Abstract
ATP-bindende kassett (ABC) transportører er assosiert med dårlig respons på kjemoterapi, og gi en dårlig prognose i forskjellige maligniteter. Men sammenhengen mellom uttrykket av ABC sub-familien G-medlem 4 (ABCG4) og prognose hos pasienter med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er fortsatt uklart. NSCLC vevsprøver (n = 140) og prøvene normalt lungevev (n = 90) ble resected fra pasienter med stadium II til IV NSCLC mellom mai 2004 og mai 2009. ABCG4 mRNA og protein uttrykk ble påvist ved RT-PCR, western blot, og immunhistokjemi. Pasientene fikk fire sykluser av cisplatin-basert post-kirurgi kjemoterapi og ble fulgt opp til 31. mai
st, 2014. ABCG4 positivitet hastigheten var høyere i NSCLC enn i normale lunge vev (48,6%
vs
. 0 %,
P
0,001) og ABCG4 uttrykk var signifikant assosiert med dårlig differensiering, høyere tumor metastaser (TNM) scenen, og adenokarsinom histologisk type (alle
P
0,001). Univariate (HR = 2,284, 95% KI: 1,570 til 3,324,
P
0,001) og multivariate (HR = 2,236, 95% KI: 1,505 til 3,321,
P
0,001 ) analyser viste at ABCG4 uttrykk var en selvstendig faktor assosiert med dårlig prognose i NSCLC. Pasienter med ABCG4-positiv NSCLC hadde kortere median overlevelse enn ABCG4-negative NSCLC (20,1
vs
43,2 måneder,
P
. 0,001). Den prognostiske betydningen av ABCG4 uttrykk var tydelig i etapper III og IV NSCLC. Avslutningsvis ble høy ABCG4 uttrykk forbundet med dårlig prognose hos pasienter med NSCLC behandlet med cisplatin-basert kjemoterapi
Citation. Yang G, Wang XJ, Huang LJ, Zhou YA, Tian F, Zhao JB, et al. (2015) High ABCG4 Expression er assosiert med dårlig prognose i Non-småcellet lungekreft pasienter behandlet med cisplatin-basert kjemoterapi. PLoS ONE 10 (8): e0135576. doi: 10,1371 /journal.pone.0135576
Redaktør: Gergely Szakács, ungarske Academy of Sciences, UNGARN
mottatt: 29 oktober 2014; Godkjent: 23 juli 2015; Publisert: 13 august 2015
Copyright: © 2015 Yang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (bevilgning nr 81172224). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
om 1,5 millioner nye tilfeller av lungekreft er diagnostisert årlig over hele verden, og ca 85% av dem er ikke-småcellet lungekreft (NSCLCs) [1]. I 2012, omtrent 58% av tilfellene av NSCLCs skjedde i de mindre utviklede land [2]. Kirurgi er ansett for å være det beste behandlingsalternativet, men reseksjon er bare potensielt kurativ for 20-25% av svulster [1]. De fleste pasienter vil presentere med en uhelbredelig sykdom og står overfor en 5-års relativ overlevelse på 17% med dagens standardbehandling [3]. Postoperativ kjemoterapi med eller uten strålebehandling, forbedrer overlevelsen med 4% i forhold til absolutt 5-års overlevelse, som demonstrert av en meta-analyse [4].
Foreløpig cisplatin-basert kombinasjonskjemoterapiregimer er mest effektive første-linje terapi for behandling av NSCLC, ifølge National Comprehensive Cancer Network (NCCN) retningslinjer (versjon 4,2014) [5]. Imidlertid er effekten av kjemoterapi begrenset, med responsrater (RR) av 20-35%, progresjonsfri overlevelse (PFS) på 3.1-5.5 måneder, og total overlevelse (OS) 7.4-11.3 måneder [6,7]. Følgelig har bedre resultater etter kjemoterapi vært en av de mest utfordrende spørsmålene i vellykket behandling av lungekreft [8]. Dette er først og fremst knyttet til resistens, noe som skjer i nesten alle kreftformer og er et alvorlig hinder for å lykkes med kjemoterapi [6,7]. Det er i økende grad anerkjent som primære og sekundære narkotikamotstander utviklings i kreftceller er de mest grunnleggende årsaken liggende kjemoterapi svikt [6,7].
