Abstract
DNA hypometylering er en viktig epigenetisk modifikasjon funnet å forekomme i mange forskjellige krefttyper, som fører til oppregulering av tidligere dempede gener og tap av genomisk stabilitet. Vi har tidligere vist at hypoksi og hypoglykemi (iskemi), to vanlige mikromiljøendringer solide svulster, redusere DNA metylering gjennom nedregulering av DNMTs i menneskelige kolorektal kreftceller. Her benyttet vi et genom-wide kryssplattform tilnærming for å identifisere gener hypomethylated og oppregulert ved iskemi. Etter eksponering for hypoksi eller hypoglykemi, ble metylert DNA fra humane kolorektal kreftceller (HCT116) immunopresipitert og analysert med Affymetrix promoter array. I tillegg RNA ble isolert og analysert i parallell med Affymetrix uttrykk matrise. Oppfinnsomhet pathway analyse programvare viste at en betydelig andel av genene hypomethylated og oppregulert var involvert i cellulær bevegelse, inkludert
PLAUR Hotell og
CYR61
. En Matrigel invasjonen assay viste at faktisk HCT116-celler dyrket i hypoksisk eller hypoglykemiske tilstander har økt mobilitet evner. Bekreftelse av oppregulert uttrykk for cellulær bevegelse gener ble utført med qPCR. Korrelasjonen mellom ischemi og metastase er vel etablert i progresjon av kreft, men de molekylære mekanismer som er ansvarlig for dette vanlig observasjon er ikke blitt klart identifisert. Vår nye data tyder på at hypoksi og hypoglykemi kan være kjøring endringer i DNA metylering gjennom nedregulering av DNMTs. Dette er den første rapporten til vår kunnskap som gir en forklaring på den økte metastatisk potensial sett i iskemiske celler;
dvs.
at iskemi kan være drivkraften DNA hypometylering og økt uttrykk av cellulær bevegelse gener
Citation. Skowronki K, Andrews J, Rodenhiser DI, Coomber BL (2014) Genome-Wide Analysis i Human kolorektal kreft celler avslører iskemi-mediert uttrykk for motilitet gener via DNA Hypomety-lering. PLoS ONE 9 (7): e103243. doi: 10,1371 /journal.pone.0103243
Redaktør: Hassan Brim, Howard University, USA
mottatt: 14 februar 2014; Godkjent: 30 juni 2014; Publisert: 31.07.2014
Copyright: © 2014 Skowronski et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av en forsknings Grant # 020094 til BLC og DR fra den kanadiske Cancer Society Research Institute (https://www.cancer.ca/research/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Solide svulster gjennomgå en fundamental prosess som kalles angiogenese (rekruttering av neo-blodkar) for å opprettholde tilstrekkelig nivå av oksygen og næringsstoffer til den voksende massen [1]. Tumor blodkar er meget uvanlig og på grunn av hastigheten av tumorvekst som overstiger hastigheten av angiogenese, vil deler av en svulst utvikle redusert blodstrøm, eller iskemi [2]. I tillegg til andre endringer, vil iskemiske regioner har områder med hypoksi og hypoglykemi, og mens virkningen av hypoglykemi på tumorigenesis ikke er godt undersøkt, er rollen til hypoksi i kreft progresjon godt dokumentert og omfatter økt genetisk ustabilitet, og stimulere celle invasjon og angiogenese, for derved å bidra til metastase [3].
Cellular bevegelse /migrasjon er et kritisk trinn i metastasering, som er årsaken til de fleste kreftrelatert død fisk [4]. En rekke molekylære endringer kan føre til en celle for å være bevegelig og reise inn i lymfesystemet eller blodkar system, til slutt fører til arrest på et nytt sted i kroppen [5]. Celler i en iskemisk miljø har en høyere metastatisk potensial gjennom oppregulering av gener som
VEGF
å stimulere angiogenese, og
urokinase plasminogen aktivator product: (
uPA
) som aktiverer plasmin å degradere ECM [5]. Ved stabilisering av en underenhet av den hypoksi-responsive transkripsjonsfaktor, HIF1α, driver hypoksi ekspresjon av de to gener, og mange andre, fremmer metastase. Celler kan også gjøres mer motile via epigenetisk omprogrammering. Flere relevante gener som
uPA product: [6] og
S100A4 product: [7] har endret epigenetisk mønster i kreftceller, slik at cellen morfologi å bli endret til en mer metastatisk-gunstig tilstand. Hva er fortsatt ukjent er om epigenetiske modifikasjoner og iskemi er knyttet fremme tumormetastaser.
