Abstract
Chemoresistance fortsatt et stort hinder for effektiv behandling av pasienter med eggstokkreft, og nylig økende bevis tyder på at mirnas er involvert i narkotika-motstand. I denne studien undersøkte vi rolle i regulering av mirnas cisplatin motstand i eggstokk-kreft cellelinje og analyserte deres mulige mekanismer. Vi profilert mirnas forskjellig uttrykt i cisplatin-resistente human eggstokkreft cellelinje A2780 /DDP sammenlignet med foreldre A2780 celler ved hjelp av microarray. Fire unormalt uttrykt mirnas ble valgt (MIR-146a, -130a, -374a og MIR-182) for videre studier. Deres uttrykk ble verifisert ved QRT-PCR. Mirna etterligner eller hemmer ble transfektert inn A2780 og A2780 /DDP celler og deretter stoffet følsomhet ble analysert ved MTS array. RT-PCR og Western blot ble utført for å undersøke den endring av MDR1, PTEN genekspresjon. I alt 32 mirnas ble funnet å være forskjellig uttrykt i A2780 /DDP-celler. Blant dem, ble Mir-146a nedregulert og MIR-130a, -374a, -182 ble oppregulert i A2780 /DDP celler, som ble bekreftet ved RT-PCR. MiR-130a og MIR-374a ligner redusert følsomhet for A2780 celler til cisplatin, omvendt, kan deres hemmere resensitize A2780 /DDP celler. Videre overekspresjon av MIR-130a kan øke MDR1 mRNA og P-gp-nivåer i A2780 og A2780 /DDP celler, mens knockdown av MIR-130a kan hemme MDR1 genuttrykk og oppregulere PTEN protein uttrykk .I en konklusjon, dereguleringen av MIR-374a og MIR-130a kan være involvert i utvikling og regulering av cisplatin motstand i eggstokkreft celler. Denne rollen MIR-130a kan oppnås ved å regulere MDR1 og PTEN genuttrykk
Citation. Li N, Yang L, Wang H, Yi T, Jia X, Chen C, et al. (2015) MiR-130a og MiR-374a Funksjon som Novel regulatorer Cisplatin Resistance i Menneskelig Eggstokkreft A2780 Cells. PLoS ONE 10 (6): e0128886. doi: 10,1371 /journal.pone.0128886
Academic Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 15 februar 2015; Godkjent: 02.05.2015; Publisert: 04.06.2015
Copyright: © 2015 Li et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble støttet av to fond. Den ene er den lokale Foundation (No.2012SZ0022) fra Vitenskap og teknologi Institutt for Sichuan-provinsen (https://www.scst.gov.cn/info/), som Funder er WHJ deltar i studiedesign og beslutningen om å publisere i denne studere. Den andre er programmet for Changjiang Scholars og Innovative Research Team i University (NO.IRT0935, https://www.moe.gov.cn/), som bevilgende myndighet hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den ledende dødsårsaken i gynekologiske kreftformer [1]. Mer enn 70% av pasientene med eggstokkreft har avansert stadium (FIGO stadium III eller IV) sykdom ved tidspunktet for diagnose [2]. Cisplatin er den viktigste terapeutiske tilnærmingen for fremskreden kreft i eggstokkene, men reduserer legemiddelresistens effektiviteten av cisplatin-base-kjemoterapi hos et stort antall pasienter [3]. Flere faktorer og mekanismer som bidrar til cisplatin- motstand er rapportert, blant annet økt narkotika utstrømning, oppdager uregelmessigheter av narkotika mål, forbedring av DNA-reparasjon og endring av apoptose trasé [4-7] .Nonetheless de underliggende mekanismene for chemoresistance er fortsatt dårlig forstått og effektive midler for å forbedre motstanden er til fravær.