Drug motstand er vanligvis et resultat av over-uttrykk for ATP-bindende kassett (ABC) transportører [9,10]. ABC transportørproteiner er optimale kandidater som biomarkører for prediksjon av kjemoterapi motstand og prognose etter kjemoterapi [11,12]. ABC-transportører er transmembrane proteiner som fremmer translokasjon av heterogene substanser på tvers av cellemembraner ved å utnytte den energi av ATP-hydrolyse [13]. Hittil har minst 48 mennesker ABC transporter gener er identifisert, og de har blitt delt inn i syv underfamilier (ABCA gjennom ABCG) [14]. Blant disse ABCA2, ABCB1 (også kjent som P-glykoprotein eller multiresistens 1 (MDR1)), ABCB4, ABCB11, ABCC1-6, ABCC10, ABCC11, og ABCG2 (også kjent som BCRP eller MXR) har alle vist seg å være i forbindelse med utstrømningen og transport av cytotoksiske medikamenter (strukturelt forskjellige kjemoterapeutiske midler, og deres metabolitter) fra lungekreftceller, og dermed redusere intracellulære konsentrasjon av legemidlet [15]. ABCA1 har også blitt identifisert som formidling legemiddelresistens i lungekreft og multiresistent lungekreft cellelinjer [16]. Foreløpig er P-gp (ABCB1), MRP1 (ABCC1), og ABCG2 anses å være det viktigste stoffet transportører for sine roller i multiresistens observert i mange svulster og cellelinjer [17]. Selv om oppdagelse og bruk av inhibitorer for ABC-tilhengere har blitt undersøkt i løpet av de siste årene, disse hemmere var ikke helt vellykket i å overvinne resistens [18]. Som et resultat, er identifisering av nye ABC-transportørproteiner medikament og undersøkelse av deres mekanismer og inhibitorer høyt garantert og ekstremt viktig å vurdere nye mål for å overvinne resistens.
Flere studier har vist at medlemmer av ABCG ( eller hvit) underfamilien er assosiert med mobilnettet lipid transport og narkotika motstand [19-21]. ABCG5 og ABCG8 er sterkt uttrykt i epitelcellene i tarmen og sannsynligvis virke som en heterodimer; de har vært forbundet med utstrømningen av plantesteroler og kolesterol til galle [22,23]. Over-ekspresjon av ABCG2 fører til motstanden av forskjellige kreftcellelinjer til anti-tumor medikamenter [24]. ABCG4 er det fjerde medlemmet av «G» familie, og ligger på kromosom 11q23.3. Dette genet koder for et 3874-bp transkripsjon, og dens ekspresjon er hovedsakelig intracellulær [25], men den eksakte intracellulær lokalisering er ennå ikke vist [26]. Faktisk kan de forskjellige ABC-transportører være lokalisert i cellemembranen, på mitokondrier, i Golgi-apparatet, i det endoplasmatiske retikulum, eller i kjernemembranen, hvor de deltar i forskjellige cellulære prosesser [26]. Videre, ifølge tidligere studier [27-30], forblir ABCG4 uttrykk i NSCLC uklart. Tidligere studier har vist at ABCG1 og ABCG4 er ansvarlig for transporten av kolesterol på high density lipoprotein (HDL) partikler [31,32], og over-uttrykk for ABCG4 gir også motstand mot alkyl-fosfolipid-analoger (miltefosine, edelfosine, og perifosine ) i
Leishmania product: [33]. Men om ABCG4 spiller en betydelig rolle i prognosen etter kjemoterapi, og om den har potensial funksjon av medierlegemiddelresistens i lungekreft også fortsatt uklare. Derfor denne studien fokusert på å forstå uttrykk og etter kjemoterapi prognostisk verdi av ABCG4 i NSCLC.
I denne retrospektive studien undersøkte vi uttrykket av ABCG4 i NSCLC. Vi vurderte også verdien av ABCG4 protein for å forutsi overlevelse hos NSCLC pasienter behandlet med cisplatin-basert kombinasjonskjemoterapi.
