Abstract
Bakgrunn
mikroRNA MIR-101 er nedregulert i flere kreftformer, inkludert blærekreft. Men MIR-101 rolle i invasjonen, metastase, og kjemosensitivitet av blære kreft celler er fortsatt uklart. Denne undersøkelsen ble utført for å bestemme MIR-101 rolle på lymphangiogenic molekylet vaskulær endotelial vekstfaktor C (VEGF-C) og deres effekter på blærekreft celle migrasjon, invasjon, og kjemosensitivitet til cisplatin.
Metoder
To blære kreft cellelinjer (T24 og 5637), og verktøyet cellelinjen 293T ble ansatt her. Blærecancerceller ble transfektert med enten en MIR-101 overekspresjon vektor eller en kodet sekvens-lentivirus, som begge fremviste en høy transfeksjonseffektivitet. Ikke-transfeksjon ble anvendt som en uekte negativ kontroll. Sårheling og Transwell analyser ble utført for å måle cellemigrering og invasivitet. En luciferase reporter analyse ble utført for å bekrefte MIR-101 interaksjon med VEGF-C s 3 «ikke-translatert område, etterfulgt av RT-PCR og Western blot bekreftelse. En MTS analysen ble brukt til å evaluere cisplatin følsomheten av cellelinjene.
Resultater
MIR-101 overekspresjon vesentlig hemmet migrasjon og invasivitet mens betydelig styrking cisplatin følsomhet. MIR-101 negativt regulert VEGF-C protein uttrykk, og VEGF-C overekspresjon reddet effektene av MIR-101 overekspresjon, noe som indikerer at MIR-101 regulerer negativt VEGF-C protein uttrykk post-transcriptionally. MIR-101 og VEGF-C forstyrrelser uavhengig forbedret cisplatin cytotoksisitet i blæren kreftceller.
Konklusjoner
MIR-101 undertrykker VEGF-C uttrykk, hemmer cellemigrasjon og invasjon, og øker cisplatin følsomhet i blære kreftceller. Denne studien gir ny innsikt i MIR-101 rolle i blærekreft, og viser MIR-101 løfte som en potensiell molekylære mål for blærekreft
Citation. Lei Y, Li B, Tong S, Qi L, Hu X Cui Y, et al. (2015) MIR-101 Undertrykker vaskulær endotel vekstfaktor C som hemmer migrasjon og invasjon og Forbedrer Cisplatin kjemosensitivitet av blærekreft celler. PLoS ONE 10 (2): e0117809. doi: 10,1371 /journal.pone.0117809
Academic Redaktør: Ming Tan, University of South Alabama, USA
mottatt: 21 august 2014; Godkjent: 30 desember 2014; Publisert: 06.02.2015
Copyright: © 2015 Lei et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Nature Science Foundation for Youth of China (No. 81202005), Technology Plan Fund of Hunan Science (No. 2013FJ4109 ), og Central South University Innovation Fund for Independent Graduate Exploration (nr 72150050587). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blærekreft er den vanligste urinveiene malignitet, produsere ca 150.000 årlige dødsfall på verdensbasis [1] og er klinisk preget av sin progresjon, tilbakefall, metastaser, og resistens [2, 3]. Til tross for aggressiv kjemoterapi, 10-20% av ikke-muskel-invasiv blærekreft slutt videre til muskel invasiv blærekreft [4]. Anriking av blod og lymfeårer i urothelial lamina propria, blodkar invasjon, invasjonen dybde, og regional lymfeknute status har blitt identifisert som uavhengige prognostiske faktorer av svulst overlevelse etter cystektomi, med de fleste av tilfellene av stadium II og høyere distalt vendende med hver ekstra positiv lymfeknute øke dødelighetsrisiko med 20% [5,6]. Selv cisplatin er førstelinje kjemoterapi for avansert blærekreft, har cisplatin /gemcitabin (GC) regime en median tid til progresjon av bare seks måneder, og har ingen effekt på total overlevelse etter radikal cystektomi hos høyrisikopasienter [7 ]. Til tross for radikal cystektomi eller preoperativ kjemoterapi, ukontrollert lymphovascular invasjon av blærekreft fortsetter å gi et dårlig klinisk prognose [8-10]. Derfor er videre forskning på blærekreft progresjon, tilbakefall, metastaser, og kjemoterapeutisk effekt nødvendig.