Nylig studier har rapportert at microRNAs (mirnas) var involvert i chemoresistance. Mirnas representerer en klasse av små ikke-kodende RNA-molekyler, og kan binde seg til det 3′-ikke-translaterte området (3′-UTR) av mål-mRNA, noe som resulterer i RNA-degradering og /eller translasjonelle undertrykkelse [8]. Således mirnas vidt deltar i regulering av en rekke biologiske prosesser, slik som embryoutvikling, celledeling, differensiering, migrasjon og apoptose [8,9]. Et økende antall studier tyder på at avvikende miRNA uttrykk har vært forbundet med alle aspekter av tumorbiologi, herunder resistens mot ulike cytostatika [10-12] .For eksempel ble MIR-21 overexpressed i kolorektal kreft vev som var mindre følsomme for 5 -FU [13], og hemming av MIR-21 ekspresjonen var i stand til å sensibilisere celler til 5-FU [14]. I tillegg hadde vår tidligere studie [15] fant at Mir-130a ble oppregulert i SKOV3 /DDP sammenlignet med SKOV3, og MIR-130a hemming kan overvinne cisplatin motstand ved å regulere MDR1 /P-gp veien. Men rollen som mirnas prensents celle spesifisitet, så uttrykket av MIR-130a eller andre mirnas og deres roller i andre eggstokkreft cellelinjer for å videre studier.
I denne studien, vist vi miRNA uttrykket profilen til A2780 og A2780 /DDP celler, og valgte noen av forskjellig uttrykt mirnas i A2780 /DDP for videre studier. Deretter kontrollerer vi uttrykk for utvalgte mirnas av QRT-PCR, og undersøkt deres rolle i modulerende cisplatin-motstand, som kan tilby nye kandidat mål for genterapi i cisplatin-resistent eggstokkreft.
Materialer og Metoder
celle~~POS=TRUNC kultur~~POS=HEADCOMP
human ovarian cancer cellelinje A2780 og dens cisplatin-resistente sublinje A2780 /DDP ble dyrket i DMEM-medium (Gibco, USA) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS, Gibco , USA), i en fuktet inkubator med 5% CO
2 ved 37 ° C. A2780 /DPP ble vekselvis matet med medium som inneholder 9 mg /ml cisplatin for å opprettholde Resistens og videre dyrket i stoff-fri medium for en uke før oppfølgingseksperimenter. Begge cellelinjer ble oppnådd og bevart i gynekologi Oncology av Biotherapy Laboratory, West Kina Second universitetssykehus, Sichuan University, Chengdu, Kina.
miRNA microarray analyse
Total RNA ble ekstrahert fra A2780 og A2780 /DDP celler ved hjelp Trizol (Invitrogen, USA) og miRNeasy mini kit (Qiagen, Danmark) i henhold til produsentens instruksjoner. Kvaliteten og kvantiteten ble målt ved hjelp av spektrofotometer (Beckman Coulter, DU730, USA) og RNA integritet ble bekreftet ved gelelektroforese. RNA (1 ug) ble merket med Hy3 fluorescerende bruker miRCURY Strøm merking kit (Exiqon, Vedbæk, Danmark) og deretter hybridisert på miRCURYLNA Array (v.18.0, Exiqon) inneholder 1887 humane miRNA oppfangingsprober kommenterte i miRBase 18,0. Etter hybridisering, ble de fluorescerende signalbilder anskaffet ved hjelp av en GenePix 4000B scanner (Axon Instruments, Union City, CA, USA) og ble analysert med GenePix Pro 6.0 soft-ware (Axon Instruments), hvor medianen normalisering ble oppnådd. To ganger eller større endring ble satt som en terskel for betydelig forskjell.
Bioinformatikk
potensielle mål av forskjellig uttrykt mirnas ble spådd ved hjelp av PicTar eller TargetScan 5.2 software.
Sanntids QRT-PCR
Vi bekreftet uttrykk for seleted miRNAs i A2780 og A2780 /DDP celler ved QRT-PCR. Total RNA fra hver cellelinje ble trukket ut og måles som ovenfor nevnt. Mirna og U6 cDNA ble dannet ved anvendelse av miRNA spesifikk stilk-sløyfe RT-primere ifølge fore AMV First Strand cDNA Synthesis Kit (Invitrogen, USA) protokoll. Alle primere ble konstruert og syntetisert av Guangzhou RiboBio (RiboBio, Kina). Sanntids QRT-PCR ble utført i en 20 ul reaksjonsvolum på ABI Stepone pluss instrument (USA). Relativ miRNA ekspresjon ble evaluert ved bruk av to
-ΔΔCt fremgangsmåte og normalisert til ekspresjon av U6 liten RNA. Alle QRT-PCR ble utført i tre paralleller.