DNA metylering er en viktig epigenetisk mekanisme som regulerer genuttrykk [8]. Metylert DNA er forbundet med transkripsjonen stanse, ettersom metylgruppene i cytosinrestene endre konfigurasjonen av DNA og derfor forhindre transkripsjonsfaktorer fra å binde [9], så vel som å utløse den rekruttering av repressorer og kromatin modifiserende enzymer som ytterligere stillhet uttrykk gjennom kromatin kondensasjon [10], [11]. Flere DNA metyltransferaser (DNMT) katalyserer omdannelsen av cytosin til 5-metylcytosin [12], med de mest studerte DNMTs være DNMT1 (vedlikeholds metyltransferase) og DNMT3a og DNMT3b (
de novo
metyltransferaser) [13] .
I kreft, er to vanlige forstyrrelser i DNA-metylering mønstre observert: promoter spesifikke hypermethylation og global hypometylering [14]. De fleste studier har fokusert på DNA hypermethylation og virkningen at lyddemping tumorsuppressorgener har på startfasen, progresjon, og prognose. DNA hypometylering på den andre siden har blitt overskygget av den omfattende oppmerksomhet til DNA hypermethylation i cancerterapi, selv om hypometylering var den første epigenetisk avbrudd angitt i kreft [15], [16]. Til tross for den innledende mangel på forståelse av betydningen av DNA hypometylering i kreft, er det nå kjent at repetitive sekvenser blir demetylert og føre til genomisk kaos [17], [18]. Som med DNA hypermethylation kan hypometylering være stedsspesifikke, og dermed bidra til økt uttrykk [16]. I tillegg til slike gen-spesifikke effekter, genomiske ustabilitet, tap av prege [19] og unormal X-kromosom aktivering bidrar også til tumorgenese [20].
Hoffmann og Schultz [16] en hypotese at DNA hypometylering akselererer tilpasning av kreftceller til det dynamiske mikromiljøet gjennom valg for bestemte genfunksjoner, som motilitet. Bevis for denne teorien ligger i urokinase plasminogen aktivator
(uPA
) genet. En serin protease som er involvert i degraderingen av den ekstracellulære matriks,
uPA
har vist seg å ha en hypomethylated promoter-regionen, noe som fører til over-ekspresjon i både bryst- og prostatakreft og er direkte forbundet med økt invasive og metastatisk potensiale [ ,,,0],6].
melanom-assosiert antigen product: (
MAGE
) er en annen av gruppen av gener funnet å være demetylert og oppregulert i mange kreftformer som melanom, kolorektal, mage, og ikke-småcellet lungekreft [ ,,,0],21], [22], [23], [24], [25]. Samlet sett flere mekanismer kan være ansvarlig for feilregulering av DNA metylering i kreft. Overekspresjon av DNMTs har blitt rapportert i mange forskjellige typer kreft [26] og forklarer avvik hypermethylation, men mindre fokus har gått med til å forstå DNA hypometylering, selv om DNA hypometylering spiller en like viktig rolle i å endre kreft epigenome.