microRNAs (miRNA) er fylogenetisk bevart små ikke-kodende RNA som negativt regulerer målrettede mRNA 3-utranslaterte regioner (3 « UTR) i flere kreftformer og har blitt stadig identifisert som kreftdempere eller kreftfremkallende stoffer [11-13]. Dessuten har flere mirnas tidligere blitt assosiert med kjemoterapeutisk følsomhet i flere kreftcellelinjer, inkludert blærekreft [14]. Spesielt MIR-101 har vært godt etablert som en tumor suppressor med hemmende effekt på cellulær proliferasjon, migrasjon og invasjon. Nærmere bestemt, lavere MIR-101 nivåer er tidligere blitt forbundet med blærekreft [15] samt prostata [16], eggstokk [17], kolorektal [18], lever [19], gastrisk [20], lunge [21], bryst [22], skjoldbruskkjertel [23], og melanom [24] kreft. Med hensyn til blærekreft, miRNA profilering av blæren overgangsordning celle carcinoma (TCC) prøver har avdekket at Mir-101 er nedregulert i TCC, og at MIR-101 hemmer celledeling og kolonidannelse i TCC cellelinjer gjennom direkte undertrykke den histone metyltransferase EZH2 [15]. Men MIR-101 rolle (hvis noen) i invasjonen, metastaser, og kjemosensitivitet av blære kreft celler er fortsatt uklart.
VEGF-C, et medlem av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) familie, er å anse som en viktig lymphangiogenic molekyl og er kjent for å øke permeabiliteten av lymfekar [25-27]. I kreft, er VEGF-C positivt korrelert med lymfatisk spredning i blærekreft, forbedrer lunge adenokarsinom celle migrasjon til lymfekar, og modulerer cisplatin motstand i magekreftceller [28,29,38]. Selv om blærekreft er kjent for å primært spres gjennom lymfesystemet (med spredning funnet oftest i de regionale lymfeknuter i bekkenet) [30], ingen studier har ennå identifisert et forhold (hvis noen) mellom MIR-101 med VEGF-C i blæren kreftceller . I denne studien ble MIR-101 vist seg å ha en effekt på blærekreft celle migrasjon, invasjon, og cisplatin følsomhet ved direkte å regulere sin funksjonelle mål VEGF-C. Disse dataene tyder på at Mir-101 kan være en potensiell molekylære mål for blærekreft terapi.
Materialer og metoder
Cell Kultur
blærekreftcellelinjene T24 og 5637 som vel som humane embryonale nyre verktøy cellelinje 293T brukt i denne studien ble kjøpt fra Type Culture Collection av den kinesiske Academy of Sciences (Shanghai, Kina) og ble opprettholdt i RPMI-1640 (Gibco, Grand Island, NY, USA) og Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM, Gibco, Grand Island, NY, USA), henholdsvis, supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin /streptomycin. Alle cellelinjer ble inkubert ved 37- i fuktig 5% CO
2
Plasmid Bygg og Lentivirus Forberedelse
Et fragment av MIR-101 ble generert ved hjelp av følgende primere. Forstand , 5′-CGGGTACCGGTAGTCCTTCACTTCATGGGGAG-3 «og antisense, 5′-CGGAATTCAAA- AAACCCAGCCACCTGTTTCAC-3′ og innsatt i vektoren GV209 med et grønt fluorescerende protein (GFP) reportergen innenfor AgeⅠand EcoRⅠrestriction områder. Den forannevnte MIR-101-plasmid, pHelper1.0 og pHelper2.0 ble ko-transfektert inn i 293T-celler, og den lentiviral partikkel-anrikede supernatant ble oppnådd 48 timer senere. En kryptert sekvens (5»-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 «), som ikke hadde noen homologi med det humane genet, ble brukt som en negativ kontroll kryptert. VEGF-C-cDNA ble amplifisert ved anvendelse av følgende primere: forstand, 5»-TCCGCTCGAGATGCACTTGCTGG- GCTTCTTC-3 «og antisense, 5′-ATGGGGTACCGTGCTCATTTGTGGTCTTTTCC-3′ og klonet inn i vektoren GV147 med et rødt fluorescerende protein (RFP) reporter-gen innehold restriksjonsenzymseter XhoⅠand Kpn I. Ikke-transfeksjon ble anvendt som en uekte negativ kontroll (S1 data). Alle sekvenser i forsøkene ble bekreftet ved sekvensering som følger: VEGF-C siRNA, følelse, 5»-AGAUCUGGAGGAGCAGUUAUU-3 «og antisense, 5′-UAACUGCUCCUCCAGAUCUUU-3′; negativ kontroll siRNA, følelse, 5»-UACUCACUACUCGAGAUGCUU-3 «og antisense, 5′-GCAUCUCGAGUAGUGAGUAUU-3». Deretter ble det syntetisert to komplementære VEGF-C shRNA anbragt i en pGenesil-en vektor (Genesil, Wuhan). Fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) (Epics Altra Flow Cytosorter, Beckman, USA) ble brukt for å velge GFP + eller RFP + celler i henhold til produsentens anbefalte prosedyre. Transfeksjonseffektiviteten av MIR-101 (GFP) og VEGF-C (RFP) ble beregnet som følger: MIR-101 transfeksjonseffektivitet = GFP + celletall /totale celleantallet x 100%, og VEGF-C transfeksjonseffektivitet = rfp + /totalt celle teller x 100%. På denne bakgrunn ble transfeksjonseffektiviteter Mir-101 (GFP) og VEGF-C (RFP) funnet å være 99% og 40%, henholdsvis.
