletyper som neuroblastom, leukemi og hepatoma (fig. 2). Siden vi allerede rapporterte at Siomycin A og tiostrepton mål FoxM1, hemmer cellevekst og induserer apoptose i melanomceller [29] Disse data bekrefter ytterligere at tiazol-antibiotika kan påvirke mange forskjellige humane kreftceller. I tillegg viste vi at overekspresjon av FoxM1 kunne beskytte cancerceller mot tiopeptid-mediert apoptose (Fig. 3C, D, E). Siden tiazol antibiotika undertrykke ekspresjon og aktivitet av FoxM1 og samtidig FoxM1 overekspresjon beskytter kreftceller fra Siomycin A og tiostrepton toksisitet, kan FoxM1 være et gyldig mål tiazol antibiotika-indusert apoptose. Nylig, Kwok et. al. viste at tiostrepton undertrykker FoxM1 ekspresjon og induserer apoptose i brystkreftceller [35]. Disse dataene støtte videre vår nåværende resultater og funn fra våre tidligere publikasjoner som thiazole antibiotika, Siomycin A [25], og Thiostrepton [29] indusere apoptose og undertrykke FoxM1 uttrykk i humane kreftceller. Men denne gruppen ikke linke undertrykkelse av FoxM1 uttrykk for hemming av sin transkripsjonen aktivitet av Thiostrepton [35]. I tillegg hevder de at bare konstitutivt aktiv, men ikke hvete FoxM1, kan hemme Thiostrepton antiproliferativ aktivitet [35]. Ytterligere eksperimenter er nødvendig for å løse disse forskjellene.
I sammendrag, demonstrerte vi at tiazol antibiotika Siomycin A og tiostrepton er potente inhibitorer av FoxM1 transkripsjonen aktivitet og ekspresjon. I tillegg kan de indusere programmert celledød i humane kreftceller av diverse opprinnelse. Graden av apoptose indusert av thiopeptides korrelerer med undertrykkelse av FoxM1, mens overekspresjon av vill type FoxM1 delvis beskyttet kreftceller fra tiopeptid-indusert apoptose. Disse data tyder på at inhibering av FoxM1 ved Siomycin A og tiostrepton til en viss grad er ansvarlig for celle-død som induseres av tiazol antibiotika. Forsøkene som er beskrevet i dette manuskriptet støtte våre tidligere rapporter [25], [26], [27], [29] som FoxM1 er et passende mål for kreft narkotika og at tiazol antibiotika kunne representere lovende alternativer til tiden brukt kreft behandlinger.
Materialer og metoder
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP, media og kjemiske forbindelser
U2OS osteosarkom celler; C3 celler [22], en U2OS klone C3 cellelinje med doksycyklin-induserbar FoxM1-GFP fusjonsprotein; U2OS avledet C3-Luc2.3-FoxO1 osteosarkom, som stabilt uttrykker doksycyklin-induserbar FoxM1-GFP [25], den tamoxifen-induserbare FoxO1 (AAA) -er-fusjonsprotein og ildflueluciferase under kontroll av multiple FoxM1 /FoxO1 responsive elementer; HCT116-p53RE-Luc colon, som stabilt uttrykker ildflue luciferase under kontroll av en promoter med flere p53 responselementer (p53RE); A549 lunge og Huh7, Hep3B og SK-Hep leverkreft cellelinjer ble dyrket i DMEM medium (Invitrogen). SW480 tykktarm, caspase-8 mangelfull og rekonstituert NB7 neuroblastom (generøse gaver fra Dr. Jill M. Lahti, St. Jude Children Research Hospital, Memphis), CEM, HL60 og U937 leukemi kreftcellelinjer ble dyrket i RPMI 1640 medium (Invitrogen) . I alle tilfeller media ble supplert med 10% føtalt bovint serum (Atlanta Biologicals) og 1% penicillin-streptomycin (GIBCO), og de cellelinjer ble holdt ved 37 ° C i 5% CO
2. Tiazol antibiotika Siomycin A (NCI) og tiostrepton (Sigma) ble oppløst i DMSO (dimetylsulfoksyd), tamoksifen (Sigma) i etanol, doksysyklin (Clontech) i PBS og cykloheksamid (Sigma) i DMSO.