tidligere arbeid beskrevet et nytt forhold mellom ischemi og DNA-metylering, med redusert metyl-cytosin sett i celler fra iskemiske regioner av tumorer [27]. Vi fant også at i HCT116 menneskelige kolorektal kreftceller, DNMT1, DNMT3a, og DNMT3b uttrykk og aktiviteter ble redusert med
in vitro
hypoksi og hypoglykemi [28]. Disse endringene i uttrykk og aktivitet var sammenfallende med hypometylering av
p16
INK4a
promoter-regionen i hypoglykemiske forhold [28]. I denne studien, utforsket vi uttrykket og metylering endringer i HCT116 cellene på et genom-wide nivå, utnytte en kryssplattform tilnærming for å identifisere gener som reguleres av iskemiske forhold. Med våre tidligere funn, sammen med den vanlige observasjon av økt metastatiske potensiale i iskemiske tumorer, hypotese vi at økt cellulær motilitet av humane kolorektale cancerceller i iskemiske tilstander er på grunn av oppregulering av motilitet-assosierte gener, og at disse forandringer i ekspresjon er drevet av iskemi-mediert DNA hypometylering.
Resultater
Minimal kopi antall variant
kopien antall gener i HCT116 cellene ble vurdert med Affymetrix SNP 6,0 array å bestemme om og i hvilken grad, hadde cellene vi brukte drev /mutert i kultur i forhold til den opprinnelige karyotype av denne cellelinjen. Sammenlignet med en sammenslått normal menneske karyotype fra den internasjonale HapMap prosjektdatabase [29], cellene manglet omfattende kromosomale abnormiteter (figur 1). Vi observerer regioner på 8q, 10Q, 16q, og VED BETJENING 17Q som vises regionale kromosom gevinster (angitt i rødt), som tidligere rapportert av andre [30]. Svært få fullstendig tap av kopier ble sett (blå), med unntak av y-kromosom, som har blitt rapportert å være fraværende i 50-100% av HCT116-celler [31]. Således, i sammenligning med andre kreftcellelinjer, HCT116 ha en forholdsvis normal og stabil karyotype med kromosomal ustabilitet minimal [30].
tall (og X /Y) tilsvarer kromosomer, og MT betegner mitokondrie DNA. Resultatene ble sammenlignet med et datasett fra Affymetrix inneholdende 270 blandet populasjon prøver fra International HapMap prosjekt [29]. Regioner i grått indikerer ingen endring i kopiantall, indikerer rød en kopi nummer gevinst, og blå kopi nummer tap. Denne rekken ble utført i duplikat.
Hypoglykemi påvirker flere gener enn hypoksi
Expression analyse ble utført for å kvantitativt vurdere genuttrykk endringer i HCT116 cellene under iskemiske betingelser. Ekspresjonselementene arrays indikerte at etter eksponering overfor hypoksi i 48 timer, HCT116-celler hadde 310 og 1081-gener opp- og ned-regulert, henholdsvis. Når cellene ble utsatt for hypoglykemi, 1052 og 2433 gener var opp- og ned-regulert, henholdsvis (tabell 1). Analyse av arrangøren metylering ved hjelp av Affymetrix 1.0R flislegging rekke avdekket at hypoksi resulterte i 1386 hypomethylated gener, og 1655 hypermethylated gener. Veksten i hypoglykemiske forhold resulterte i 1940 hypomethylated gener, og 1980 hypermethylated gener (tabell 1). Dermed både uttrykk og promoter metylering mønstre ble mest tungt påvirket av hypoglykemi, målt ved antall vesentlig endret gener.
Cross-plattform analyse
Deretter vurderte vi den funksjonelle betydningen av disse komplekse genekspresjon og epigenetiske (DNA metylering) profiler. Bruke Partek Software Suite, ble unike gener som ble hypomethylated og oppregulert (samt hypermethylated og nedregulert) kledde for å identifisere endringer i genuttrykk knyttet til endringer i promoter metylering. Det var 58 unike gener hypermethylated og nedregulert av hypoksiske forhold, og 161 gener ved hypoglykemi (data ikke vist). Vi fokuserte på de genene som ble hypomethylated og økte i uttrykk, siden vår tidligere arbeid viste DNMTs ble undertrykt i iskemi. Vi observerte at 18 og 96 unike gener ble hypomethylated og oppregulert ved hypoksi og hypoglykemi, henholdsvis (figur 2). Delvis lister over disse genene kan sees i tabell 2 og 3, med den komplette listen som presenteres i tabell I i Information S1.
