Abstract
α-Tomatine er en glycoalkaloid finnes i tomater og curcumin er en stor gul pigment av gurkemeie. I denne studien ble den kombinerte effekten av disse to forbindelser på prostata kreft celler studert. Behandling av forskjellige prostatakreftceller med curcumin eller α-tomatine alene resulterte i vekstinhibering og apoptose i en konsentrasjonsavhengig måte. Kombinasjoner av α-tomatine og curcumin synergi hemmet veksten og induserte apoptose i prostatakreft PC-3 celler. Effekter av α-tomatine og curcumin kombinasjon var assosiert med synergistisk inhibering av NF-kB aktivitet og en sterk nedgang i ekspresjon av nedstrømsgenet Bcl-2 i cellene. Dessuten var sterk reduksjon i nivåene av fosfo-Akt og fosfor-ERK1 /2 som finnes i PC-3-celler behandlet med α-tomatine og curcumin i kombinasjon. I dyreforsøk, ble SCID mus med PC-3 xenografttumorer behandlet med α-tomatine og curcumin. Kombinasjon av α-tomatine og curcumin mer potent hemmet veksten av PC-3 svulster enn begge substansene alene. Resultater fra denne studien tyder på at α-tomatine i kombinasjon med curcumin kan være en effektiv strategi for å hemme veksten av prostatakreft
Citation. Huang H, Chen X, Li D, Han Y, Li Y, du Z, et al. (2015) Kombinasjon av α-Tomatine og Curcumin hemmer vekst og induserer apoptose i Human prostata kreft celler. PLoS ONE 10 (12): e0144293. doi: 10,1371 /journal.pone.0144293
Redaktør: Hong Wang, Rutgers, Statens Univesity of New Jersey, USA
mottatt: 07.10.2015; Godkjent: 16 november 2015; Publisert: 02.12.2015
Copyright: © 2015 Huang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Guangdong-provinsen, ledelse bevilgning 2011 (https://pro.gdstc.gov.cn/egrantweb/), National Natural Science Foundation of China, 81272452, 21102020 og 21272043 (http : //www.nsfc.gov.cn/), National Cancer Institute, P30-CA072720 (https://www.nih.gov/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er en av de vanligste kreftformene i europeiske og amerikanske menn og har en høy dødelighet [1]. De fleste pasienter viser en første respons på hormonell manipulasjon, men dessverre det store flertallet av pasientene videre for å utvikle hormon-refraktær sykdom. Mens nyere anti-androgen behandling og kjemoterapi alternativer er tilgjengelige for pasienter med androgen-uavhengig prostatakreft, disse agentene besitter betydelig toksisitet og er bare midlertidig effektive [2-5]. Derfor ville roman og mindre giftige tilnærminger for behandling av prostatakreft være til stor nytte for pasientene.
Curcumin (fig 1) er en stor gul pigment av gurkemeie
Curcuma longa
Linn. Gurkemeie er et vanlig krydder i asiatisk mat og har en lang historie med medisinsk bruk i asiatiske land. Curcumin har omfattende biologiske og farmakologiske funksjoner inkludert kreft, anti-inflammatorisk og antioksidant [6-8]. Curcumin har blitt evaluert i kliniske studier for behandling av leversykdom, leddgikt, infeksjonssykdommer og kreft [9, 10]. Til tross for sine lovende biologiske effekter i prekliniske studier, er den kliniske nytten av curcumin svekket av sin dårlig biotilgjengelighet [11]. Selv om mange curcumin analoger har blitt utviklet for å forbedre den terapeutiske effekt, biotilgjengeligheten og toksiske bivirkninger av disse forbindelser må videre studier [12-18]. Kombinere curcumin med andre legemidler mot kreft er en effektiv strategi for å bedre sin anticancer effekt, og faktisk tidligere studier har vist at kombinasjoner av curcumin med andre legemidler mot kreft har økt kreft efficacies [19-21].