RNA Isolation og kvantitativ PCR
totalt RNA ble isolert ved anvendelse av Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Isolert RNA ble målt ved anvendelse av et Nanodrop spektrofotometer 1000 (Thermo Scientific, DE, USA) med en OD
260 /OD
280 forhold større enn 1,8 anvendt for cDNA-syntese. Den reverstranskripsjon av MIR-101 og dets spesifikke amplifikasjon ble utført ved anvendelse av en miRNA QRT-PCR Detection Kit (GeneCopoeia, MD, USA). U6 ble anvendt som en endogen kontroll. cDNA syntese av VEGF-C ble utført ved anvendelse av en First-Strand cDNA Synthesis Kit (GeneCopoeia, MD, USA), og sanntids-kvantitativ PCR (RT-qPCR) omsetning av VEGF-C ble utført ved anvendelse av qPCR Mix (GeneCopoeia, MD , USA). GAPDH ble brukt for VEGF-C mal normalisering. Alle primere ble kjøpt fra GeneCopeia. MIR-101 og VEGF-C forsterkning ble bestemt på en rotor-GENE 3000 plattform. De target PCR terskel syklus (Ct) verdier ble normalisert ved å trekke U6 eller GADPH Ct verdi, som ga ΔCt verdi. Relativ uttrykk ble beregnet ved hjelp av følgende ligning: relative genuttrykk nivå = 2
– (ΔCt eksperimentgruppe-ΔCt kontrollgruppen)
Western Blot analyse
RIPA lysebuffer som inneholder en mM. PMSF ble tilsatt til cellene i seks-brønns plater og deretter sentrifugert i 10 minutter ved 4-. Det totale proteininnholdet i supernatanten ble bestemt ved Lowry-metoden. Proteinprøven ble fortynnet, oppvarmet for denaturering, og deretter underkastet natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE). Etter at proteinene ble overført til en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (Millipore, MA, USA), 5% skummet melkepulver ble påført i 2 timer ved 37-. Deretter, 1: 1000 fortynninger av kanin-polyklonale primære antistoff anti-VEGF-C (Cell Signaling Technology, MA, USA) eller anti-β-aktin (som tjente som en lastekontroll, BioWorld Technology, Inc., USA) ble inkubert med den membran over natten. Den neste dag, membranen ble skylt i TBST tre ganger, og deretter inkubert med et fluorescerende sekundært anti-kanin-antistoff i 2 timer. Membranen ble skannet av en infrarød bildesystem (Odyssey), og bandet intensiteten ble oppdaget av Odyssey 3,0 analyse programvare.