Antall gener som var både betydelig hypomethylated og oppregulert ved hypoksi (A) og hypoglykemi ( B) er angitt i de overlappende områdene.
Oppfinnsomhet Pathway Analyse av hypomethylated og oppregulert gener
Oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA) ble brukt til å analysere og klassifisere de hypomethylated og oppregulert gener i funksjonelle veier, for å bedre forstå den biologiske betydningen av gener fra våre datasett. Programvaren avgjør om en biologisk funksjon er beriket for i et datasett ved å undersøke hele genet liste for funksjonell merknader som finnes i oppfinnsomhet kunnskapsbase, og utfører en Fishers eksakte test for sammenligning av forholdet mellom gener med en gitt merknad i datasettet mot forholdet mellom gener å ha den samme merknaden i hele befolkningen (
dvs.
alle genene på HG U133 Plus 2.0 matrisen). Hvis det første forholdet er betydelig høyere enn den andre, vil lista sies å bli beriket for gener med at merknaden
Med hypoksi eksponering, de tre beste cellulære funksjoner i vår liste over hypomethylated /oppregulert gener var.: celle-til-celle-signalisering, cellulær bevegelse, og utvikling av bindevev (figur 3). Hypoglykemi anriket for endringer i celledød, cellesyklus, og regulering av genekspresjon (figur 4). Selv om det ikke innenfor topp par funksjonelle kategorier, cellulær bevegelse var også en beriket funksjon i den hypoglykemiske gruppen. Nettverksanalyse ble også utført for å tilveiebringe en grafisk representasjon av kjente biologiske forhold i de hypomethylated og oppregulert gener. Nettverkene er generert ved å bestemme et fokus molekyl, og deretter undersøke genet lister for de fleste forbindelser til fokus-molekylet, basert på den vitenskapelige litteratur Ingenuity database. Den øverste nettverk (som har de fleste tilkoblinger) for både hypoksi og hypoglykemi involvert gener som har roller i cellulær bevegelse. I hypoksiske betingelser,
PLAUR, LDLR
, og
LAMB3
(figur 5A) var alle i ett nettverk, og har alle vist seg å være involvert i cellulære bevegelse. Den øverste nettverk i hypoglykemiske tilstander inkludert cellulær bevegelse gener
ETS1, KLF4, IL6ST, NEDD4L
, og
NRAS plakater (figur 5B). Det er viktig å merke seg at noen gener i vår liste kan ha biologiske funksjoner /merknader som oppfinnsomhet databasen ikke gjenkjenner. Som et eksempel,
AFAP1L1
var ikke i oppfinnsomhet liste av gener som er involvert i cellulær bevegelse, men det er bevis for dette molekylet rolle i migrering og invasjon [32]. Basert på IPA analyse av funksjonelle trasé og nettverk, kategorien «cellulær bevegelse» dukket interessant og relevant, og vi forfulgte gener assosiert med disse funksjonene for utvalg validering videre.
Oppfinnsomhet Pathways Analyse databasen ble brukt for å tildele gener til biologiske funksjoner og bestemme funksjonene som ble beriket, basert på statistisk signifikans.
Oppfinnsomhet Pathways Analyse databasen ble brukt for å tildele gener til biologiske funksjoner og bestemme funksjonene som ble beriket, basert på statistisk signifikans.
Den øverste nettverk (de fleste forbindelser til sentrale molekyl) for hypomethylated og oppregulert genene er vist for både hypoksi (A) og hypoglykemi (B). Intensiteten av det røde fargestoffer av molekylene gjenspeiler uttrykket nivå som finnes i uttrykk array (mørkere betyr større økning i ekspresjon sammenlignet med kontrollforhold).
Migrasjon-assosierte gener som er anriket på hypoksi og hypoglykemi
Den kryssplattform analyse av gener hypomethylated og oppregulert ved hypoksi og hypoglykemi avdekket en rekke gener som er involvert i cellulær bevegelse:
LDLR, LAMB3, ALDOA, PLAUR, SCAI, etter og
NEDD4L
i hypoksisk gruppen (figur 3), og
ITGB1, ETS1, IL6ST, NRAS, TJP1, SMAD3, TMOD3, LATS2, KLF4, ADI1, NCOA3, PTEN, CSNK2A2, TRIO, CSNK2A1, BRD4, RTN4, SEMA3C, NEDD4L
,
CYR61, TFPI, etter og HEY1 i hypoglykemiske gruppen (figur 4). I tillegg til disse genene, ble det observert to andre som ble hypomethylated og oppregulert sannsynligvis også involvert i cellulær bevegelse.
