Abstract
Høy svulst kallikrein-relaterte-peptidase 4 (KLK4) nivåer er assosiert med et dårlig resultat for kvinner med serøs ovarialcancer (EOC), som peritoneal formidling og chemoresistance er viktige hendelser. For å finne ut hvilken rolle KLK4 i disse hendelsene, undersøkte vi KLK4-transfektert Skov-3 og endogene KLK4 uttrykker OVCA432 celler i tre-dimensjonale (3D) suspensjon kultur å etterligne ascites mikromiljøet. KLK4-Skov-3 celler dannet flercellede aggregater (MCAS) sett i ascites, som gjorde Skov-3 celler behandlet med aktiv KLK4. MCA dannelse ble redusert ved behandling med en KLK4 blokkerende antistoff eller den selektive aktive sete KLK4 solsikke trypsin inhibitor (SFTI-FCQR). KLK4-MCAS dannet større kreftcelle foci i mesothelial cellemonolagene enn de som er dannet av vektor og innfødte Skov-3 celler, noe som tyder KLK4-MCAS er meget inngripende i peritoneal mikromiljøet. Et høyt nivå av KLK4 uttrykkes ved ascitic EOC celler sammenlignet med matchede primær tumorceller, noe som ytterligere støtter sin rolle i ascitic mikromiljøet. Interessant, KLK4 transfektert Skov-3 celler uttrykte høye nivåer av KLK4 underlaget, urokinase plasminogen aktivator (uPA), spesielt i 3D-suspensjon, og høye nivåer av både KLK4 og uPA ble observert i pasient celler tatt fra ascites. Viktigst, KLK4-MCAS var paclitaxel motstandsdyktig som ble reversert av SFTI-FCQR og i mindre grad av den generelle serin protease inhibitor, aprotinin, noe som tyder på at i tillegg til uPA, andre som ennå uidentifiserte substrater av KLK4 må være involvert. Likevel, disse dataene tyder på at KLK4 hemming, i forbindelse med paclitaxel kan forbedre utfallet for kvinner med serøs epitelial eggstokkreft og høye KLK4 nivåer i sine svulster
Citation. Dong Y, Stephens C, Walpole C, Swedberg JE, Boyle GM, Parsons PG, et al. (2013) Paclitaxel Resistance og Flercellede spheroid dannelse er indusert av Kallikrein-Related Peptidase 4 i Serous eggstokkreft celler i en Ascites Etterligning av mikromiljøet. PLoS ONE 8 (2): e57056. doi: 10,1371 /journal.pone.0057056
Redaktør: Georgia Sotiropoulou, Universitetet i Patras, Hellas
mottatt: 30 august 2012; Godkjent: 16 januar 2013; Publisert: 25 februar 2013
Copyright: © 2013 Dong et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Prosjektet er støttet av National Health and Medical Research Council (NHMRC) fra Australia gir 242 220, 390 123 og 550 523; Kreft Council of Queensland og Queensland University of Technology. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Serous epitelial ovarialcancer (EOC) står for 50% av eggstokkreft [1] som er den ledende dødsårsaken fra gynekologiske kreftformer [2]. Omtrent 75% av kvinner med EOC er diagnostisert når svulstene har spredd seg inn i bukhulen [3] og ~70% av disse pasientene akkumulere ascites [4]. Til forskjell fra andre solide tumorer oppstår EOC metastaser som svulstcellene er utgytt fra den primære området og danne flercellede aggregater (MCAS) i tre-dimensjonale (3D) -suspension ascites mikromiljø, før man følger til peritoneal overflate og etablere sekundære svulster i den underliggende ekstracellulære matriks (ECM) [5].
overlevelse i ascites mikromiljøet er avgjørende for EOC celler til å lykkes i peritoneal formidling. Selv om den underliggende mekanismen er ikke klart, er det kjent at de ascitic EOC cellene er biologisk forskjellig fra sine kolleger i de solide matriser av primære og metastaser [6]. For eksempel, celle adhesjonsproteiner E-cadherin [7] og α5 /αv /ß1 griner [8] er sterkt uttrykt i ascites-avledet eggstokkreft celler sammenlignet med de fra primære eller metastatiske tumorsteder. Av notatet, serin protease, urokinase plasminogen aktivator (uPA) og dens reseptor uPAR i EOC celler blir indusert av ascites [9] og uttrykk for uPA er assosiert med chemoresistance, progresjon og dårlig prognose hos kvinner med denne kreftformen [10], [11]. Disse studiene indikerte at svulsten mikromiljøet tydelig påvirker EOC progresjon [12], [13], men virkningen av suspensjonen i seg selv, og dermed etterligne ascites mikromiljøet, på overlevelse av EOC celler og kjemosensitivitet er ikke klart. Spesielt involvering av andre serinproteaser fortsatt i stor grad ukjent.