Materialer og metoder
Pasienter og prøver
Totalt 140 vevsprøver (74 tilfeller av lunge plateepitelkarsinom og 66 tilfeller av lunge adenokarsinom) og 90 prøver normale lungevev NSCLC (plassert 5 cm fra primærsvulster) oppnådd ved kirurgisk reseksjon ved Institutt for Thoracic Surgery, Tang Du Hospital Affiliated til fjerde Military Medical University (Xi’an, Kina) mellom mai 2004 og mai 2009, ble undersøkt i denne studien. Tumor og normal lunge vev ble høstet ved hjelp av sterile kirurgiske instrumenter
Pasientene var i alderen 45-76 år (gjennomsnitt ± SD: 60.76 ± 6.88 år).. Alle prøver ble gjennomgått av patologer, og histologisk klassifisering av svulster ble utført i henhold til Verdens helseorganisasjon kriterier. Svulster ble klassifisert som trinn II (n = 42), III (n = 56) eller IV (n = 42) i henhold til de retningslinjer NCCN (Version 4,2014) [5]. Clinicopathological karakteristikk av alle pasienter ble registrert. Ingen pasienter hadde fått cellegift, strålebehandling, biotherapy, eller andre operasjoner før lungekreft kirurgi. Alle pasientene ble behandlet med cisplatin-basert kombinasjons kjemoterapeutiske regimer anses som standard postoperative regimer for NSCLC [5]. Alle pasientene fikk fire sykluser av cisplatin-basert kombinasjons kjemoterapeutiske regimer (cisplatin 75 mg /m
2 dag 1 + gemcitabin 1250 mg /m
2 dager 1, 8, hver 21 dager /pemetrexed 500 mg /m
2 dag 1 hver 21 dager /docetaxel 75 mg /m
2 dag 1 hver 21. dag). Oppfølging ble sensurert 31. mai
st, 2014, med en total oppfølgingsperiode på 60 måneder. Dagen da kjemoterapi startet ble ansett som utgangspunkt for beregning av postoperativ overlevelse
Alle prøver ble delt i to deler:. Den første del ble plassert i en 0,1% dietylpyrokarbonat (DEPC) vann ble behandlet med iskaldt rør og lagret ved -80 ° C; den andre delen ble fiksert i 10% nøytral bufret formalin og deretter dehydrert for parafin innebygging.
Studien protokollen ble godkjent av Regional etisk komité for klinisk forskning i den fjerde Military Medical University. Alle pasienter gitt skriftlig informert samtykke for bruk av deres journaler og prøver vev for forskningsformål.
Revers transkriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR)
Frosne vevsprøver (100 mg) ble høstet og malt til et fint pulver. A549 celler ble stabilt transfektert med pcDNA3.1 vektor som inneholder ABCG4 (Takara Bio, Otsu, Japan) ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, USA), i henhold til produsentens protokoll. Celler ble utsådd i 6-brønners plater, og DNA-plasmider og transfeksjon av reagens ble tilsatt 24 timer senere. Transfekterte A549-celler ble dyrket i nærvær av G418 (400 mg /ml; Life Technologies Co., Grand Island, NY, USA). G418-resistente celler (A549-ABCG4) ble plukket for RT-PCR-analyse.
RNA ekstraksjon ble utført ved hjelp av Total RNA Kit I (Omega, Norcross, GA, USA). Konsentrasjonen og renheten av RNA-prøvene ble bestemt ved anvendelse av absorbansen ved 260 og 280 nm (A260 /280) ved hjelp av spektrofotometri (Beckman DU800, Beckman Coulter Inc., Brea, CA, USA).
cDNA-syntese ble utført ved anvendelse av en revers transkripsjon kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ved anvendelse av tilfeldig heksamer primer, og RevertAid M-MuLV revers transkriptase. PCR amplifisering ble utført med 2 × Taq Mastermix (CWBio, Beijing, Kina). Innledende denaturering ble gjennomført ved 95 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 30 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 35 s, annealing ved 51 ° C i 35 s, og forlengelse ved 72 ° C i 35 s, med en endelig forlengelse ved 72 ° C i 5 minutter (tabell 1). PCR produktene ble analysert på 2% agarosegel ved hjelp av en gel imager (Alpha Innotech, Santa Clara, CA, USA).