ANKRD37 Hotell og
AFAP1L1
i «hypoksisk gruppen «har vist seg å være involvert i migrasjon og invasjon av kreft celler (tabell 2). Mange av de «cellular bevegelse» gener i vår analyse er involvert i medie cellular vedlegg, enten til andre celler eller ECM, eller i ECM degradering, til alle prosesser som kreves for en celle flytte innenfor vev og for å angi blodkar.
bekreftelse av økt uttrykk av cellulær bevegelse gener
Vi brukte QRT-PCR for å kvantifisere uttrykk av utvalgte gener fra både hypoksi og hypoglykemi grupper. Vi velger å fokusere på gener involvert i cellulær bevegelse identifisert i kryssplattform analyse som oppregulert og hypomethylated. For hypoksi gruppe, vi undersøkte
PLAUR
,
AFAP1L1
, og
LAMB3
. Både PLAUR og LAMB3 var signifikant oppregulert i hypoksi, sammenlignet med kontrollforhold (Figur 6A). Brette-endringer i ekspresjonen av disse to genene som bestemt ved QRT-PCR var sammenlignbare med den fold-endringen sett i uttrykket array (tabell 2). Gener som vurderes for uttrykk endringer ved QRT-PCR i hypoglykemiske tilstander inkludert
EPHA2
,
NRAS
,
NEDD4L
, og
CYR61
. Alle fire av disse gener ble oppregulert i uttrykket rekke analyse og hypomethylated i promotoren flislegging matrisen, bortsett fra EPHA2 ikke ble hypomethylated henhold til promotoren matrisen. Betydelig oppregulering av EPHA2, NEDD4L og CYR61 i hypoglykemi ble bekreftet ved QRT-PCR (figur 6B).
cDNA nivåer fra HCT116-celler dyrket i hypoksi (A) og hypoglykemi (B) ble målt for gener av interesse og normalisert til p-aktin, og å kontrollere. N = 5 for oksygen og N = 3 for uten glukose. * Indikerer signifikant forskjell i forhold til kontroll;
p
≤0.05.
Iskemisk-tilstander øker HCT116 motilitet
Invasion analysene ble utført for å fastslå effekten av iskemi på cellemotilitet. Etter 48 timer i iskemiske tilstander, var det tydelig at celler eksponert for hypoksi og hypoglykemi hadde signifikant økt mobilitet og invasive egenskapene som bestemmes av evnen til cellene til å nedbryte og migrere gjennom Matrigel (figur 7). Dette funksjonelle analysen støttet våre funn at forhøyet uttrykk for mobilitet assosierte gener via promoter hypometylering i iskemiske forhold betyr fenotypiske endringer i HCT116 cellene.
Cell bilder som er tatt på 10 x forstørrelse fra undersiden av Matrigel-belagte transwells (EN). Lette brytnings celler (sort) indikerer at disse cellene overføres gjennom transwell membranen. Gjennomsnittlig antall HCT116-celler som invaderte Matrigel belagte transwells etter 48 timers eksponering for oksygen (NO) og ingen glukose (NG), etterfulgt av 24 timer i transwells (B). * Indikerer signifikant forskjell fra kontroll;
p
. 0,01
Diskusjoner
I denne studien benyttet vi en kryssplattform tilnærming for å identifisere genom-wide endringer i promoter metylering og genuttrykk å oppdage hvordan akutt iskemi påvirker metylering-mediert genuttrykk i menneskelige kolorektal kreftceller. Vi identifiserte og bekreftet at gener involvert i å forbedre cellulær bevegelse er regulert iskemiske forhold, representert ved hypoksi og hypoglykemi
in vitro
.