kallikrein relaterte-peptidase (KLK) familie består av 15 serin peptidaser som har vist sitt potensial som biomarkører i kreft hos mennesker [14], [15] [16]. Disse peptidaser nedbrytes ECM-proteiner og aktivere vekstfaktorer og andre proteaser, slik som uPA /uPAR-aksen [17], [18], som spiller en rolle i progresjon av kreft human [14], [15], [16]. I eggstokkreft, er KLK4-KLK8, KLK10 og KLK14 oppregulert [14], [15], [19], [20] og vi tidligere rapportert at KLK4 og KLK7 var høyt uttrykt i den mest dødelige histotype, serøs EOCs [21] [22]. Nylig viste vi at høy
KLK7
nivåer er assosiert med dårlig prognose og chemoresistance hos kvinner med serøs EOC og at KLK7 induserer MCA av Skov-3 celler, mest sannsynlig gjennom en inte relatert mekanisme [23]. Gitt at høye KLK4 nivåer er også rapportert å være assosiert med dårlig prognose [24] og chemoresistance [25], i denne studien ønsket vi å finne ut om en lignende, kanskje KLK spesifikke, funksjonell mekanisme ble forekommende. Vi viser her at, som for KLK7, KLK4-over-uttrykk i Skov-3 celler fremmer MCA dannelse og paclitaxel motstand i 3D-suspensjonskulturer som etterligner ascites mikromiljøet, men i motsetning til det man ser i KLK7-Skov-3 celler vi fant ingen assosiasjon med inte uttrykk. Men KLK4 overekspresjon Skov-3 celler vises oppregulert nivåer av uPA, særlig i 3D-suspensjon MCAS. Viktigere, KLK4 hemming redusert MCA pakking og økt paclitaxel følsomhet i KLK4-MCAS. Disse dataene tyder på at selv om flere KLKs er over-uttrykt i EOC, og kan på lignende måte forbundet med EOC progresjon, vil den underliggende mekanismen være relatert til den spesifikke selektive enzym spesifisiteten til hvert KLK peptidase.
Materialer og Metoder
Materialer
Antistoffer brukt inkluderer de mot V5 epitop merket ved C-terminalen KLK4 (Invitrogen, Mount Waverley, VIC, Australia); en KLK4 katalytisk domene antistoff, KLK4 funksjonell blokkering antistoff (R monoklonale anti-uPA B-kjeden (American Diagnostica, Stamford, CT, USA); GAPDH og en anti-mus IgG (Sigma Aldrich Pty Ltd, Castle Hill, NSW, Australia). Mus og kanin Alexa Fluor 488 sekundære antistoffer, Alexa Fluor 568 phalloidin og CellTracker
492 var fra Invitrogen. Den generasjonen av aktiv rekombinant KLK4 [26] og den selektive aktive området KLK4 solsikke trypsin inhibitor (SFTI-FCQR) [27] er som publiseres. Seterettet mutagenese ble brukt til å generere den katalytiske triaden serin til alanin mutant-KLK4S207A (KLK4S /A) plasmid. Alle andre kjemikalier var fra Sigma, unntatt der det er angitt.
humane cellelinjer og pasient Serous EOC Biopsi og eggstokkvev RNA
Skov-3 serøs EOC og LP9 peritoneal mesothelial cellelinjer var fra amerikansk Type Culture Collection og Coriell Cell Oppbevaringssteder hhv. Den OVCA432 cellelinjen ble etablert fra ascites hentet fra en EOC pasient [28] og er en sjenerøs gave fra Dr. Samuel Mok (MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, USA). Opprinnelsen til pasient EOC celler er beskrevet tidligere [21], [22]. De serøs EOC vev RNA prøver ble beskrevet tidligere [23]. Pasient klinisk informasjon er innhentet fra Royal Brisbane og kvinner Hospital (Supplementary Tabell S1). Etisk godkjenning er innhentet fra institusjonelle etikkomiteer (menneskelig forskningsetikk Committee of Queensland University of Technology (# 0800000213) og The Clinical and Delstaten Services forskningsutvalg (# 229)); skriftlig samtykke ble innhentet fra alle pasienter.