Western blot analyse
Frosne vevsprøver (100 mg) ble kuttet i små stykker og homogenisert i en radioimmunopresipitasjonsanalyse assay (RIPA) buffer [1 x PBS, 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS), 1% Nonidet P-40, 0,5% natriumdeoksykolat, 10 ug /ml leupeptin, 100 ug /ml p-aminophenylmethylsulfonyl fluorid (p-APMSF) og 10 ug /ml aprotinin] på is i 1 time, og sentrifugeres ved 14.000 x
g
i 30 minutter. A549-ABCG4 cellene ble lysert med RIPA-buffer på is i 1 time og sentrifugert ved 14000 x g i 30 min. Supernatanten ble deretter høstet, og proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved anvendelse av bicinchoninic syre (BCA) proteinanalyse. Protein Lysatene (50 ug) ble separert ved 12% SDS-polyakrylamidgel-elektroforese (PAGE) og overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner ved 2,5 mA /cm
3 i 30 min. Membranene ble blokkert med 5% skummet tørrmelk i 1 time ved romtemperatur og inkubert med primære antistoffer (anti-ABCG4 kanin-polyklonalt antistoff, 1: 1000, Proteintech, Chicago, IL, USA; og anti-β-actin kanin monoklonalt antistoff 1: 1000, CW Bio, Beijing, Kina) ved 4 ° C over natten. Membranene ble deretter vasket med TBST-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl og 0,1% Tween-20), og deretter inkubert med sekundært antistoff (geite-anti-kanin-antistoffer, 1: 5000, CW Bio, Beijing , Kina) ved 37 ° C i 1 time, etterfulgt av fargefremkalling med Milipore kromogene kit for Western blot (Billerica, MA, USA) og observasjon under et kjemiluminescens-analysator (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
Immunohistochemistry
parafininnstøpte vev ble kuttet i 3-5-mikrometer seksjoner for awoksing og rehydrering. Immunhistokjemi ble utført etter mikrobølgeoppvarmingen baserte antigen gjenfinning i 0,1 M citratbuffer (pH = 6,0) etterfulgt av inkubasjon med 3% H
2o
2 ved romtemperatur i 30 min, 10% geiteserum ved romtemperatur i 30 min, primære antistoff (anti-ABCG4 kanin-polyklonalt antistoff, 01:40, Proteintech, Chicago, IL, USA) over natten ved 4 ° C, biotin-merket sekundært antistoff (Bio CW, Beijing, Kina) ved romtemperatur i 30 min , og nyfremstilt 3,3′-diaminobenzidin (DAB) for fargeutvikling i 5 min. Seksjonene ble deretter skylles grundig med vann, re-farget med hematoxylin, dehydrert, ryddet i xylen og montert med et dekkglass. Spesifisiteten av anti-ABCG4 antistoffet ble testet ved hjelp av ABCG4-blokkerende peptider (1: 200; sc-34874, i Santa-Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). De blokkerende peptider ble tilsatt til objektglassene og inkubert over natten ved 4 ° C. Deretter ble det primære antistoff tilsatt og avdekket, som beskrevet ovenfor.
Prøvene ble klassifisert som «positiv» når den cellulære membran og /eller cytoplasma var farget brun. Fem høy effekt felt (400 ×) ble tilfeldig valgt, og hvert lysbilde ble vurdert uavhengig av to erfarne patologer blindet for de kliniske data. Fosfatbufret saltoppløsning (PBS), i stedet for det primære antistoff, ble brukt som en blank kontroll.
Prøvene ble bedømt i henhold til fargeintensitet og prosentandelen av positive celler. Resultatene ble scoret basert på følgende kriterier: a) prosentandelen av positive celler (≤5%: 0; 6-25%: 1; 26-50%: 2; 51-75%: 3; og 75% : 4); b) den fargeintensitet (ingen farge: 0; gul: 1; brun: 2, og tan: 3); og c) de to karakterene ble multiplisert sammen og prøver ble tildelt en av 4 nivåer: 0: negativ (-); 1-4: svakt positiv (+); 5-8: moderat positive (++); 9-12: sterkt positiv (+++) [34]. For multivariat analyse og sammenligning med overlevelseskurver, -ble definert som negative, og +, ++ og +++ ble alle definert som positiv.