α -Tomatine (fig 1) er en naturlig forekommet steroidal glycoalkaloid i tomater (
Lycopersicon
esculentum). Umodne grønne tomater inneholder opptil 500 mg α-tomatine /kg fersk frukt vekt. Sammensatt er delvis degradert som tomat modner til på modenhet nivåer i røde tomater er ca 5 mg /kg fersk frukt vekt [22]. I planter, kan α-tomatine gi forsvar mot patogene sopp, bakterier og virus [22]. Anticancer aktiviteter α-tomatine og dens virkningsmekanismer har blitt studert i løpet av de siste årene. In vitro studier viste at α-tomatine hemmet veksten av forskjellige humane kreftceller [23-25]. Nyere studier viser også at α-tomatine hemmet veksten av melke og prostata tumorer i mus [26, 27]. En kombinasjon av α-tomatine og paclitaxel ble funnet å synergistisk forbedre apoptose av menneskelige prostata kreft celler [28].
Det er økende interesse for å bruke en kombinasjon av lave doser av legemidler mot kreft som varierer i deres virkningsmekanismer i stedet for administrering av et enkelt middel ved en høy dose. Kombinasjoner av legemidler mot kreft som har ulike virkningsmekanismer kan ha synergistisk effekt på å hemme vekst og indusere apoptose i prostatakreftceller. Selv om den hemmende effekten av α-tomatine eller curcumin på prostatakreft hadde blitt studert, har ingen studier undersøkt den kombinerte effekten av disse to agentene på prostatakreftceller dyrket in vitro og dyrket som xenografttumorer in vivo. Studier har vist at virkningene av curcumin og α-tomatine på kreftceller var assosiert med inhibisjon av NF-kB-aktivering [7, 17, 24, 26]. Vi antok at kombinasjonen av lave konsentrasjoner av curcumin og α-tomatine vil synergi hemme NF-kB aktivering fører til sterk vekst hemming og apoptose induksjon i prostatakreftceller. Foreliggende studie ble derfor utformet for å utforske virkningen av α-tomatine i kombinasjon med curcumin ved lave konsentrasjoner på vekst og apoptose i humane prostatacancerceller. Effekter av α-tomatine og curcumin i kombinasjon med NF-kB og relaterte molekylære stier ble bestemt. Vår undersøkelse ga den første bevis på at en kombinasjon av lave konsentrasjoner av α-tomatine og curcumin sterkt inhibert prostata kreftceller dyrket in vitro og dyrkes som xenograft tumorer i mus med immunsvikt.
Materialer og metoder
cellekultur og reagenser
RWPE-en, LNCaP, Vcap og PC-3 celler ble hentet fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). Curcumin, α-tomatine, propylenglykol, polysorbat 80, benzylalkohol, etanol og DMSO var fra Sigma (St. Louis, MO). Matrigel ble oppnådd fra BD Biosciences (Bedford, MA). RPMI-1640-vevskulturmedium, penicillin-streptomycin, L-glutamin og føtalt bovint serum (FBS) var fra Gibco (Grand Island, NY). RWPE-1-celler ble holdt i serumfritt medium keratinocytt (K-SFM; 17005-042) fra Gibco (Grand Island, NY). LNCaP, VCap og PC-3-celler ble holdt i RPMI-1640 dyrkningsmedium inneholdende 10% FBS som var supplert med penicillin (100 enheter /ml) -streptomycin (100 ug /ml) og L-glutamin (300 ug /ml). Dyrkede celler ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 og ble passert to ganger i uken.
Bestemmelse av antall levedyktige celler
Antall levedyktige celler etter hver behandling ble bestemt ved bruk av et hemacytometer under et lysmikroskop (Nikon Optiphot, Japan). Cellelevedyktigheten ble bestemt ved trypan blå eksklusjon-analyse, som ble utført ved å blande 80 ul av cellesuspensjonen og 20 pl av 0,4% trypanblått-oppløsning i 2 min. Blue-celler ble tellet som døde celler og celler som ikke absorberer farvestoff ble tellet som levende celler.