RNA Utvinning, Reverse Transcription-PCR (RT-PCR)
Total RNA ekstraksjon og syntese av cDNA er beskrevet tidligere [23]. Kvantitativ-RT-PCR ble utført i 40 sykluser på en ABI7300 termosykler (Applied Biosystems, Mulgrave, VIC, Australia) ved hjelp av
KLK4
spesifikke primere (K4Ex2qS, 5′-GGCACTGGTCATGGAAAACGA-3 «og K4Ex3qAS, 5» -TCAAGACTGTGCAGGCCCAGCC-3 «) og SYBR grønt i henhold til produsentens anvisninger.
KLK4
ekspresjon var normalisert til
18S
(18SFor, 5′- GATCCATTGGAGGGCAAGTCT-3 «og 18SRev, 5′-CCAAGATCCAACTACGAGCTTTTT-3») ved hjelp av standardkurve fremgangsmåte og RT-PCR ble utført som tidligere beskrevet [23].
Generering av stabile cellelinjer
Generation og transfeksjon av plasmid (pcDNA3.1 /V5-His, C-terminal V5 tag, Invitrogen) uttrykker vill -type pre-pro-KLK4 ble beskrevet tidligere [29]. Den katalytiske triaden serin til alanin mutant-KLK4S207A (KLK4S /A) plasmid ble dannet ved seterettet mutagenese. Stabil monoklonalt KLK4 uttrykte eller vektorkontrollceller ble valgt ved hjelp av G418 (Invitrogen), og tre over-uttrykke kloner, KLK4-1, KLK4-2 og KLK4-3, ble tilfeldig valgt for følgende
in vitro
funksjonelle analyser.
in vitro funksjonelle analyser
in vitro migrasjon analyser.
2 × 10
5 celler i RPMI-1640 som inneholdt 0,1% BSA ble sådd i vev kultur setter inn med 8 mikrometer porer (BD Biosciences, Eight Mile Plains, QLD, Australia), og lov til å vandre mot 10% FCS som kjemotiltrekkende i det nedre kammeret i 24 timer (h). Antallet migrerte celler ble kvantifisert ved hjelp av krystallfiolett farging lese på 595 nm.
Flercellede aggregat (MCA) /spheroid dannelse og hemming.
Den hengende-slipp-metoden [30] ble brukt for MCA dannelse av alle transfekterte og tilpassede celler med 5 x 10
3 celler /brønn i nærvær av 10% FCS RPMI-1640 (100 ul) på toppen av agarose-belagte plater (60 ul av 0,5% agarose /serum- frie medier, vekt /volum) og inkubert ved 37 ° C. Når rekombinant aktiv KLK4 (rKLK4) enzym og katalytisk inaktive mutant KLK4S /A (50 ng /ml) ble anvendt for å indusere dannelsen av MCA SKOV-3-celler, ble dette utført under serumfrie forhold. Serumfritt RPMI-1640 ble anvendt for MCA inhibering med den KLK4 blokkerende antistoff ved en konsentrasjon (10 ug /ml) for å fange opp alle aktivt enzym med en mus IgG (10 ug /ml) kontroll. KLK4 aktive området solsikke trypsin inhibitor (SFTI-FCQR, 1 mm) [27] eller PBS kontroller ble lagt inn i 10% FCS RPMI-1640. Bilder ble tatt med et Nikon-Eclipse TE2000-U digitalt kamera (4 × mål) og V ++ programvare. Kompakte MCAS ble definert som de med ≥30 mikrometer diameter. For å kvantifisere prosentandel av celler som dannes kompakte MCAS (≥30 um), alle synlige sfæroider ( 30 um, ≥30 um) ble talt ved alle tidspunkter og ble delt med antall på 4 timer, tidspunktet valgt å la cellene å bosette seg i brønnen. Differansen av de totale sfæroide tall og de med 30 um diameter på dag 1, 4 og 7 fra 4 timer ble beregnet og ble betraktet som den prosentandelen av kompakte MCAS dannet. Denne tilnærmingen var basert på en tidligere rapport fra Iwanicki et al [31].
In vitro mesothelial klarering analysen.
LP9 mesothelial celler (5000) ble sådd i 96-brønners plater og vokst til ~80% samløpet. MCAS ble vasket i PBS, inkubert i CellTracker
492 (4 pM), tilsatt på toppen av mesothelial monolag (~4-6 sfæroider /brønn /200 pl) og dyrket ved 37 ° C. Ved 4 t, 1, 2, 3 og 7 dager fra den første sfæroide plating ble bilder tatt med et 10 x objektiv. For å kvantifisere MCA klaring, diameteren på fluorescerende områdene MCAS merket med CellTracker
492 ble målt ved hjelp av InDesign programvare (Adobe, Adobe Systems Pty Ltd, Sydney, NSW, Australia). Målinger ble utført på 10 tilfeldig utvalgte MCAS fra 3 separate eksperimenter for den midlere diameter på dag 3 i forhold til det av det første område av den sfæroide (4 timer).