VEGF-C 3’UTR villtype og mutant Type Konstruksjon og luciferaserapportørplasmid Assay
TargetScan analyse ble brukt til å oppdage en syv-nukleotid komplementær sekvens mellom MIR-101 og VEGF-C 3’UTR. En villtype (wt) VEGF-C 3’UTR sekvens inkludert Xba1 restriksjonsseter (5′-TCTAGAACGAACCGCCAGAAGGCTTGTGAGCCAGGATTTTCATATAGTGAAG- AAGTGTGTCGTTGTGTCCCTTCATATTGGAAAAGACCACAAATGAGCTAAGATTGTACTGTTTTCCAGTTCATCGATTTTCTATTATGGAAAACTGTGTTGCCACAGTAGAACTGTCTGTGAACAGAGAGACCCTTGTGGGTCCATGCTAACAAAGACAAATCTAGA-3′) i tillegg til en mutant type (mut) VEGF-C 3’UTR sekvens med en helt annen MIR-101-bindende sekvens, ble syntetisert og uavhengig av hverandre er klonet inn i separate GV272 luciferase reporter-vektorer (Genechem, Shanghai, Kina). Den tidligere beskrevne MIR-101-overekspresjon eller kryptert-sekvens plasmid sammen med enten et vekt- eller mut VEGF-C 3’UTR plasmid ble ko-transfektert inn i 293T-celler ved anvendelse Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen, CA, USA), og skaper fire eksperimentelle grupper. Deretter 293T celle luciferase-analyser ble utført for å bestemme interaksjonen mellom MIR-101 og den vekt- og mut VEGF-C 3′-UTR. Renilla og ildflue luciferase-aktivitet ble målt ved 48 timer etter transfeksjon ved bruk av Dual-Glo Luciferase Assay System reporter ( Promega, Madison, WI, USA) i henhold til produsentens protokoller. forholdet mellom Renilla-til-ildflue luciferase verdi ble registrert (S1 tabell). eksperimenter ble utført på triplikate brønner, og dataene representerer gjennomsnittet av fem uavhengige eksperimenter.
Wound Healing analysen
målet celler, inkludert T24 og 5637 celler ble transfektert med rekombinant lentivirus (1 × 10
8 transduse enheter /ml) og polybren (5 ug /ml) . Etter 48 timer ble en trypsinert enkelt cellesuspensjon fremstilt og sådd ut i seks-brønners skåler (5 x 10
5 /brønn) inntil cellene nådde 80% konfluens. Deretter ble 1 ml sterile pipettespiss som brukes til å skrape et innlegg i sentrum (tilsvarende et sår), renset med PBS tre ganger, og det serumfrie medium ble umiddelbart erstattet. Celler ble tillatt å migrere i 24 timer, og riper ble nøye observert og fotografert. Lys mikroskopiske og fluoriserende bildene ble tatt med et Olympus IX71 mikroskop. Gapet lengder ble også beregnet fra mikrofotografiene. Hver cellelinje ble målt in triplo.
Transwell-analysen
A Transwell kammer (Corning Corporation, MA, USA) med 8-um polyester membranfilterporene, ble benyttet for både invasjonen analysen og migrasjon analysen. Forskjellen mellom invasjon analysen og migreringen analysen var at invasjonen test som benyttes belagt Matrigel (BD Bioscience, MD, USA) i det øvre kammer, som simulerte egenskapene til den ekstracellulære matriks, mens overføringen analysen ikke. Totalt 2 × 10
5 lentivirus-infiserte celler ble sådd i det øvre kammer med 200 mL serumfritt medium. En total på 500 ul medium inneholdende 20% FBS ble tilsatt til det nedre kammer. Etter inkubering i 24 timer ble cellene fester seg til den nedre overflaten av membranen på det øvre kammer fiksert i 90% etanol i 10 minutter og farget med 0,1% krystallfiolett, regnet i tre tilfeldige skudd ved mikroskopi, og fotografert. Det gjennomsnittlige antall av celler i de tre tilfeldige skuddene ble rapportert. Alle forsøk ble utført in triplo.
MTS-analysen
Cellesuspensjonen ble sådd ut i 96-brønners kulturplater ved en tetthet på 4 x 10
3 celler /brønn (0,2 ml /brønn) i 24 timer før bruk. Dyrkningsmediet ble erstattet med friskt medium inneholdende cisplatin med forskjellige konsentrasjoner i 72 timer. Deretter ble MTS (20 ul /brønn) tilsatt til hver brønn, og absorbansen ved 490 nm for hver brønn ble målt med en universell mikroplateleser (Bio-Rad Hercules, CA, USA) etter 3 timer. Dose-hemming ratekurvene ble plottet i henhold til absorbansverdier. IC50-verdien (50% maksimal hemmende konsentrasjon av cisplatin) ble også beregnet. Analysen ble gjentatt i triplikat.