Vurdering av apoptotiske celler
Apoptose ble bestemt ved morfologisk vurdering i celler farget med propidiumjodid ( PI) [29]. Apoptotiske celler ble identifisert av klassiske morfologiske funksjoner, inkludert atom kondens, celle svinn, og dannelse av apoptotiske legemer [29]. Apoptose ble også bestemt av Annexin V /PI dobbel farging analysen bruker fluoresceinisothiocyanate (FITC) -merket Annexin V /PI apoptose deteksjon kit (BD Biovitenskap, San Jose, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Kort sagt ble celler etter behandling oppsamlet, vasket i kald fosfat-bufret saltvann (PBS) to ganger, farget med FITC-konjugerte Annexin V og PI fargestoffer. Eksternalisering av phoshotidylserine og permeabilitet til PI ble evaluert av FACS Calibur flowcytometer (BD Biovitenskap, San Jose, California). Data fra 10.000 gated hendelser per prøve ble samlet. Celler i tidlige stadier av apoptose ble positivt farget med Annexin V. celler i slutten av apoptose ble positivt farget med både Annexin V og PI.
Western blot analyse
Etter behandlingen cellelysatene ble forberedt som tidligere beskrevet [30]. Proteiner ble underkastet natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) og overført til nitrocellulosemembran. Etter blokkering ikke-spesifikke bindingssteder med blokkeringsbuffer, ble membranen inkubert over natten ved 4 ° C med primære antistoffer (# 4051 for fosfor-Akt og # 4376 for fosfor-ERK1 /2, begge fra Cell Signaling Co., Beverly, MA; 05 -729 for BCL-2 fra Millipore Co., Billerica, MA). Den β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Etter fjernelse av det primære antistoff, ble membranen vasket tre ganger med TBS (PBS inneholdende 0,05% Tween 20) buffer ved romtemperatur og deretter inkubert med fluorokromkonjugerte-konjugert sekundært antistoff (Santa Cruz Biotechnology Inc., CA). Membranen ble deretter vasket med TBS tre ganger. Endelig deteksjon ble gjort med Li-Cor Odyssey infrarød bildesystem (Li-Cor bioteknologi, Lincoln, NE).
NF-kB-avhengige reporter genuttrykk analysen
NF-kB transkripsjonen aktivitet var målt ved hjelp av NF-kB-luciferase reporter-gen ekspresjon analysen. En NF-kB luciferase-konstruksjonen ble stabilt transfektert inn i PC-3-celler og en enkelt stabil klon, PC-3 /N [17], ble anvendt i denne studien. I korte trekk, ble PC-3 /n-celler behandlet med curcumin eller α-tomatine alene eller i kombinasjon i 24 timer, og NF-kB-luciferase-aktivitet ble målt ved anvendelse av luciferase-assay kit fra Promega (Madison, WI, USA). Etter behandling ble cellene vasket med is-kald fosfat-bufret salin (PBS) og høstet i 1 x reporter lyseringsbuffer. Etter sentrifugering ble 10 ul porsjoner av supernatantene målt for luciferase-aktivitet ved hjelp av et luminometer fra Turner Designs Instrument (Sunnyvale, CA, USA). Luciferase-aktiviteten ble normalisert mot kjente proteinkonsentrasjoner og uttrykt som prosent av luciferaseaktiviteten i kontrollcellene, som ble behandlet med DMSO løsningsmiddel. Proteininnholdet ble bestemt av Bio-Rad proteinanalysesett (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner.
Dannelse og vekst av PC-3 svulster i immunodeficient mus
Mann alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) mus (6-7 uker gamle) ble oppnådd fra taco Farms Inc (Germantown, NY). Dyrene ble plassert i sterile filter avkortet mikroisolatorbur og forsynt med sterilisert mat og vann. Prostatacancer PC-3-celler (2 x 10
6 celler /0,1 ml /mus) suspendert i 50% Matrigel (Collaborative Research, Bedford, MA) i RPMI 1640-medium ble injisert subkutant inn i høyre flanke av musene. Etter ca 4 uker ble mus med etablerte xenograft tumorer injisert med bærer, α-tomatine (5 mg /kg), curcumin (5 mg /kg), eller α-tomatine (5 mg /kg) + curcumin (5 mg /kg ) en gang hver tredje dag i 30 dager. Hver gruppe hadde 9 mus og alle dyr som fikk samme mengde av kjøretøy (5 ul /g kroppsvekt) som besto av propylenglykol, polysorbat 80, benzylalkohol, etanol og vann (40: 0,5: 1: 10: 48,5). Tumorstørrelse (lengde x bredde), og kroppsvekten ble målt hver tredje dag. Ved slutten av undersøkelsen ble musene avlivet, tumorene ble skåret ut, veid og plassert i fosfat-bufret formalin ved romtemperatur i 48 timer og deretter plassert i etanol i 48 timer før fremstilling av parafinsnitt som tidligere beskrevet [31]. Dyret Studien ble gjennomført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr i National Institute of Health. Protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Rutgers (RU02-001). Denne protokollen godkjent vår nåværende dyrestudie utnytte SCID mus xenograft modell for å fastslå effekten av naturlig forekommet forbindelser (α-tomatine og curcumin) på veksten av prostatakreft.