Celleoverlevelse stolpe cisplatin /paclitaxel-behandling.
24 timer etter utsåing i ikke-belagte 96-brønners plater (Nunc) som 2D-monolag, ble cellene behandlet med cisplatin (0, 1, 5, 10, 50 uM) eller paclitaxel (0, 0,01, 0,1, 1 , 10 nM). I 3D-suspensjonskulturer, ble dannet sfæroider som ovenfor i 4 dager og deretter cisplatin eller paclitaxel ble tilsatt. For KLK4 inhibering i 3D-suspensjon, ble det KLK4-1 eller OVCA432 cellene resuspendert i SFTI-FCQR (1 uM) inneholdende medium og podet, og på dag 4 paclitaxel (0, 0,1, 1, 10, 50, 100 nM) var la til. WST-1-analyser ble utført 96 timer etter behandling. Celleoverlevelse ble beregnet som prosentandelen av absorbans av ikke-behandlede celler.
knockdown av KLK4 Expression
knockdown av KLK4 ekspresjon ble utført som beskrevet tidligere [26]. I korthet pattedyr siRNA ekspresjonsvektoren pSilencer 3,1-H1 puro (Ambion, Austin, TX, USA) ble anvendt for å redusere ekspresjon av KLK4. Kandidat KLK4 siRNA målsekvenser ble utformet med Ambion siRNA programmet og deretter justert mot den menneskelige genom data base hjelp av BLAST-algoritmen for å eliminere de med betydelig homologi til andre gener. To sekvenser ble valgt 5′-GATCCATCCCTGGGGCTGGTTCCTTTCAAGAGAAGGAACCAGCCCCAGGGATTTTTTTGGAAA-3 «(psilK4Ex1) og 5′-GATCCAACGAATTGTTCTGCTCGGTTCAAGAGACCGAGC- AGAACAATTCGTTTTTTTTGGAAA-3» (psilK4Ex2). De oligoer ble syntetisert (Sigma) og satt inn i pSilencer 3,1-H1 puro vektor (Ambion) i henhold til produsentens instruksjoner. Skov-3 stabilt uttrykker KLK4 (KLK4-1 klone) celler ble transfektert med KLK4 pSilencer 3,1-H1 konstruerer eller den medfølgende pSilencer 3,1-H1 negativ kontroll ved hjelp Lipofectamine (Invitrogen). Etter 48 timer ble hele cellelysatet samlet fra transfekterte celler og ekspresjon av KLK4 og uPA ble undersøkt ved Western blot-analyse.
Western Blotting
Hele cellelysater fra celler dyrket som monolag i 3 dager ble samlet i en buffer som inneholder komplett proteasehemmer cocktail (1 ×, Roche Applied Sciences, Castle Hill, NSW, Australia), 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl (150 mM) og CHAPS (1%). -Celler dyrket i 3D-kollagen I, 3D-Matrigel ™ (BD Biosciences) og 3D-suspensjon i 7 dager ble oppsamlet i iskald PBS, etterfulgt av fremgangsmåten ovenfor. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved microbicinchoninic syreanalyse (Thermo Fisher Scientific, Scoresby, VIC, Australia). Cellelysatene (20 ug) eller kondisjonerte medier (CM, 4 ug protein) ble separert ved SDS-PAGE under reduserende betingelser, overført til nitrocellulosemembraner, og blokkert i Odyssey blokkeringsbuffer (LI-COR® Biosciences, Lincoln, NE, USA) . Membraner ble inkubert med primære antistoffer fortynnet i blokkeringsbuffer over natten ved 4 ° C, vasket med tris-bufret saltvann inneholdende 0,05% Tween-20, og deretter inkubert med sekundær IRDye 680 eller 800 konjugert mus eller kanin IgG (LI-COR® Biosciences) som hensiktsmessig. Bilder ble generert og densitometry analyse ble utført ved hjelp av Odyssey system og programvare (LI-COR® biovitenskap).