Statistisk analyse
Statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS 18.0 (IBM, Armonk, NY, USA). Sammenhenger mellom immunhistokjemisk uttrykk og kliniske variabler ble evaluert av Mann-Whitney U eller Kruskal-Wallis H test, som passer. Total overlevelse ble målt fra starten av kjemoterapi til datoen for død av enhver årsak eller datoen pasienten var siste anses å være i live. Overlevelseskurver ble anslått av Kaplan-Meier-metoden, og sammenlignet med log-rank test. Den Cox modellen ble brukt for univariate og multivariate analyser. Korrelasjoner ble vurdert ved hjelp av Spearman rank korrelasjonsanalyse. Rang korrelasjonskoeffisienter ble uttrykt som
r
s. 0.0≤
r
s
0,1 ble ansett som uncorrelated; 0.1≤
r
s
0,3 ble ansett som svakt korrelert; 0.3≤
r
s
≤0.5 ble ansett som moderat korrelert;
r
s
0,5 ble ansett som et sterkt korrelert. Tosidig
P
-verdier. 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
ABCG4 mRNA og protein uttrykk i NSCLC og normal lunge vev
For å undersøke ABCG4 mRNA-ekspresjon i NSCLC og prøvene normale lungevevet, RT-PCR ble utført på mRNA isolert fra NSCLC vev (n = 14) og normale lunge vev (n = 2). Påvisning av en 383-bp PCR-produkt som tilsvarer ABCG4 mRNA ble observert i NSCLC-vev (fig 1B), mens ingen slike bånd ble observert hos normale lunge vev (figur 1A). Amplifikasjon av β-aktin (416 bp) ble klart observert i begge typer vev (figur 1).
β-aktin ble benyttet som intern referanse. M: markør. (A) Felt 1: positiv kontroll (A549-ABCG4). Banene 2-3: normal lunge-vev (NORM) (n = 2); (B) NSCLC vev (NSCLC) (n = 14, baner 1-14).
For å undersøke ABCG4 protein uttrykk i NSCLC og normal lunge vev, ble utført western blot analyse i settet av prøver anvendt for RT-PCR. ABCG4 proteinekspresjon (60 kDa) ble observert i NSCLC-vev (Fig 2B og S1 Fig), men ikke i normale lunge vev (figur 2A). β-aktin (43 kDa) ble anvendt som en normaliseringskontroll og ble observert i begge typer vev (Fig 2 og Fig S1).
kompBlotTene ble vist i fig S1 β-aktin (43 kDa) var anvendt som en intern referanse. (A) Felt 1: positiv kontroll (A549-ABCG4). Banene 2-3: normal lunge-vev (NORM) (n = 2); (B) NSCLC vev (NSCLC) (n = 14, baner 1-14).
Resultatene indikerte at ABCG4 mRNA og proteinuttrykk var åpenbart forskjellig mellom NSCLC og normal lunge vev.
Expression of ABCG4 protein i NSCLC og normal lunge vev ved immunhistokjemi
for å undersøke videre uttrykk for ABCG4 protein i NSCLC, immunhistokjemi ble utført på NSCLC (n = 140) og normal lunge vev prøver (n = 90) (fig 3). Ingen ABCG4 uttrykk ble sett i de normale vevsprøver (fig 3A). Noen av NSCLC-prøvene viste også ingen uttrykk (-) (figur 3B), mens andre prøver var svakt positiv (+) (figur 3C), moderat positiv (++) (figur 3D) eller sterkt positiv for ABCG4 (++ +) (figur 3E). ABCG4-negative farging ble viste i NSCLC vevsprøver (++) ved hjelp ABCG4 blokkerer peptid (figur 3F). Basert på immunhistokjemi, ble ABCG4 ekspresjon detektert i 48,6% av tilfellene NSCLC (68/140, 40 +, 23 ++ og +++ 5), og ble ikke påvist i noen av de 90 lunge vevsprøver normale (
P
. 0,001) (tabell 2)
(A) Normal lungevev; (B) Negativ (-) farging av ABCG4 i NSCLC vev; (C) Svakt positiv (+) farging av ABCG4 i NSCLC vev; (D) Moderat positive (++) farging av ABCG4 i NSCLC vev; (E) Sterkt positiv (+++) farging av ABCG4 i NSCLC vev; (F) Immunhistokjemi viser ABCG4-negativ farging i NSCLC-vev (++) ved hjelp av ABCG4 blokkerer peptid. Forstørrelse:.. 200 ×
Disse resultatene antydet at ABCG4 ble uttrykt i NSCLC vev, og at det ikke ble uttrykt i normale lungevev
Sammenhengen mellom ABCG4 uttrykk og clinicopathological egenskaper hos pasienter med NSCLC
Etter å ha observert at ABCG4 ble overuttrykt i nesten halvparten av vevsprøver NSCLC, sammenhengen mellom ABCG4 uttrykk og egenskapene til de pasienter ble undersøkt. Det var ingen signifikant sammenheng med kjønn, alder, eller røykevaner (alle
P
0,05). Men høy ABCG4 uttrykk var signifikant korrelert med lunge adenokarsinom (53,0%) i stedet for lunge plateepitelkarsinom (44,6%) (
P
0,001), i dårlig (55,2%) i stedet for godt /moderat ( 42,5%) differensiert NSCLC (
P
= 0,008), og med økende tumormetastaser (TNM) stadium II, III og IV (31,0%
vs
. 53,6%
vs
59,5%, henholdsvis) (
P
0,001) (tabell 3). Videre ABCG4 uttrykk nivåer ble svakt positivt korrelert med den økende TNM stadium (
r
s
= 0,210,
P
= 0,013) (data ikke vist) .