Akutt iskemi oppstår ofte i solide svulster på grunn av den dynamiske tumorvaskulatur og den raske utvidelsen av svulster som overstiger angiogenese [2]. Vi har tidligere fastslått at akutt iskemi fører til nedregulering av både cellulære metylcytosin innhold og DNMT ekspresjon og aktivitet [27], [28]. Å forfølge dette funnet og identifisere hvilke gener som er hypomethylated og oppregulert ved iskemi på en global skala, brukte vi plattformer som deler den felles Affymetrix teknologibase for å lette kryssreferanser av datasett. Vi brukte derfor en enkel programvare bioinformatikk pakke (Partek Genomisk Suite) for å importere, analysere og relatere rådata fra de ulike microarray plattformer [33]. Fra vårt genom-wide, cross-platform studie fant vi iskemiske forholdene betydelig oppregulert gener involvert i celle motilitet og invasjon, og disse genene hadde demetylert promoter regioner identifisert av arrays. Derfor analyserer våre cross-platform punkt til et sett av gener som synes lydhør overfor miljø hypoksi og hypoglykemi via endret CpG metylering.
Tidligere studier har vist at noen HIF1-mediert gener (
f.eks CA9, EPO
) krever CpG innenfor den hypoksi responselement (HRE) som skal demetyleres for at HIF1 å binde, og ekspresjon forekommer [34] – [36]. S100A4, et medlem av familien av S100 Ca
2 + -binding proteiner, er kjent for å være involvert i kreftcelle motilitet ved sin evne til å aktivere ikke-muskel myosin, og er blitt vist å være relatert til magekreft progresjon [ ,,,0],34]. S100A4 ble oppregulert ved hypoksi i eggstokkreft, med redusert metylering av HRE i
S100A4
«s promoter regioner og økt binding av HIF1 [7]. Disse studiene gir støtte bevis mot konseptet som hypometylering kreves i hypoksiske betingelser for genekspresjon å skje.
Et relevant gen signifikant oppregulert og hypomethylated av hypoksi fra våre cross-platform analyse er plasminogen aktivator urokinase reseptoren, eller PLAUR , reseptoren for urokinase-plasminogen-aktivator (uPA). uPA er en serin protease som katalyserer omdannelsen av plasminogen til plasmin, som deretter forringer ECM [35]. PLAUR er involvert i cellulær bevegelse og metastasering [36] og uttrykk øker under den kritiske overgangen fra alvorlig dysplastiske adenom til invasivt karsinom i kolorektal kreft [35]. I tillegg er PLAUR oppregulert i hypoksi [37] gjennom HIF1 aktivitet [38], og er ansvarlig for hypoksi-mediert invasivitet i HCT116-celler [39]. I tillegg er det ligand uPA regulert av transkripsjonsfaktoren ETS1, og bindingssteder for ETS1 i
uPA
arrangøren må også demetylert for transkripsjon å skje [40].
Laminin beta 3 (LAMB3), en subenhet av laminin-5 (laminin-332), er en basalmembranprotein antas å mediere celleadhesjon, migrering og organisering av celler under embryonal utvikling. LAMB3 uttrykk er høyere i ondartet esophageal plateepitelkarsinom enn i normalt vev, og uttrykk korrelerer med dybden av invasjonen og overlevelse [41]. LAMB3 har også blitt rapportert å være hypomethylated og oppregulert i magekreft [42]. Vi bekreftet at LAMB3 ble oppregulert i hypoksiske forhold i CRC. Interessant, en studie undersøkte kolon adenokarsinom biopsier, og så laminin-fem positiv farging ble assosiert med spirende kreftceller som ligger på tuppen av invaderende ondartet epitel, og at laminin-5 colocalized med PLAUR [43].