Konfokalmikroskopi
Celler dyrket på sterile dekkglass inntil 80% sammenflytende eller MCAS innsamlede i Eppendorf-rør etter 7 dagers dyrking ble fiksert (4% vekt /volum paraformaldehyd /PFA i PBS), permeabilisert (0,5% volum /volum triton X-100 i PBS) og blokkert (5% vekt /volum bovint serumalbumin /BSA i PBS). Inkubering med primære antistoffer mot KLK4 og E-cadherin (1/200 vol /vol i 1% BSA i PBS) ble ved 4 ° C over natten. Alexa Fluor 568 phalloidin og 4′-6-diamidino-to-phenylindole (DAPI, Sigma) ble påført med sekundære Alexa Fluor 488 IgG som passer. For å få bilder av MCA clearance, ble monolayer mesothelial LP9 celler sådd i en 8-kammer lysbilde (In vitro Technologies, Noble Park North, VIC, Australia), CellTracker
492 ble søkt om KLK4-1 kuler før såing og 24 timer senere ble cellene fiksert som ovenfor etterfulgt av farging av Alexa Fluor 568 phalloidin og DAPI; MCAS av Vector-1, ble Skov-3 og OVCA432 farget med E-cadherin som ovenfor. Bilder ble tatt med en Leica-TCS SP5 konfokal mikroskop (63 × og 20 × olje nedsenking objektiv for henholdsvis monolagcellene og MCAS) og tilhørende programvare. Z seksjon stabling bildene ble generert ved hjelp av Maximum Projection programvare med sideforholdet 2.
Statistical Analysis
t-test ble brukt for funksjonell analyser med
P
≤0.05 vurderes å være betydelig. For overlevelsesanalyse, ble pasientene kategorisert i to grupper med enten lav (n = 25) eller høy (n = 13)
KLK4
nivåer ved hjelp av en median cut-off av
KLK4
kopiantall, etter normalisering til
18S, etter av 0,0007 (range 0,0000147 til 0,0258). To forskjellige endepunkter, kreft tilbakefall og pasientens død ble brukt til å beregne etter operasjonen progresjonsfri overlevelse (PFS) og total overlevelse henholdsvis. Kaplan-Meier analyse ble brukt for å bestemme sammenslutning av
KLK4
nivå med PFS og total overlevelse tid av en log rank modell. Analysene ble utført ved hjelp av SPSS 18.0 for Windows (SPSS Inc, Chicago, IL, USA).
Resultater
KLK4-uttrykke Skov-3 celler er mindre trekkende men er kjemoresistent som 2D Monolag
Vi ønsket for å bestemme virkningsmekanismen ligger under dårlig prognose [24] og chemoresistance [25] som tidligere er rapportert å være assosiert med høye
KLK4
nivåer i eggstokk-kreft generelt. Dermed genererte vi både stabile og forbigående transfektanter i Skov-3 celler som uttrykker lite endogen KLK4 for funksjonell analyse (Supplementary fig. S1 A). Western blot analyse bekreftet at V5-tagget over-uttrykt KLK4 (33 kDa), et ekstracellulært serin protease, utskilles i betinget media (CM) av både stabile og forbigående KLK4 transfektanter men ikke vektor bare, mock-transfektert eller innfødt Skov-3 celler (fig. 1A, topp panel). Interessant nok var et 88 kDa proteinbånd sett i CM fra to av de høye KLK4-uttrykkende kloner (KLK4-1 og KLK4-2) og den forbigående transfeksjon, men ikke den CM av et serin til alanin aktive sete mutant-KLK4S207A ( KLK4S /A) konstruksjon (fig. 1A, øvre panel), eller hele cellelysatet (WCL) fra villtype KLK4 eller mutant KLK4S /A-transfektanter (fig. 1A, nedre panel). Disse data indikerer at både villtype og mutant KLK4 KLK4S /A skilles men bare villtype KLK4 er tilstede som et aktivt enzym, som vist ved 88 kDa båndet som er sannsynlig KLK4 kovalent bundet med en uidentifisert serpin. For å støtte denne observasjonen at KLK4 er aktivert og danner komplekser med serum båret proteiner eller inhibitorer, ble aktiv KLK4 (100 eller 500 nM) inkubert med kulturmedium (RPMI-1640), med eller uten 1% og 5% FCS for to og 18. h hhv. Western blot-analyse viser at 88 kDa-arten er til stede bare når aktiv KLK4 ble inkubert i RPMI-1640 medium med FCS men ikke når FCS var fraværende (Supplementary fig. S1B). Nivået av KLK4 ekspresjon i KLK4-3 klon er sammenlignbar med den til endogent KLK4 uttrykk OVCA432 celler, mens den KLK4-1 klon viser mer intense KLK4 proteinbånd (Fig. 1B). Immunofluorescent (IF) mikroskopi ved anvendelse av antistoffer mot V5-merkede C-terminale og N-terminale peptid av KLK4 [29] ytterligere bekreftet protein over-ekspresjon i hver av de KLK4 klonene, men ubetydelig ekspresjon i vektorkontroll, native SKOV-3-celler eller KLK4-1 IgG kontroll (fig. 1C, supplerende fig. S1C).