Immunohistochemistry
Immunhistokjemisk farging proliferende cell nuclear antigen (PCNA) ble anvendt for å bestemme spredning av PC-3-tumorceller. I korte trekk, ble parafinsnitt av tumorvev fremstilt og bearbeidet for immunhistokjemisk farging. De tumorsnitt ble inkubert med et primært PCNA-antistoff (MAB424, Millipore Corp. Billerica, MA, USA) i 1 time ved romtemperatur. Etter å ha vasket med fosfatbufret saltvann (PBS), ble seksjonene inkubert med biotinylert sekundært antistoff i 30 minutter etterfulgt av inkubasjon med pepperrot peroksidase konjugert-avidin-løsning i 30 minutter ved hjelp av Elite ABC kit (PK-6100, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). PCNA farging i tumorceller (brun farge i cellekjernen) ble undersøkt under et mikroskop (Nikon Optiphot, Nikon, Tokyo, Japan). Minst 1000 celler ble telt for hver seksjon.
Statistiske analyser
Den potensielle synergieffekten av α-tomatine eller curcumin ble vurdert av isobole metoden [32], ved hjelp av ligningen Ac /Ae + Bc /Vær = kombinasjon indeks (CI). Ac og Bc representerer den konsentrasjon av legemiddel A og legemiddel B anvendt i kombinasjon, og Ae og Bli representerer den konsentrasjon av legemiddel A og B som produserte den samme størrelsesorden av virkning når det administreres alene. Hvis CI er mindre enn 1, så kan medikamentene er ansett for å virke synergistisk. Hvis CI er 1 eller = 1, deretter narkotika handle i en antagonistisk eller additiv måte, henholdsvis. Analysen av varians (ANOVA) modell med Tukey-Kramer justering ble anvendt for sammenligning av apoptose i PC-3-celler hos forskjellige behandlingsgrupper, og for sammenligning av kroppsvekt, tumorstørrelse, tumorvekten og tumor proliferasjon i dyr blant annet behandlingsgruppene ved slutten av forsøket.
Resultater
α-Tomatine og curcumin hemme veksten av prostata kreft celler
i innledende studier effekten av α-tomatine eller curcumin alene ulike prostata kreft celler ble bestemt. Human prostatacancer LNCaP, VCap (androgen-avhengige) og PC-3 (androgen-uavhengig) -celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av α-tomatine og curcumin i 72 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved trypan blå eksklusjon assay. Som vist i figur 2A, behandling av forskjellige prostatakreftceller med α-tomatine ga en konsentrasjonsavhengig reduksjon i antall levedyktige celler. Behandling av cellene med curcumin resulterte også i en konsentrasjonsavhengig reduksjon i antall levedyktige celler (figur 2B). Virkningene av curcumin og α-tomatine på cellevekst var lik blant de tre prostatakreft cellelinjer som ble testet. Som vist i figur 2C, α-tomatine og curcumin i kombinasjon hadde mer potent inhiberende effekt på LNCaP, VCap og PC-3-celler. Kombinasjonen indeksen (CI) for IC
50 ble beregnet til 0,69, 0,72 og 0,48 for LNCaP, VCap og PC-3-celler, respektivt. Dette resultatet indikerer at kombinasjonen av α-tomatine og curcumin synergistisk hemmer veksten av dyrkede prostatakreftceller. Curcumin og α-tomatine alene eller i kombinasjon hadde en liten hemmende virkning på veksten av ikke-tumorigene prostata epitelceller RWPE-1-celler (figur 2C).