Cell transfeksjon
miRNA etterligne, hemmer og negativ kontroll ble utformet og kjemisk syntetisert av Guangzhou RiboBio (RiboBio, Kina). 24 timer før transfeksjon ble cellene sådd ut i 96-brønners plater med 5000 celler /brønn og dyrket i medium uten antibiotika. Etter celle vedlegg, ble transfeksjon utført ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) og Opti-Mem redusert serum media (Invitrogen, Carlsbad, California) i henhold til produsentens instruksjoner. Mediet ble erstattet 4-6h etter transfeksjon med nytt friskt medium. Cellene ble fremstilt for videre analyse 48 timer etter transfeksjon. Effektiviteten av denne liposom-mediert transfeksjon systemet ble dectected ved hjelp av Cy3-siRNA. Cy3-siRNA er en slags 21-25nt små RNA-molekyl, i likhet med miRNA inhibitor eller etterligner, og kan eksitere fluorescens ved bølgelengden 555 nm. Hovedtrinnene er som følger: Cellene ble utsådd i 24-brønners plater med 10.000 celler /brønn og transfekteres med Cy3-siRNA ved hjelp av Lipofectamine 2000 og Opti-Mem-medium. 24 timer etter transfeksjon, ble cellene observert under mikroskop fluorescens. Transfeksjonseffektiviteten ble presentert som forholdet mellom cellene observert under fluorescens for cellene observert under utstyrsleverandørene ligtht. Alle forsøk ble gjentatt tre ganger.
Celleviabilitet matrise
Etter transfeksjon ble cellene i 96-brønners plater eksponert for forskjellige konsentrasjoner av cisplatin. Celleformering ble bestemt ved en kolorimetrisk analyse ved hjelp av CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay kit (Promega, Madison, WI, USA). Etter 48 timer fra behandlingen, ble 20 ul av en løsning reagens tilsatt til hver brønn og inkubert i 3 timer ved 37 ° C. Absorbansen ved 490 nm bølgelengde ble målt ved anvendelse av mikroplateavleser (modell 680, Bio-Rad, USA). Hvert forsøk ble utført med gjentak av seks brønner og gjentatt tre ganger.
Semi-kvantitativ RT-PCR
Total RNA fra ubehandlede celler eller transfekterte celler ble isolert ved hjelp Trizol Reagens. RT-PCR ble utført ved hjelp av PrimeScript RT reagent Kit og Multiplex PCR analysesett i henhold til produsentens instruksjoner (Takara bioteknologi, Dalian, Kina). PCR produktene ble identifisert ved elektroforese med 1,5% agarosegel og registrert bruker Gel bildesystem (Bio-Rad, CA, USA). GAPDH RNA ble servert som en inngangskontroll.
Western blot analyse
Cellene ble vasket med 1 x PBS og lysert med RIPA buffer. Proteinkonsentrasjonen ble målt ved anvendelse av BCA-metoden. Deretter 20 ug protein ble anvendt for påvisning av P-gp og PTEN-protein, og GAPDH ble brukt som kontroll lasting. Mus monoklonalt anti-Pgp (fortynnet 1: 1000, Calbiochem, San Diego, CA, USA), anti-PTEN (fortynnet 1: 1000, Santa Cruz, Ca, USA) og anti-GAPDH (fortynnet 1: 50000, Kangchen, Shanghai , Kina) ble anvendt som primære antistoffer. Det sekundære antistoffet ble konjugert med pepperrot-peroksydase. De bundne antistoffer ble påvist ved anvendelse av ECL-kit. Nummer én programmet ble brukt til å kvantifisere proteinbåndet intensiteter.
Statistisk analyse
Data er presentert som gjennomsnitt ± SD. Forskjellen mellom middel ble analysert ved hjelp av Student t-test. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS 13.0 programvare (Chicago, IL, USA). P-verdier mindre enn 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant.