A. Western blotting med anti-V5 antistoff viser KLK4 uttrykk i den betingede media (CM) og hele cellelysat (WCL) fra stabile KLK4 tranfectants (KLK4-1, KLK4-2 og KLK-3, baner 1-3), vektor (Vec -1, vec-2 og vec-3, baner 4-6) og innfødte Skov-3 (spor 7) celler, og forbigående uttrykt hvete KLK4, mutant-KLK4S207A (KLK4S /A), vektor- og mock transfektanter (baner 8- 11); GAPDH ble anvendt som en kontroll for lasting WCL. B. Western blotting med anti-antistoff KLK4 viser relative nivåer av KLK4 protein i WCL av KLK4-1, KLK4-3 kloner og OVCA432, og 10 ng av rekombinant (r) KLK4 protein. C. IF mikroskopi med anti-V5 /KLK4-N-terminal antistoffer (grønn) og phalloidin (rød) i KLK4-1, Vec-1 kloner, native Skov-3 eller negativ kontroll (IgG). Scale bar, 20 mikrometer. D. Transwell migrasjon analyser med KLK4-1, KLK4-2, KLK4-3, Vec-en, Vec-2 og innfødte Skov-3 celler; n = 3, gjennomsnitt ± SEM, * P. 0,05
Forrige
in vitro
studier har vist at KLK serinproteaser spalte kollagen I og IV, fibronektin, vitronektin og laminin [ ,,,0],32], [33] som er komponenter av bukhinnen og [34] og vi rapporterte at KLK7 overekspresjon økt adhesjon til fibronektin og vitronektin [23]. I denne studien, men vi fikk ikke se noen forskjell mellom de KLK4-transfekterte og kontrollceller i tilslutning til disse ECM komponenter eller spredning (data ikke vist). På den annen side, KLK4 som uttrykker kloner viste mindre transwell migrasjon i forhold til vektor /opprinnelige kontrollceller (* P 0,05 eller ** P . 0,01, figur 1D). I 2D-monolagskulturer, ved bruk av konsentrasjoner (cisplatin 0-50 pM; paclitaxel 0-100 uM) i området anvendes for pasientbehandling (cisplatin 3-50 uM; paclitaxel 3-20 uM) [35], KLK4-transfekterte SKOV- 3 celler var mer motstandsdyktig mot cisplatin enn vektor /innfødte kontrollceller (* P. 0,05, Supplementary fig S2, venstre panel), selv om bare en trend mot paclitaxel motstand ble sett for KLK4-transfekterte celler (Supplementary S2, høyre panel fig. ). Disse dataene antyder at eventuelle endringer indusert av KLK4 over-uttrykk var relativt subtile og at cisplatin snarere enn paclitaxel motstand, sett med KLK7 transfektert Skov-3 celler, ville være mer klinisk relevant fenotype.
KLK4-uttrykke Skov-3 celler danner Kompakte MCAS som Spre på mesothelial cellemono
på grunn av den rollen som homotypisk celle adhesjon for EOC celle overlevelse i 3D-suspensjon mikromiljøet av ascites [36] og våre tidligere funn som KLK7 kan indusere sfæroid formasjon [23], sammenlignet vi muligheten for KLK4 transfektert og kontrollcellene til å danne MCAS /sfæroider. Med 1, 4 og 7 dager etter såing, to av tre KLK4 kloner generert store kompakte MCAS med flere celler, samtidig som de nedre KLK4-uttrykkende celler KLK4-3 dannet litt mindre kompakt MCAS, med vektorkontroll og innfødte SKOV-3-celler som danner små og spredt kuler i 10% FCS inneholder media (fig. 2A). Til støtte for dette funnet, den endogene KLK4 uttrykker OVCA432 celler dannes mer kompakte MCAS enn Skov-3 celler som hadde lite KLK4. Kvantitativ analyse viste at KLK4-uttrykke celler dannet mer kompakte MCAS enn vektorkontrollceller på dag 1, 4 (** P 0,01) og 7 (*** P. 0,001, figur 2B), som gjorde den endogene KLK4 uttrykke OVCA432 -celler sammenlignet med SKOV-3-celler (* P 0,05, figur 2B.). Som vi har vist at noen aktive KLK4 er bundet til ukjente bindende proteiner eller serpiner i seruminneholdende medium (Supplementary fig. S1B) antyder KLK4 enzymatisk aktivitet kunne inhiberes i nærvær av serum, brukte vi serumfrie forhold for å teste tilsetning av aktive KLK4. Under disse forhold, KLK4-1 cellene som dannes mindre kompakt MCAS (fig. 2C) enn de som ses i 10% FCS (fig. 2A). Tilsetning av rekombinant aktiv KLK4 (rKLK4, 50 ng /ml) indusert opprinnelige SKOV-3-celler til å danne MCAS mer lik den som er observert for KLK4-1 klonen, mens den mutante KLK4S /A (katalytisk inaktivt, 50 ng /ml) behandlet SKOV -3-celler hadde et lignende utseende som i de SKOV-3-celler behandlet med PBS som kontroll (P . 0,05, figur 2C), noe som bekrefter involvering av KLK4 aktivitet i SKOV-3 celle aggregering. Kvantitativ analyse viste at aktiv rKLK4 behandlet Skov-3 celler dannet kompakte kuler med en lignende hastighet til KLK4-1 celler, og begge var større enn de som ble behandlet med ikke-aktive mutant KLK4S /A (* P 0,01) som var litt større enn den som sees for den SKOV-3 kontroll på dag 4 og 7, (** P 0,01, figur 2D.). Disse data bekrefter rollen til KLK4 peptidase i MCA formasjon, men også antydet en mulig ikke-katalytisk virkning av KLK4 i denne prosessen.