I tillegg til
PLAUR Hotell og
LAMB3
,
S100A10
ble et annet gen oppregulert ved både hypoksi og hypoglykemi basert på vår rekke analyse, og har vist seg å være viktig i kreftcelle invasjon og metastasering gjennom colocalization med uPA /PLAUR system [44]. S100A10 er overuttrykt i magekreft [45] og er viktig for tumorassosiert makrofag innvandring til kreft nettsider [46]. Vi er de første til å rapportere at
PLAUR Hotell og
LAMB3
synes å være viktige genet mål i iskemi-mediert hypometylering, tilsvarende
S100A4
. PLAUR, LAMB3 og S100A10 kunne jobbe sammen med hverandre for å øke celle mobilitet i hypoksiske svulster. Videre studier er nødvendig for å fastslå om disse proteinene er colocalized i hypoksisk vev.
cysteinrike 61 (CYR61) er et medlem av CCN familie av vekstfaktorer. CYR61 er kjent for å knytte celleoverflaten og ECM, og er involvert i celle adhesjon, spredning og migrasjon [47]. Vi har identifisert
CYR61
som hypoglykemi-responsive genet. CYR61 ekspresjon økes i en rekke kreftformer, inkludert brystkreft, melanom, gliom, mage, tarm, blære, prostata og bukspyttkjertel [47]. Stanse av CYR61 i osteosarkom og esophageal plateepitel karsinom celler førte til redusert migrasjon og celle invasjon [48], [49]. CYR61 ekspresjon er vist å korrelere med aggressivitet av kreft i bukspyttkjertelen celler, noe som ytterligere viser rollen til denne vekstfaktor i metastase [47]. Til dags dato er det ingen studier som viser at
CYR61
uttrykk er regulert av arrangøren metylering. Imidlertid er CYR61 ekspresjonen regulert av transkripsjonsfaktor STAT3 [50], og andre har vist at CpG i STAT3 bindingssetet krever demetylering for STAT3 til å binde og å uttrykke sine målgener [51].
to annen gener som ble oppregulert i vår analyse av hypoglykemi var
EPHA2 Hotell og
NEDD4L
. EPHA2 er et transmembran reseptor-tyrosinkinase, som er overuttrykt i mange karsinomer, inkludert tidlig fase kolorektal kreft [52], og dets ekspresjon er sterkt korrelert med tumorinvasjon og metastase [53]. NEDD4L er en E3 ubiquitin-ligase vist seg å ha økt uttrykk med galleblæren kreft progresjon. Ved hjelp av siRNA, stanse av NEDD4L førte til redusert Matrigel og kollagen invasjon av galleblæren kreft celler, og dens rolle i invasjonen er muligens på grunn av sin tilknytning til MMP [54]. For tiden er det ingen studier som viser at arrangøren demetylering kunne være ansvarlig for oppregulering av en av disse to genene.
Melanom assosierte antigener (Mages) er en gruppe av gener som uttrykk er forstummet i de fleste normal somatisk vev, bortsett fra i testis, men oppregulert i mange kreftformer [22]. En studie viste at promotorområdet av
MAGE-A1
inneholder to ETS-bindingsseter som skal demetyleres for transkripsjonsfaktor til å binde og ekspresjon forekommer [55]. Demetylering og ekspresjon ble observert i flere forskjellige kreftcellelinjer, og behandling med 5-aza-dC økt MAGE-A1 ekspresjon i normale fibroblaster på grunn av demetyleringen i promoterregionen. Ekspresjon av MAGE-A1 og -A4 har vist seg å være korrelert med sykdom stadium i melanomapasienter [23]. Både demetylering og uttrykk for MAGE-A1 og -A3 har blitt sett i tykk- og endetarmskreft [22] og i ikke-småcellet lungekreft pasienter, hvor uttrykket korrelerte med dårlig prognose [24]. Våre array-data indikerte at to MAGE gener ble metylert ved hypoksi (
MAGEA11
) og hypoglykemi (
MAGEB1
), men ingen induksjon i uttrykket ble observert. Ikke desto mindre, trollmenn er en gruppe av gener som understøtter viktigheten av demetylerte CpG-rester i transkripsjonsfaktorbindingsseter, og at demetylering i kreft kan være genspesifikke.