human prostata kreftceller (LNCaP, VCap og PC-3- ) og ikke-tumorigene prostata epitelceller (RWPE-1) ble sådd ut ved en tetthet på 0,2 x 10
5 celler /ml i 35 mm vevskulturskåler og inkubert i 24 timer. Cellene ble deretter behandlet med forskjellige konsentrasjoner av α-tomatine og curcumin alene eller i kombinasjon i 72 timer. Levedyktige celler ble bestemt ved trypan blå eksklusjon assay. (A) Prosent cellelevedyktigheten i de forskjellige cellelinjer behandlet med α-tomatine. (B) Prosent cellelevedyktigheten i de forskjellige cellelinjer behandlet med curcumin. (C) Prosent cellelevedyktigheten i de forskjellige cellelinjer behandlet med α-tomatine (1 uM) og curcumin (5 uM) alene eller i kombinasjon. Hver verdi representerer gjennomsnitt ± SE fra tre separate forsøk.
α-Tomatine og curcumin indusere apoptose i PC-3 celler
Effekten av α-tomatine og curcumin på induksjon av apoptose i prostata kreft celler ble bestemt ved hjelp av morfologiske vurdering og Annexin V /PI dobbel farging. Som vist i tabell 1, behandling av prostatacancer LNCaP, VCap og PC-3-celler med α-tomatine eller curcumin resulterte i liten økning i antall av apoptotiske celler. Kombinasjoner av α-tomatine og curcumin hadde mer potente stimulerende effekt på apoptose enn noen av midlene anvendes alene. Curcumin og α-tomatine alene eller i kombinasjon hadde en liten til moderat effekt på stimulering av apoptose i ikke-tumorigene prostata epitelceller RWPE-1-celler (tabell 1). Statistisk analyse for synergi viste at α-tomatine og curcumin hadde en sterkere synergistisk effekt på PC-3 celler (CI = 0,77) enn på LNCaP (CI = 0,90) og Vcap (CI = 0,96) celler. Siden kombinasjonen av α-tomatine og curcumin hadde en sterkere synergistisk effekt på apoptoseinduksjon i androgen-uavhengig PC-3 celler, vi valgte PC-tre linje for videre
in vitro Hotell og
in vivo
studier. Induksjon av apoptose i PC-3-celler behandlet med α-tomatine og curcumin ble også bestemt i eksperimenter ved å bruke Annexin V /PI dobbel farging. I disse analysene ble celler i de tidlige stadier av apoptose farget positivt med Annexin V, mens cellene i sene stadier av apoptose ble farget positivt med både Annexin V og PI. Figur 3A viser et representativt resultat fra flowcytometer analyse. Som vist i figur 3B, α-tomatine (1 uM) eller curcumin (5 uM) hadde liten til moderat effekt på stimulering av apoptose, og kombinasjonen av de to midlene forårsaket en betydelig økning i apoptose. Statistisk analyse ved bruk av ANOVA med Tukey-Krama multiple sammenligningstest viste at andelen av apoptotiske celler i kombinasjonsgruppen var signifikant høyere enn i den α-tomatine-behandlede gruppe (
p
0,001), og at i curcumin-behandlede gruppen (
p
0,001).
PC-3-celler ble sådd ut ved en tetthet på 0,5 x 10
5 celler /ml i 100 mm vevskulturskåler og inkuberes i 24 timer. Cellene ble deretter behandlet med α-tomatine og curcumin alene eller i kombinasjon i 48 timer. Apoptose ble bestemt ved Annexin V /PI dobbeltfarging analyse ved bruk av FITC-merket Annexin V /PI apoptose deteksjon kit og flowcytometer analyse. (A) representativt resultat fra flowcytometer analysen er vist. (B) Prosent av tidlig stadium apoptotiske celler (til venstre), sent stadium apoptotiske celler (i midten) og sum apoptotiske celler (høyre). Hver verdi representerer gjennomsnitt ± SE fra tre separate forsøk.