A. MCA /spheroid dannelse utført i 10% FCS inneholder media ved 4 h, dag 1, 4 og 7, med representative bilder av KLK4-1, KLK4-2, KLK4-3, Vec-en, Vec-2 kloner, innfødt SKOV- 3 og endogene KLK4 uttrykker OVCA432 celler. B. Kvantitativ analyse av prosenten av 4 h (0 tidspunkt) som dannes kompakte MCAS (≥30 um) etter 1, 4 og 7d fra de 3 KLK4 klonene kombinert, 2 vektor kloner kombinerte, native SKOV-3 og OVCA432 celler. C. MCA formasjon under serum-frie betingelser ved KLK4-1 klon og innfødte SKOV-3-celler behandlet med 50 ng /ml aktiv rekombinant (r) KLK4or mutant-KLK4S207A (KLK4S /A) og PBS kontroll på dag 1, 4 og 7. D. Kvantitativ analyse av kompakt MCA dannelse av KLK4-1, SKOV-3 behandles med rKLK4, KLK4S /A og PBS som en kontroll over 1, 4 og 7d. For paneler A og C, skala barer, 200 mikrometer; for B og D, ble forsøket gjentatt 3 ganger med tre paralleller; gjennomsnitt ± SEM; * P 0,05; ** P 0,01; og *** P. 0,001
Vi undersøkte invasivitet av KLK4-MCAS da lagt inn på peritoneal mesothelial cellemonolagene. Bright-feltet og fluorescerende (CellTracker
492) bilder viser at den kompakte KLK4-1 MCA følges live LP9 mesothelial enkeltlag og etter hvert dannet en omfattende foran spre kreftceller over 3 dager (fig. 3A, øverst til venstre panel) og opp til 7 dager (data ikke vist) som bekrefter deres levedyktighet og vekst på mesothelial monolayer. De MCAS dannet av vektor-en kontrollceller også spredt over mesothelial celle monolag om enn i mindre grad (Fig. 3A, panel øverst til høyre). Størrelsen av foci som genereres av endogent uttrykker KLK4 OVCA432 MCAS var de samme som for den transfekterte KLK4-1 MCAS (fig. 3A, nedre panel). Kvantitativ analyse viste at diameteren av de områdene av fluorescerende KLK4 MCA klaring (mer enn 6 ganger) var større enn den til den Vector-1 klon (3,5 ganger) på dag 3 i forhold til sine klonale kontroll ved 4 h (** P 0.01, fig. 3B). Likeledes er diameteren av den KLK4 endogent uttrykker OVCA432 MCA klaring på dag 3 (7 ganger sammenlignet til fire timer) ble sammenlignes med den KLK4-1 SKOV-3-klonen, mens det native SKOV-3 MCA klaring (3,2 ganger sammenlignet til fire h) var sammenlignbar med den vektor transfektert SKOV-3-celler (fig. 3B). Confocal bilder viser at CellTracker
492 farget KLK4-1, og endogent KLK4 uttrykke OVCA432 MCAS farget med E-cadherin vokste til mesothelial monolagene (Fig. 3C, øvre og midtre paneler) med flere Z stabling bildene bekrefter clearance av mesothelial monolag av de MCAS til bunnen av brønnen (fig. 3C, topplater). Vector-en og Skov-3 MCAS kan også invadere i mesothelial monolagene, men dannet mindre invaderende foci som følge av færre celle tall henholdsvis (fig. 3C, bunn paneler). Disse dataene antyder at overlevelse mekanisme av cellulær aggregering er indusert av KLK4 i 3D-henge ascites etterligne mikromiljø, og at disse KLK4 uttrykker kuler vil ha en økt spredning kapasitet i mesothelial laget av bukhinnen.