Resultater
Differensial uttrykt mirnas i A2780 /DDP i forhold til sin foreldre celle A2780
miRNA uttrykket profilen til eggstokkreft kreftcellelinje A2780s og A2780 /DDP ble oppdaget ved hjelp av miRNA utvalg i denne studien. Som vist i tabell 1, 32 mirnas (24 oppregulert, 8 nedregulert) ble funnet å være forskjellig uttrykt i A2780 /DDP-celler sammenlignet med dens parentale celler. Den potensielt mål gen av disse miRNAs ble spådd og oppført i tabell 1.
Sanntids QRT-PCR for 4 forskjellig uttrykt mirnas
Blant 32 forskjellig uttrykt mirnas, valgte vi 4 mirnas for videre studier. Resultatene av QRT-PCR viste at, i A2780 /DDP celler, uttrykket av MIR-374a, 130a, -182 ble henholdsvis økt med 2,06, 4,87, 1,28 folder og MIR-146a redusert med 133,56 ganger sammenlignet med A2780s celler (
p
0,05), som var i samsvar med microarray. (Fig 1)
Nivået på MIR-146a i A2780 /DDP var ekstremt lavt, kun utgjør 0,75 prosent av det i A2780s (**
p
0,05). Uttrykket av MIR-130a, -374a og MIR-182 var 4,8, 2,08 og 1,28 kaster høyere enn i A2780 celler (**
p
0,05, *
p
0.05) .Disse resultatene viste konsekvent uttrykk endringer oppdages av microarray.
MIR-130a og MIR-374a etterligner eller hemmere regulere cisplatin følsomhet i A2780 og A2780 /DDP
i denne studien har vi brukt liposomer for å megle transfeksjon av miRNA analoger. Så vi først oppdaget transfeksjonseffektiviteten. A2780 og A2780 /DDP-celler ble observert under fluorescens mikroskop etter 24 timers Cy3-siRNA transfeksjon. vi beregnet at A2780s og A2780 /DDP celler med rød fluorescens henholdsvis sto for 85% og 93%, noe som indictated at Liposome transfeksjon system kunne nå en høy effektivitet
Tre miRNA (MIR-374a,. – 130a, -182) etterligner og MIR-146a hemmer ble transfektert inn A2780 celler, for å se om de transfekterte cellene ville utvikler resistens mot cisplatin. Resultatene viste at A2780-celler transfektert med MIR-374a og MIR-130a ligner hadde en signifikant høyere overlevelsesevne enn kontrollgruppen under behandling av 0,8, 3,2 ug /ml cispaltin, men samme fenomenet ble ikke observert for MIR-182 etterligner og MIR-146a hemmer. (P 0,05, figur 2A).
(A) A2780-celler etter transfeksjon med MIR-130a-ligne og MIR-374a-mimic viste et øket forhold av overlevende celler etter behandling med 0,8, 3,2 ug /ml cispaltin (*
p
0,05). (B) MIR-130a-hemmer og MIR-374a-hemmer redusert forholdet overlevende celler under behandling på 8, 32 ug /ml cispaltin (*
p
0,05).
Vi videre tilført med MIR-374a og MIR-130a-hemmere i A2780 /DDP celler for å undersøke om de kan delvis reversere cisplatin motstand. Som vist i figur 2B, MIR-374a og MIR-130a-inhibitor betydelig forbedret cytotoksisiteten av cisplatin behandling, sammenlignet med den til kontrollgruppen (p 0,05).
MiR-130a regulere ekspresjonen av MDR1 og PTEN i A2780s og A2780 /DDP celler
Vi har undersøkt uttrykk for MDR1, PTEN mRNA og protein i A2780 og A2780 /DDP celler ved RT-PCT og western blot. Som vist i figur 3, MDR1 mRNA og P-gp-nivået i A2780 /DDP-celler var 2,33 og 1,88 ganger høyere enn den for i A2780 celler (P 0,05), mens ekspresjonen av PTEN-protein var ekstremt lav i både celle linjer og ekspresjon av PTEN mRNA og protein viste ingen signifikant forskjell mellom dem (P 0,05).