Hemmende effekt av α-tomatine og curcumin på NF-kB og sin nedstrøms target BCL-2
En luciferase reporter-gen ekspresjon analyse ble benyttet for å bestemme virkningen av α-tomatine og curcumin på aktivering av NF-kB. PC-3 /N er en cellelinje avledet fra stabil transfeksjon av PC-3-celler med et NF-kB luciferase-konstruksjonen [17]. PC-3 /N-celler ble behandlet med α-tomatine og curcumin alene eller i kombinasjon i 24 timer. Behandling av PC-3 /N celler med α-tomatine (1-5 uM) eller curcumin (5-20 uM) alene resulterte i reduksjon i luciferaseaktivitet i konsentrasjonsavhengig måte (fig 4). Lavere konsentrasjoner av α-tomatine (1 uM) eller curcumin (5 eller 10 uM) hadde liten til moderat hemmende effekter på luciferase-aktivitet, og kombinasjoner av α-tomatine (1 uM) og curcumin (5 eller 10 uM) hadde mye sterkere effekter enn begge substansene alene (fig 4). Statistisk analyse for synergi viste at α-tomatine og curcumin i kombinasjonen hadde en synergistisk effekt på reduksjon av NF-kB luciferase-aktivitet (CI = 0,56). Effekten av α-tomatine og /eller curcumin på nivået av anti-apoptotiske protein Bcl-2 som er et nedstrøms target av NF-kB ble bestemt ved Western blot-analyse. Behandling med α-tomatine eller curcumin alene hadde liten eller ingen effekt på nivået av Bcl-2, mens kombinasjonen hadde en sterk hemmende effekt på ekspresjon av dette protein (figur 5). Bandet tetthetsmåling viste at nivået av Bcl-2 i forhold til kontroll (1,00) var 0,89 i celler behandlet med curcumin, 0,92 i celler behandlet med α-tomatine og 0,41 i celler behandlet med kombinasjonen av α-tomatine eller curcumin (Fig 5).
PC-3 /n-celler ble sådd ut ved en tetthet på 0,2 x 10
5-celler /ml medium i 12-brønners plater og inkubert i 24 timer. Cellene ble deretter behandlet med α-tomatine alene eller i kombinasjon med curcumin i 24 timer. NF-kB transkripsjonen aktivitet ble målt ved hjelp av et luciferase-aktivitetsanalyse. Hver verdi representerer gjennomsnitt ± SE fra tre separate eksperimenter.
Cellene ble sådd ut ved en tetthet på 1 x 10
5 celler /ml medium i 100 mm kulturskåler og inkubert i 24 timer . Cellene ble deretter behandlet med α-tomatine eller curcumin alene og i kombinasjon i 24 timer (for analyse av fosfor-Akt og fosfor-ERK1 /2) og 48 timer (for analyse av Bcl-2). Nivåene av Bcl-2, fosfo-Akt og fosfo-ERK1 /2 ble bestemt ved Western blot-analyse. Bandet tetthet ble målt og normalisert for aktin.
Effekter av α-tomatine og curcumin på nivået av fosfo-Akt og fosfo-ERK1 /2
nivået av aktivert ERK1 /2 og Akt i PC-3-celler ble evaluert ved Western blot-analyse ved å bruke anti-fosfo ERK1 /2 og fosfo-Akt antistoffer. Behandling av PC-3-celler med α-tomatine (1 uM) resulterte i en moderat til sterk reduksjon i nivået av fosfo-Akt lenge curcumin (5 uM) alene hadde liten eller ingen effekt (figur 5). En kombinasjon av α-tomatine og curcumin hadde en sterk virkning på å senke nivået av fosfo-Akt. Bandet tetthetsmåling viste at nivået av fosfo-Akt i forhold til kontrolldyr (1,00) var 0,99 i celler behandlet med curcumin, 0,51 i celler behandlet med α-tomatine og 0,26 i celler behandlet med kombinasjonen av α-tomatine og curcumin (Fig 5 ). Behandling av PC-3-celler med α-tomatine (1 uM) eller curcumin (5 uM) alene resulterte i liten til moderat nedgang i nivået av fosfo-ERK1 /2, og kombinasjonen av α-tomatine (1 uM) og curcumin (5 uM) ga en sterkere reduksjon i nivået av fosfo-ERK1 /2 enn noen av midlene alene (figur 5). Nivået av fosfo-ERK1 i forhold til kontroll (1,00) som bestemt ved måling bandet tetthet var 0,66 i celler behandlet med curcumin, 0,75 i celler behandlet med α-tomatine og 0,31 i celler behandlet med kombinasjonen av α-tomatine og curcumin (Fig 5). Nivået av fosfo-ERK2 i forhold til kontrolldyr (1,00) var 0,58 i celler behandlet med curcumin, 0,69 i celler behandlet med α-tomatine og 0,30 i celler behandlet med kombinasjonen av α-tomatine og curcumin (figur 5).