A. Bright-feltet og fluorescens (CellTracker
492) Bildene viser KLK4-1, Vector-en, Skov-3 og OVCA432 MCA (4 h og dag 3) clearance av mesothelial monolag. Usammenhengende linjene indikerer utkant spredning MCAS. B. Kvantitativ analyse viser gjennomsnittlig diameter på 10 MCAS fra 3 separate eksperimenter for ovennevnte cellelinjer ved 4 timer og henholdsvis dag 3; middelverdi ± SE, n = 3, ** P 0,01. C. IF mikroskopi bilder viser mesothelial enkeltlag clearance av MCAS dannet av KLK4-1 merket med CellTracker
492, Vector-en, OVCA432 og Skov-3 celler farget med en E-cadherin antistoff (grønn); både MCAS og mesothelial LP9 celler ble farget med henholdsvis Phalloidin for F-aktin (Alexa Mel 568, rød) og DAPI for kjerner (blå); usammenhengende linjer angir posisjonene flere Z seksjoner vist som rett og bunnplater. For paneler A og C, skala barer, 50 mikrometer.
KLK4 Hemming Økt Paclitaxel Følsomhet
Selv om KLK4-transfekterte Skov-3 celler var mer motstandsdyktig mot cisplatin enn vektor /innfødte kontroll celler (Supplementary fig. S2, venstre panel), ble ingen forskjell i cisplatin respons sett mellom KLK4 og vektor /innfødte kontrollceller i 3D suspensjon (data ikke vist). I kontrast, selv om bare en trend mot paclitaxel motstand ble sett for KLK4-transfekterte celler i 2D-monolaget (Supplementary fig. S2, panel til høyre), KLK4-MCAS i 3D-oppheng var klart mer motstandsdyktig mot paclitaxel enn vektor /innfødte celler ( ** P 0,01, figur 4A).. Spesielt, komprimering av KLK4-1 MCAS ble redusert ved tilsetning av en KLK4 blokkerende antistoff ved en konsentrasjon (10 ug /ml) for å fange opp alle aktivt enzym eller den selektive aktive sete KLK4 solsikke trypsin inhibitor (SFTI-FCQR), sammenlignet med deres respektive kontroller (fig. 4B, venstre og midtre paneler). Tilsvarende komprimering av endogent uttrykker OVCA432 MCAS ble redusert ved å legge SFTI-FCQR (Fig. 4B, panel til høyre). I tillegg, selv om en pM SFTI-FCQR alene ikke redusere proliferasjon (data ikke vist), er det betydelig redusert KLK4-1 og OVCA432 MCA overlevelse i en kombinert behandling med paclitaxel (** P 0,01, figur 4C.). Interessant, den generelle serin protease inhibitor, aprotinin, delvis redusert komprimering av MCAS dannet av KLK4-1 og OVCA432 celler (fig 4B, nedre panelet.) Og økt følsomhet for paclitaxel (* P. 0,05, fig 4C), riktignok i mindre grad enn SFTI-FCQR. Disse data understreket at KLK4-MCAS er motstandsdyktig mot paclitaxel og redusert MCA komprimering av KLK4 blokade økt følsomhet for dette stoffet.
WST-1-analysen viser celle overlevelse KLK4-1, KLK4-2, KLK4-3, vec-en, vec-2 kloner og innfødte Skov-3 MCAS etter paclitaxel (A) behandling i 3D-suspensjon. B. Venstre panel, representative bilder av KLK4-1 MCAS på dag 4 med mus IgG og en funksjonell KLK4 blokkerer antistoff, PBS som kontroll og KLK4 selektiv hemmer SFTI-FCQR (SFTI) som angitt. Høyre panel, representative bilder av OVCA432 MCAS på dag 4 med PBS som en kontroll og KLK4 selektiv hemmer SFTI-FCQR (SFTI) eller aprotinin som angitt. Skala barer, 200 mikrometer. C. Cell overlevelse bestemmes av WST-1-analysen etter behandling med paclitaxel (Pac) på 3D-oppheng kultivert KLK4-1 klone og OVCA432 celler +/- 1 mikrometer SFTI eller fem mikrometer aprotinin (Aprot). Eksperimenter i paneler A og C ble gjentatt 3 ganger i tre eksemplarer, barer representerer Mean ± SEM. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting.