To andre gener som er involvert i cellulær bevegelse,
AFAP1L1 Hotell og
NRAS
, som var fast bestemt på å bli betydelig oppregulert i hypoksi og hypoglykemi ved mikromatriser, henholdsvis, ble også kvantifisert ved QRT-PCR. Begge disse genene viste ikke økt uttrykk når kontrolleres ved QRT-PCR, muligens på grunn av kryss-hybridisering av ikke-spesifikke sekvenser eller spleisevarianter, to vanlige årsaker til avvik mellom microarray funn og QRT-PCR [56].
det er tilstrekkelig bevis i litteraturen støtte konseptet at CPGs innenfor ulike transkripsjonsfaktor bindingsseter (som HRE, STAT3 og ETS) må demetylert for at transkripsjon til å skje, og enda viktigere, er noen av disse genene er involvert i styrke cellemotilitet. I denne studien har vi bidratt til dette viktige konseptet ved å gi bevis gjennom kryssplattform rekke analyse for andre cellulære bevegelse gener som er både hypomethylated og oppregulert ved iskemi. Vi validert endringer i uttrykket av mobiltelefon bevegelse gener PLAUR, LAMB3, EPHA2, NEDD4L, og CYR61 i iskemiske forhold. Det er velkjent at HIF1α nivåene er høyere i bryst og kolon kreftmetastaser [3]. Denne observasjonen utfyller våre funn at hypoksi reduserer metylering, og at en reduksjon i metylering i CpG av hres kan deretter legge til rette for HIF bindende og formidler genuttrykk. Kanskje hypoksi-indusert reduksjon av DNMT nivåer er en tidlig hendelse i primære svulster. Celler med redusert DNA metylering er dermed så primet for transkripsjonsfaktor binding til genet arrangører som vil forbedre cellulær bevegelse, for eksempel
PLAUR
. Betydningen av hypoksi i kreft progresjon er godt demonstrert i livmorhalskreftpasienter med tumorer er hypoksisk og har økt forekomst av metastaser sammenlignet med pasienter med bedre oksygen svulster [57]. Det er klart at hypoksi påvirker kreft progresjon, og globale endringer i DNA metylering er en vanlig foreteelse å påvirke kreft progresjon [58].
IPA analyse av cross-platform data for gener som ble både hypermethylated og downregulated identifisert gener involvert i cellulære funksjoner som cellebevegelse og celle-til-celle-signalisering og interaksjon (tabellene II og III i Information S1). Nedregulering av gener som er involvert i cellulær adhesjon kan begrepsmessig bidra til økt cellulær motilitet og metastasering. Med ytterligere litteraturgjennomgang, er svært få av disse hypermethylated og downregulated gener assosiert med celle-celle adhesjon. Selv om en interessant ide, ikke vår data støtter ikke undertrykkelse av celle-til-celle adhesjonsmolekyl uttrykk som en sannsynlig mekanisme er ansvarlig for den økte bevegelighet sett i ischemi.
DNMT inhibitorer så som decitabine er blitt anvendt klinisk med noen suksess i behandling av hematologiske maligniteter som akutt myelogen leukemi [59]. Imidlertid har effekten av disse inhibitorene ikke blitt kopiert i faste tumorer [60]. Kreft genomer gjennomgå hypometylering samtidig med hypermethylation [61], og dermed ytterligere hypomethylating med DNMT hemmere løser bare halvparten av metylering uorden. I tillegg solide svulster har en unik funksjon mangler i hematologiske kreftformer: en mikromiljøet med iskemiske regioner. Som vi tidligere har vist, er DNMT uttrykk og aktivitet redusert i iskemiske forhold [28]. Derfor bruker DNMT hemmere i svulster med iskemiske områder kan være ineffektiv i kreftbehandling hvis disse områdene er allerede under hypometylering som følge av iskemi-mediert DNMT undertrykkelse.
Konklusjoner
Det er vel kjent at iskemiske tilstander drive cancer metastase, og her foreslår vi en potensiell mekanisme for dette vanlig foreteelse: gjennom DNA-hypometylering lettes ved iskemi-mediert nedregulering av DNMTs. En betydelig andel av genene påvirket av dette valget trykk er involvert i celle bevegelse. II. III.