Effekter av α-tomatine og curcumin på veksten av PC-3-tumorer i SCID-mus
SCID-mus med PC-3 xenograft tumorer ble behandlet med ip-injeksjoner av bærer (5 ul /g kroppsvekt) , α-tomatine (5 mg /kg), curcumin (5 mg /kg), eller α-tomatine (5 mg /kg) + curcumin (5 mg /kg) tre ganger i uken i 30 dager. Som vist i figur 6A, behandling med α-tomatine eller curcumin alene hadde en moderat inhiberende virkning på veksten av PC-3 svulster mens kombinasjonen hadde en potent effekt på inhibering av veksten av tumorene. Gjennomsnitt ± S.E. for prosent initial tumorstørrelse ved slutten av eksperimentet var 277,6 ± 18,6 for kontrollgruppen, 217,3 ± 10,5 for den α-tomatine-behandlede gruppen, 207,3 ± 15,6 for den curcumin-behandlede gruppen, 151,2 ± 9,6 for kombinasjonen behandlede gruppe. Statistisk analyse ved bruk av ANOVA med Tukey-Krama multiple sammenligningstest viste statistisk signifikante forskjeller i gjennomsnittlig tumorstørrelse mellom kontrollgruppen og den α-tomatine-behandlede gruppe (
p
0,05), mellom kontrollgruppen og den curcumin-behandlede gruppe (
p
0,01), og mellom kontrollgruppen og kombinasjonsbehandlede gruppe (
p
0,001). Den gjennomsnittlige tumorstørrelse i kombinasjonsgruppen var signifikant mindre enn det i den α-tomatine-behandlede gruppe (
p
0,05) og at det i curcumin-behandlede gruppen (
p
0,05).
Herre SCID-mus ble injisert subkutant med PC-3-celler (2 x 10
6 celler /0,1 ml) suspendert i 50% Matrigel i RPMI-medium. Etter ca 4 uker ble mus med PC-3 xenograft tumorer (0,6-1,0 cm bred og 0,6-1,0 cm lange) ip injisert med bærer, α-tomatine (5 mg /kg kroppsvekt), curcumin (5 mg /kg kropps vekt), og en kombinasjon av α-tomatine (5 mg /kg kroppsvekt) og curcumin (5 mg /kg kroppsvekt) en gang hver tredje dag i 30 dager. Immunhistokjemisk farging av PCNA ble utført for å bestemme virkningen av de forskjellige behandlingene på tumorcelle-proliferasjon. (A) tumorstørrelse ble uttrykt som prosent av opprinnelig tumorstørrelsen. (B) Vekten (g) av hver tumor ble målt ved slutten av forsøket i mus etter offer. (C) Kroppsvekt ble uttrykt som prosent av opprinnelig kroppsvekt. (D) Prosent av PCNA-positive celler i tumorer fra dyr behandlet med bærer, α-tomatine, curcumin eller en kombinasjon av α-tomatine og curcumin. Representative mikrofotografier av PCNA immunhistokjemisk farging i svulster fra kontrollgruppen (E), den α-tomatine-behandlede gruppe (F), den curcumin-behandlede gruppe (G) og kombinasjonsbehandlede gruppe (H) er vist. Sorte piler indikerer positiv PCNA farging og hvite pilene indikerer negativ PCNA farging.
Vekten av hver tumor ble også målt i hver mus ved slutten av forsøket etter avliving. Tumorvekt av individuelle mus i hver behandlingsgruppe er vist i figur 6B. Gjennomsnitt ± S.E. for tumorvekt (g) var 0,69 ± 0,05 i kontrollgruppen, 0,52 ± 0,04 for den α-tomatine-behandlede gruppen, 0,50 ± 0,04 for den curcumin gruppen behandlet, 0,33 ± 0,04 for kombinasjonen-behandlede gruppen. Statistisk analyse ved bruk av ANOVA med Tukey-Krama multiple sammenligningstest viste at den gjennomsnittlige tumorvekt i kombinasjonsgruppen var signifikant lavere enn det i den α-tomatine-behandlede gruppe (
p
0,05) og at det i curcumin-behandlede gruppen (
p
0,05). Et godt forhold mellom tumorstørrelse (målt i levende dyr før offer) og tumorvekt (mål etter avliving) i individuelle mus ble oppnådd (
r
= 0,804). Effekten av de forskjellige behandlingene på kroppsvekt, er vist i figur 6C. Statistisk analyse ved bruk av ANOVA med Tukey-Krama multiple sammenligningstest viste at forskjellene i prosent av opprinnelig kroppsvekt mellom kontrollgruppen og noen av behandlingsgruppene var ikke statistisk signifikant (
p
0,05).