(A) MDR1 og PTEN mRNA-nivåer i A2780 og A2780 /DDP-celler. Ekspresjon av MDR1 mRNA ble overuttrykt i A2780 /DDP sammenlignet med A2780 (P 0,05), og PTEN mRNA nivå viste ingen forskjell (P 0,05). (B) P-gp og PTEN protein uttrykk nivåer i A2780s og A2780 /DDP celler. Ekspresjon av P-gp i A2780 /DDP-celler var høyere enn den til A2780 (P 0,05), og PTEN protein var på et meget lavt nivå i A2780 og A2780 /DDP-celler. (1,2: A2780, A2780 /DDP)
For å undersøke om MIR-130a kunne regulere PTEN og MDR1 uttrykk, tilsvarende etterligner og hemmere av de to mirnas ble transfektert inn A2780 og A2780 /DDP celler. PTEN, ble MDR1 mRNA og deres protein ekspresjon bestemt ved 48 timer etter transfeksjon. Som vist i figur 4, MIR-130a inhibering økte PTEN proteinnivåer og attenuert den expressio av MDR1 mRNA og P-gp (P 0,05), mens MIR-130a overekspresjon resulterte i opp-regulering av MDR1 mRNA og P-gp uttrykk i A2780 og A2780 /DDP celler (P 0,05) sikret uttrykk for PTEN mRNA endret seg ikke med behandling av MIR-130a hemmer og etterligner i begge cellelinjene (P 0,05).
(A1 , A2): PTEN og MDR1 mRNA i A2780 celler etter transfeksjon. MDR1 mRNA-nivået ble oppregulert ved Mir-130a ligner og nedregulert av MIR-130a inhibitor (P 0,01). (B1, B2): P-gp og PTEN protein i A2780 celler etter transfeksjon. Uttrykket av PTEN protein ble signifikant forhøyet Når celler ble behandlet med MIR-130a-I, uttrykket av P-gp ble oppregulert ved MIR-130-M og nedregulert av MIR-130a-I. (C1, C2): PTEN og MDR1 mRNA i A2780 /DDP-celler etter transfeksjon. Den regulerende effekt av MIR-130a på A2780 /DDP cellene var lik som A2780 celler. (D1, D2): P-gp og PTEN protein i A2780 /DDP celler etter transfeksjon. Effekten av MIR-130a var lik som A2780s celler. (1,2,3: MIR-130a-M, MIR-130a-I og MIR-NC; * p 0,05, ** p 0,01)
I sammendraget, fant vi 32 mirnas er forskjellig uttrykt i A2780 /DDP celler i forhold til sine foreldre celler ved miRNA array. Blant dem, en nedregulert miRNA (MIR-146a) og tre oppregulert mirnas (MIR-130a, -374a, -182) ble valgt for videre studier, og deres uttrykk ble validert konsekvent med miRNA array ved hjelp QRT-PCR. I transfeksjon eksperiment ble overekspresjon av MIR-130a og MIR-374a funnet å redusere følsomheten av A2780 og A2780 /DDP celler til cisplatin, og nedregulering av MIR-130a og MIR-374a uttrykk utøves motsatt effekt. Resultatene av RT-PCR og western blot viste at MIR-130a kan positivt regulere mRNA og protein ekspresjon av MDR1 og negativt regulerer PTEN-proteinet, noe som kan være en av mekanismene for MIR-130a rolle i chemoresistance.
diskusjon
Selv om platina-basert kjemoterapi har mye bedre prognose av kreft i eggstokkene, fortsatt resistens som den viktigste hindringen for vellykket behandling [3]. Nylig mirnas ble rapportert å være forskjellig uttrykt i resistente kreftformer og kunne regulere legemiddelresistens [16,17].