Konstruksjoner og transfeksjoner
Super8xTOPFlash og kontroll Super8xFOPFlash reporter plasmider var generøse gaver fra Dr. Randall T Moon (University of Washington, Seattle, WA). Den SRαGLI1 uttrykk plasmid og GLI-BS-Luc, miniTK reporter konstruerer var snill gaver fra Dr. David J. Robbins (Dartmouth Medical School, Hanover, NH). Forbigående transfections ble utført med Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner.
immunoblotanalyse
Kreftceller av ulik opprinnelse behandlet som indikert ble høstet og lysert ved hjelp av IP-buffer ( 20 mM HEPES, 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 100 mM NaF, 10 mM Na4P2O7, 1 mM natrium othrovanadate, 0,2 mM PMSF supplert med protease inhibitor tablett (Roche Applied Sciences)) . Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved Bio-Rad Protein Assay Reagent (BIO-RAD). Isolerte proteiner ble separert på 8% eller 10% SDS-PAGE og overført til PVDF-membran (Millipore). Immunoblotting ble utført som beskrevet i 34, 35 med antistoffer spesifikke for FoxM1 (en gave fra Dr. Costas lab), FoxA1 (en gave fra Dr. Costas lab), FoxO1 (Cell Signaling), FoxO3a (Upstate), kløyvde caspase- 3 (cellesignalisering) og β-aktin (Sigma).
luciferase-analyser
C3-Luc2.3-FoxO1-celler ble dyrket i 6-brønns plater og behandlet over natten med en kombinasjon av enten 1 mg /ml doksycyklin eller 300 nM tamoxifen og tre mikrometer av Siomycin A eller Thiostrepton. Dessuten ble det HCT116-p53RE-Luc cellelinje dyrket i 6-brønns plater og behandlet med 3 uM av Siomycin A eller tiostrepton i 16 timer. Videre SW480 kolon kreftcellelinje dyrket i 6-brønns plater ble transient transfektert med TOPFlash og FOPFlash konstruksjonene. Tjuefire timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med 3 uM av Siomycin A eller tiostrepton. Neste dag ildflue luciferase-aktiviteten ble målt ved å bruke Luciferase Assay System (Promega). Proteinkonsentrasjonen målt ved hjelp av Bio-Rad Protein Assay Reagent (BIO-RAD) ble anvendt for normalisering. A549 lungekreftceller dyrket på seks-brønns plater ble transient transfektert med enten Telenor-avhengige GLIBS-Luc eller kontroll miniTK reporter konstruerer, den GLI uttrykk plasmid og PRL-null (Promega) som uttrykker Renilla luciferase. Cellene ble behandlet med 3 mikrometer av Siomycin A eller Thiostrepton 24 timer etter transfeksjon og luciferase aktivitet ble målt med Dual-luciferaserapportørplasmid analysesystem (Promega) i henhold til produsentens instruksjoner neste dag.
Takk
Dette manuskriptet er dedikert til minne om Dr. Robert H. Costa. Vi ønsker å takke Dr. Randall Moon (University of Washington, Seattle) for TOPFlash og FOPFlash plasmider, Dr. David Robbins (Dartmouth Medical School, Hanover) for å gi GLI effektor og reporter plasmider. Vi ønsker også å takke Dr. Jill M. Lahti (St. Jude Children Research Hospital, Memphis) for caspase-8 mangelfulle og utblandede NB7 neuroblastom cellelinjer. Vi takker Dr. Angela Tyner (University of Illinois i Chicago, Chicago) og Dr. Senthil Radhakrishnan (Caltech, Pasadena) for å lese manuskriptet og for deres verdifulle kommentarer. Vi takker også Dr. Nissim Hay (University of Illinois i Chicago, Chicago) for å gi FoxO1 og FoxO3a antistoffer, og for hans nyttige forslag.