effekter av α-tomatine og curcumin på spredning av PC-3 svulster
virkningene av α-tomatine og curcumin på spredning av PC-3 svulster ble undersøkt ved å bestemme uttrykket av prolifererende cell nuclear antigen (PCNA) i tumorceller. Parafin deler av PC-3 svulster ble farget med PCNA antistoff. Som vist i figur 6D, behandling av musene med α-tomatine eller curcumin alene redusert antall PCNA-positive celler i tumorer. Kombinert behandling med α-tomatine og curcumin hadde en mer potent effekt på å redusere antall PCNA-positive celler enn noen av midlene anvendes alene (figur 6D). Forskjellene i antall PCNA-positive celler var statistisk signifikante mellom kombinasjonsbehandlede gruppe og den α-tomatine-behandlede gruppe (
p
0,01), og mellom kombinasjonsbehandlede gruppe og den curcumin- behandlede gruppen (
p
0,01). En god korrelasjon mellom PCNA positive celler og tumor vekt på individuelle mus ble funnet (
r
= 0,72).
Diskusjoner
Selv om tidligere studier viste at α-tomatine eller curcumin hemmet prostata kreft celler [17, 26, 28, 33, 34], effekter og mekanismer for disse to agenter i kombinasjon med vekst og apoptose av prostatakreftceller
in vitro Hotell og
in vivo
Det er ikke rapportert. I denne studien har vi testet vår hypotese om at lave konsentrasjoner av curcumin og α-tomatine i kombinasjon vil synergi hemme NF-kB aktivering fører til sterk vekst hemming og apoptose induksjon i prostatakreftceller. Vår studie viste at α-tomatine og curcumin i kombinasjon synergi hemmet veksten og induserte apoptose i prostatakreft PC-3 celler, og disse effektene var forbundet med synergi av de to forbindelsene på avtagende NF-kB aktivitet. Tidligere studier viste at en høyere konsentrasjon av curcumin var nødvendig for å hemme veksten av prostata kreftceller (IC
50 ≈ 20 uM) [16, 35]. Imidlertid er biotilgjengeligheten av curcumin er lav [11]. En effektiv strategi er å kombinere en lav konsentrasjon av curcumin med andre antikreftmiddel. Kombinasjoner av lave doser av anticancermidler som virker ved forskjellige mekanismer kan være mer effektiv med mindre toksisitet enn de enkelte forbindelser ved høyere dosenivåer. I vår studie fant vi at en lav konsentrasjon av curcumin (5 mm) i kombinasjon med en lav konsentrasjon av α-tomatine (1 mm) synergi hemmet veksten av kultiverte prostatakreftceller. I tillegg har denne kombinasjonen sterkt hemmet veksten av PC-3-xenograft tumorer i SCID-mus. Så langt vi kjenner til, er dette den første rapporten som indikerer en sterk kombinerte effekten av lave konsentrasjoner av α-tomatine og curcumin på prostatakreftceller.
transkripsjonsfaktor NF-kB er en viktig regulator for cellevekst og overlevelse i en rekke forskjellige celler, inkludert prostata cancer-celler [36-38]. NF-kB er blitt vist å være konstitutivt aktivert i invasiv prostatakreft [39-41]. Aktivering av NF-kB er relatert til prostatakreft progresjon på grunn av transkripsjonsregulering av dens responsive gener [41]. I tillegg forutsier NF-kB-aktivering en høy risiko for tilbakefall hos pasienter med lokalisert sykdom [40, 42]. Derfor kan NF-kB tjene som et terapeutisk mål for behandlingen av prostatakreft.