I denne studien fant vi at 32 mirnas ble forskjellig uttrykt i A2780 /DDP sammenlignet med A2780. Interessant, noen av disse miRNAs har blitt bekreftet å være involvert i chemoresistance. For eksempel, MIR-27a var oppregulert i A2780 /Taxol celler og knockdown av MIR-27a forbedret paclitaxel følsomhet [18]. Takiuchi [19] rapporterte at MIR-181 reduserte følsomhet for kreft i bukspyttkjertelen celle til gemcitabin gjennom aktivering av NF-kB ved CYLD inhibering. Vår tidligere studie fant også MIR-130a var knyttet til cisplatin-motstand i SKOV3 celler. Dataene av microarray viste at i A2780 /DDP uttrykk for MIR-146a var ekstremt lavt, og MIR-130a, -374a, -182 ble oppregulert. I tillegg MIR-130a rolle i cisplatin motstand av A2780 celler og om MIR-146a, -374a, kan -182 regulere legemiddelresistens har ennå ikke rapportert, så vi velger disse fire mirnas for videre studier. Disse fire mirnas uttrykk ble verifisert ved QRT-PCR, noe som tyder på at microarray hadde en høy nøyaktighet.
I transfeksjonsagensene eksperimenter, fant endring av MIR-130a og MIR-374a uttrykk kan forandre graden av cisplatin motstand i A2780 og A2780 /DDP. Flere undersøkelser har vist at Mir-130a fungerte som kjemoresistent regulator. Oppregulering av MIR-130a kan påvirke doxorubicin motstand i brystkreft [20], og MIR-130a indusert motstand av leverkreft celle til cisplatin ved nedregulering av tumor-suppressor-gen RUNX3 [21]. I vår tidligere studie [15], MIR-130a ble overexpressed i SKOV
3 /DDP celler, og hemming av MIR-130a kan delvis gjenopprette cisplatin følsomhet, som var forenlig med ovennevnte studien.
Foreløpig noen få studier som fokuserer på rollen til MIR-374a i svulsten, som påpekte at Mir-374a ble overexpressed i osteosarkom [22] og tykktarmskreft [23]. Dessuten ble MIR-374a involvert i svulsten genesis og metastasering av brystkreft ved å regulere Wnt /catenin vei [24]. Så langt er det ingen rapporter om rollen til MIR-374a i legemiddelresistens. Her fant vi at Mir-374a ble oppregulert i cisplatin-resistente celler, og redusere dens uttrykk kan gjøre cellene mer følsomme for cisplatin, mens upregulating sitt uttrykk i A2780s hatt motsatt effekt.
Derfor vurderte vi at overuttrykk av MIR-130a og MIR-374a kan bidra til utvikling og regulering av cisplatin motstand i eggstokkreft celler. Hemme uttrykket av MIR-130a og MIR-374a kan være en ny tilnærming for å overvinne resistens i eggstokkreft. Som et resultat, har vi også utført RT-PCR og western blot for å finne mekanismen av MIR-130a regulerende effekt på legemiddelresistens.
Vår studie fant uttrykk for MDR1 mRNA og dets proteinprodukt P-glykoprotein (P -gp) nivåer i A2780 /DDP var signifikant høyere enn i A2780s, noe som tyder på at over-ekspresjon av MDR1 gen kan være en mekanisme for legemiddelresistens dannelse i A2780 /DDP-celler. P-gp er en ATP-avhengig pumpe membran som transporterer medikamentet ut av celler, noe som resulterer i multiresistens [25]. Rikelig med bevis indikerte at mirnas var assosiert med P-gp-mediert legemiddelresistens i mange kreftformer. For eksempel, MIR-451 vant doxorubicin motstand ved downregulating P-gp uttrykk i doksorubicinresistente brystkreft cellelinjer MCF-7 /ADR [26]. Hemming av MIR-27a forbedret paclitaxel følsomhet i A2780 /Taxol ved å modulere MDR1 /P-glykoprotein uttrykk [18]. Vi konkluderte med at å hemme uttrykket av MIR-130a resulterte i ned-regulering av MDR1 mRNA og P-gp. Dette resultatet er i tråd med våre tidligere eksperimenter.