Disse data antydet at ABCG4 uttrykket var forbundet med tumor differensiering, TNM stadium og histologisk type, og at ABCG4 uttrykk nivåer ble positivt assosiert med TNM stadium.
Association mellom ABCG4 uttrykk og overlevelse av NSCLC pasienter behandlet med cisplatin-basert kjemoterapi
for å undersøke forholdet mellom ABCG4 uttrykk og det kliniske utfallet av NSCLC pasienter behandlet med cisplatin-basert kjemoterapi, univariate og multivariate analysene ble utført ved hjelp av Cox modell for å bestemme hvorvidt den prognostiske verdi av ABCG4 var uavhengig av andre faktorer. I univariat analyse, kjønn, røyking vane, alder og histologi ikke påvirke prognosen (alle
P
0,05). ABCG4 uttrykk (hazard ratio [HR]: 2,284), høy TNM stadium (HR: 3,124), og dårlig differensiering (HR: 1,869) var signifikant assosiert med dårlig prognose (tabell 4). Videre faktorer som var assosiert med en
P
-verdi 0,05 i univariat analyse ble inkludert i en multivariat analyse. Resultatene viste at, i tillegg til TNM stadium (HR: 3,098) og differensiering (HR: 1,811), ABCG4 uttrykk var en uavhengig prognostisk faktor for overlevelse av pasienter med NSCLC. Den ABCG4-positiv verdi for OS ga en HR på 2,236 (tabell 4). Disse resultatene indikerte at ABCG4 ekspresjon var en negativ prognostisk faktor i pasienter med NSCLC behandlet med cisplatin-kjemoterapi.
OS-kurver er vist i figur 4, i henhold til den ABCG4 uttrykket status. Median overlevelse var 43,2 og 20,1 måneder hos pasienter med ABCG4-negative og ABCG4-positiv NSCLC, henholdsvis (
P
0,0001, figur 4A). Median overlevelse var 54, 32 og 14,15 måneder hos pasienter med trinn II, III, og IV NSCLC, henholdsvis (
P
0,0001, figur 4B). Median overlevelse var 39,5 og 25,2 måneder hos pasienter med godt /moderat og dårlig differensiert NSCLC, henholdsvis (
P
= 0,0008, figur 4C). Median overlevelse i ABCG4-negative gruppen var 39,5 måneder, sammenlignet med 21.05 måneder i ABCG4-positive gruppen i stadium III (
P
= 0,0002, figur 4E). Videre median overlevelse i ABCG4-negative gruppen var 31,9 måneder, sammenlignet med 13,8 måneder i ABCG4-positive gruppen i stadium IV (
P
= 0,0226, figur 4F). Imidlertid median overlevelse i ABCG4-negative gruppe var 54,2 måneder, sammenlignet med 50,1 måneder i ABCG4-positive gruppen i trinn II, og det var ingen signifikant forskjell i OS forhold til ABCG4 uttrykket (
P =
0,8127, figur 4D).