Vi fant også at Mir-130a negativt regulert ekspresjon av PTEN protein. PTEN-proteinet er en dobbel spesifisitet fosfatase som kan blokkere cytokin-mediert signaltransduksjonsveier, deretter hemme celleproliferasjon, invasjon og metastase og fremme apoptose [27]. I en rekke av maligne tumorer inkludert kolorektal cancer, brystcancer, leukemi, eggstokkreft etc, PTEN genet og proteinet har forskjellige grader av delesjon eller nedregulering [27,28]. Det har blitt rapportert at PTEN protein kan bidra til stoffet følsomhet ved å undertrykke PI3K /Akt vei, og tjene som mål gen av mange mirnas som MIR-21, MIR-22 og MIR-222 [29,30]. I dette eksperimentet, ekspresjon av PTEN protein i A2780s og A2780 /DDP-celler var ekstremt lav, og hadde ingen signifikant forskjell mellom disse to cellelinjene. Antatte også at gjenopprettelse av PTEN ekspresjonen kan være en av mekanismene for kjemosensitivitet økning av eggstokkreft celler. Imidlertid, A2780 og A2780 /DDP-celler transfektert med MIR-130a-inhibitoren ikke utsettes for høyere celleaktivitet hemming sammenlignet med kontrollgruppene under behandlingen av lav-dose cisplatin (0.2ug /ml og 2UG /henholdsvis ml), beregnet vi årsaken til dette fenomen er at PTEN-mediert celle apoptose blant annet er avhengige av celleskade ved cisplatin, og de har en synergistisk effekt. Bare en liten mengde av celler bearbeidet til apoptose eller dødsfall i dette lav-dose av cisplatin, og hemming av cellevekst mediert av PTEN ikke har tilstrekkelig evne til å gjøre en betydelig forskjell mellom forsøks- og kontrollgrupper. Interessant, fant vi at Mir-130a ikke regulere PTEN mRNA uttrykk likeså PTEN protein, noe som tyder på at MIR-130a kan regulere PTEN genet transkripsjon ved post-translasjonell nivå ved ufullstendig binder seg til 3′-utranslaterte område (3′-UTR ) av PTEN mRNA.
PicTar andTargetScan programvare spår at de potensielle målgener av MIR-374a omfatter akt3, ABI1, PDCD6, ABCC5 og så videre. Blant dem har ABI1 vist seg å være assosiert med inhibisjon av cellevekst og proliferasjon [31], som kan være en av regulatoriske mekanismer MIR-374a på cisplatin motstand, men, gjenstår det å ytterligere bekreftet ved expriments.
Nylig har Xiang et al. [32] rapporterte at MIR-152 og MIR-185 var signifikant nedregulert i SKOV3 /DDP og A2780 /DDP-celler, sammenlignet med deres følsomme moder linje SKOV3 og A2780, og opp-regulerer uttrykk for MIR-152 eller MIR-185 økt cisplatin følsomheten SKOV3 /DDP og A2780 /DDP celler ved å undertrykke DNA metyltransferase 1 (DNMT1) direkte. Inkonsekvent, MIR-152 og MIR-185 (redusert med 0,4 og 0,6 ganger i A2780 /DDP celler sammenlignet med A2780 celler i Xiang studie) ble funnet å være opp- eller nedregulert i mindre enn to ganger i A2780 /DDP celler sammen med A2780 celler, slik at disse mirnas ikke var oppført som mirnas av interesse. Imidlertid bør vi være klar over at miRNA matrise er en foreløpig screening test hvis resultatene trenger ytterligere validering eksempel ved QRT-PCR, og mindre enn to ganger forskjellig uttrykt mirnas kan også ha effekt på legemiddelresistens av eggstokkreft.
i konklusjonen, denne studien viser at forskjellig uttrykt mirnas i cisplatin-resistent eggstokkreft celler trolig spille en viktig rolle i utviklingen eller regulering av cisplatin motstand. Videre transfeksjon med MIR-130a og MIR-374a hemmere forsterket den cytotoksiske effekten av cisplatin. Rollen MIR-130a i legemiddelresistens ble oppnådd i det minste delvis ved å regulere uttrykket av P-gp og PTEN protein. PTEN kan være et mål gen av MIR-130a, men det er behov for validering av doble luciferasepreparater rapporter. Disse resultatene tyder på at Mir-130a og MIR-374a kan være lovende som nye terapeutiske mål for å overvinne resistens.
Takk
Denne studien ble støttet av Program for Changjiang Scholars og nyskapende forskning team (PCSIRT) i University (IRT0935), og den lokale Foundation of Science and Technology Department of Chengdu (No. 11DXYB133SF-027).