(A) Kaplan-Meier-kurver ble plottet for å bestemme kumulativ overlevelse av NSCLC pasienter basert på ABCG4 uttrykket (negativ
vs
. positiv). (B) Kaplan-Meier-kurver ble plottet for å bestemme kumulativ overlevelse av NSCLC pasienter basert på tumormetastaser (TNM) trinn (II
vs
. III
vs
IV.). (C) Kaplan-Meier-kurver ble plottet for å bestemme kumulativ overlevelse av NSCLC pasienter basert på differensiering (dårlig
vs
. Moderat /godt). (D) Kaplan-Meier-kurver ble plottet for å bestemme kumulativ overlevelse av NSCLC pasienter med TNM stadium II basert på ABCG4 uttrykket (negativ
vs
. Positiv). (E) Kaplan-Meier-kurver ble plottet for å bestemme kumulativ overlevelse av NSCLC pasienter med TNM stadium III basert på ABCG4 uttrykket (negativ
vs
. Positiv). (F) Kaplan-Meier-kurver ble plottet for å bestemme kumulativ overlevelse av NSCLC pasienter med TNM stadium IV basert på ABCG4 uttrykket (negativ
vs
. Positiv). Negativ:-; Positiv: +, ++ og +++
Diskusjoner
Det er allerede etablert som ABC transportører er involvert i MDR og har en effekt på effekten av kjemoterapiregimer [. ,,,0],11,12]. Hensikten med denne studien var å undersøke ABCG4 og dens uttrykk i NSCLC for å vurdere om det er en sammenheng mellom ABCG4 uttrykk og pasientenes utfall etter kjemoterapi. I denne studien vi gitt solid bevis for ABCG4 mRNA og protein ekspresjon i noen prøver av NSCLC-vev, men ikke i noen av de vanlige lungevev. Videre ble ABCG4 uttrykk forbundet med ulike grader av differensiering, TNM stadium, og histologisk type. Univariate og multivariate analyser antydet at TNM stadium, differensiering og ABCG4 uttrykk var uavhengige faktorer involvert i prognosen i denne populasjonen av NSCLC pasienter behandlet med cisplatin-basert kjemoterapi. Resultatene antydet en dårligere overlevelse hos pasienter med ABCG4-positiv NSCLC behandlet med cisplatin-basert kjemoterapi.
ABCG4 uttrykk var betydelig høyere hos NSCLC vevsprøver sammenlignet med normal lunge vevsprøver. Videre ble ABCG4 uttrykk forbundet med ulike grader av differensiering, TNM stadium, og histologisk type. Tidligere studier har vist at til tross for likheter i sekvens, struktur og funksjon av MDR mellom ABCG2 (BCRP) og ABCG4 er ABCG2 ikke forbundet med kjønn, røyking historie, performance status (PS), histologisk type, og TNM stadium i NSCLC [35 , 36], mens vi observerte sammenhenger mellom ABCG4 og histologisk type differensiering klasse, og TNM stadium. En forklaring kan være at spesifisitet og mangfold av sekvens og struktur mellom ABCG familien transporter gener bidrar til dette avviket. I tillegg, ekspresjon av ABC-transportørproteiner underfamilien variere med kliniske variabler; for eksempel, er ABCB1 uttrykk betydelig høyere hos kvinner enn hos menn, og høyere i ikke-plateepitelkarsinom enn i plateepitelkarsinom i NSCLC. Imidlertid er ABCC2 ekspresjon signifikant høyere i stadium IV NSCLC sammenlignet med stadiet IIIB, mens det er ingen signifikant korrelasjon mellom ABCC1 /ABCC3 ekspresjon og kliniske variabler i NSCLC [35]. Dette avviket må undersøkes nærmere. ABCG4 deler også noen likheter med ABCG1. Imidlertid basal ATPase-aktiviteten av ABCG4 er lavere enn for ABCG1, og ABCG4 hemmes ikke av de samme stoffene som ABCG1 [37]. Men det nøyaktige samspillet og rollen til dette samspillet mellom ABCG1 og ABCG4 fortsatt trenger å bli belyst [38].
Tidligere studier har vist at ABCG4 formidler utstrømningen av endogene steroider i celler og overføringer dem for å utheve density lipoproteiner (HDL), og dermed bidra til å opprettholde kolesterol homeostase [30,39]. Men Castanys-Muñoz et al. har oppdaget at over-uttrykk for ABCG4 er også involvert i alkyl-fosfolipid analoger (miltefosine, edelfosine, og perifosine) motstand i
Leishmania product: [33]. Resultatene av den foreliggende studie antyder en kortere overlevelse hos pasienter med ABCG4-positiv NSCLC behandlet med cisplatin-kjemoterapi. Vi spekulerer i at pasienter med ABCG4-positiv NSCLC kan vise motstand mot cisplatin-basert kjemoterapi. Vi foreslår at ABCG4 kan tjene som et molekylært mål for reduksjon av legemiddelresistens i NSCLC. Forholdet mellom ABCG4 og narkotika motstand, og spesielt multimedikamentresistens, vil være mer spesifikt tatt opp i fremtidige studier.
På den annen side, var dette den første studien å undersøke forholdet mellom ABCG4 uttrykk og prognose i pasienter med NSCLC. Basert på OS kurver, ABCG4-positive pasienter hadde en kortere median overlevelsestid enn ABCG4-negative pasienter med unntak av stadium II NSCLCs (
P
= 0.8127). Median overlevelse var ikke signifikant forskjellig i fase II NSCLCs, som kan være fordi ABCG4 uttrykk nivåer var relativt lav i stadium II NSCLCs, og at antall ABCG4-positive pasienter med stadium II NSCLC var relativt lite (n = 13). Derfor bør dette resultatet tolkes med forsiktighet. Den univariate og multivariate analyser viste at i tillegg TNM stadium og differensiering, ble ABCG4 uavhengig assosiert med OS i NSCLCs behandlet med cisplatin-basert kombinasjonskjemoterapi. Disse resultatene antyder at ABCG4 ekspresjonen kan være uavhengig risikofaktor for prognose og prediktiv biomarkør hos pasienter med NSCLC behandlet med cisplatin-baserte kombinasjonskjemoterapi. Våre resultater er konsistente med de av Yoh et al. og Ota et al., som understøtter en rolle for prediktiv ABCG2 i prognose av NSCLC-pasienter som ble behandlet med cisplatin-baserte kombinasjonskjemoterapi [35,36]. I tillegg har vi spekulere at ABCG4 mRNA-ekspresjon kan bli anvendt til å designe individualisert kjemoterapi for NSCLC.
Denne studien hadde noen begrensninger. Faktisk prøvestørrelsen var liten, og et større utvalg ville være å foretrekke. Vi hadde også noen friske kontrollpersoner fordi lunge reseksjon hos friske individer er svært invasiv og uetisk. Men kontroll vev fra pasienter med NSCLC var histologisk forskjellig fra tumorvev og 5 cm fra svulstene, så det antas at dette var en effektiv kontroll under omstendighetene. Til slutt vil intracellulær lokalisering av ABCG4 vurderes i en fremtidig jobb. Videre studier vil være utføre på forskjellige NSCLC cellelinjer som overuttrykker ABCG4 alene eller i kombinasjon med andre ABC transportører, som skal bidra til å belyse den eksakte rolle og funksjon ABCG4 i NSCLC.
Konklusjoner
denne studien tyder på det sterkeste at høy ABCG4 uttrykket er assosiert med dårlig prognose hos pasienter med NSCLC behandlet med cisplatin-basert kjemoterapi, og pasienter med ABCG4-positiv NSCLC kan vise motstand mot cisplatin-basert kjemoterapi. Dessuten er den foreliggende studien den første til å indikere en potensiell rolle for ABCG4 uttrykk som en selvstendig prediktiv faktor av dårlig prognose i NSCLC pasienter behandlet med cisplatin-baserte kombinasjonskjemoterapi. Men videre studier med større utvalg og celler nødvendig for å bekrefte disse resultatene, og den spesifikke sti og mekanismen kjører denne effekten trenger videre studier. Disse kan føre til en ny tilnærming for reversering av resistens mot kjemoterapi narkotika ved å forstå ABCG4 og dens mekanisme i NSCLC.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. . Fullstendig western blot av ABCG4 protein (60 kDa) ekspresjon
β-aktin (43 kDa) ble anvendt som en intern referanse
doi:. 10,1371 /journal.pone.0135576.s001 plakater (PDF)
S1 fil. . rådata til Cox modell analyse og Kaplan-Meier-kurver
Merk: Kjønn: 0, mann; 1, kvinne. Event: 0, død; 1, sensurert data. Alder: 0, ≥60; 1, 60.