Statistical Analysis
Resultater ble uttrykt som gjennomsnitt ± SDS. Alle data ble analysert ved hjelp av SPSS programvareversjon 21,0. Forsøk ble statistisk analysert ved Student
t
-test eller enveis ANOVA.
P
0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
MIR-101 hemmer blærekreft Cell migrasjon og invasjon
På grunn av tidligere funn. av lavere MIR-101 uttrykk i blærekreft [15,31], bygget vi en MIR-101 overekspresjon plasmid og pakket det inn i lentiviral vektor. Blærecancerceller ble transfektert med enten en MIR-101 overekspresjon vektor eller en kodet sekvens-lentivirus (kryptert negativ kontroll), som begge fremviste en høy transfeksjonseffektivitet (Fig. 1A). Ikke-transfeksjon ble anvendt som en uekte negativ kontroll. Vi undersøkte cellemigrering og invasjon evnen til disse blærekreftceller. Den sårheling analysen og Transwell migrasjon analysen viste at cellemigrasjon ble betydelig hemmet av MIR-101-overekspresjon lentivirus (Fig. 1B, 1C). Den hemmende effekten av MIR-101 på celle invasjon ble bekreftet av Transwell invasjonen analysen. Som et resultat, både T24 og 5637 MIR-101-overekspresjon celler i bunnflaten av det øvre kammer oppviste dramatisk inhiberer invasivitet i forhold til deres egge-sekvens-transfektert motstykker (fig. 1D).
(A) norm~~POS=TRUNC MIR-101 mRNA nivåer oppdaget av RT-qPCR. (B) Den åpne såret% (sår feltet
endelige Twitter /sår feltet
innledende
x 100%) fra såret helbredende analysen etter transfeksjon. (C) Representative bilder av migrerte celler med antallet migrerte celler per felt. Merk: T24 celler har en sterkere affinitet for krystall voldelig fargestoff. Således, selv om bildet synes å vise mer rikelig farging for T24 celler, idet T24-celler ble faktisk lavere enn de av 5637 cellen. (D) Representative bilder av invaderende celler som penetrerer den belagte Matrigel og antallet av invaderende celler per felt. Data presentert som betyr ± SDS. *
p
0,05, **
p
. 0,01
MIR-101 Mål Direkte VEGF-C i 293T celler
for å evaluere den molekylære mekanismen (e) av MIR-101, TargetScan analyse fant at VEGF-C er et potensielt mål genet for MIR-101, som det er en syv-nukleotid komplementær sekvens mellom MIR-101 og VEGF-C 3 «UTR (fig. 2A). Således viste et luciferase reporter analyse som MIR-101 oppreguleringen betydelig redusert luciferase aktiviteten av villtype-VEGF-C, men ikke den mutante VEGF-C (Fig. 2B). Deretter ble RT-qPCR og Western blotting anvendes for å vurdere den VEGF-C-mRNA og proteinnivåer, henholdsvis (fig. 2C, 2D). MIR-101 overekspresjon betydelig hemmet VEGF-C protein uttrykk, men ikke signifikant hemmer VEGF-C mRNA uttrykk i både T24 og 5637 celler, noe som tyder på post-transcriptional regulering av VEGF-C av MIR-101.
(A ) de potensielle bindingssteder for MIR-101 på de syv bp-frø sekvenser av 3’UTR regionen av VEGF-C. Mutanttypen ble bygget på dette frøet regionen som understreket (vekt: villtype, Mut: mutant type). (B) Firely /Renilla luciferase aktivitet etter transfeksjon med vekt og mut VEGF-C 3’UTR og enten MIR-101-overekspresjon vektor eller et egge-sekvens vektor. (C) VEGF-mRNA-ekspresjon C målt ved hjelp av RT-qPCR i transfekterte cellelinjer som viser ingen signifikante forskjeller i VEGF-C-mRNA-ekspresjon på tvers av de tre transfeksjon tilstander. (D) Western blot-analyse av VEGF-C-ekspresjon i transfekterte cellelinjer som viser MIR-101-overekspresjon i betydelig grad å undertrykke VEGF-C proteinekspresjon. Data presentert som betyr ± SDS. **
p
. 0,01
VEGF-C Overuttrykte berger MIR-101 invasjon Effects
For å bekrefte rollen som VEGF-C i blærekreft cellelinjer utførte vi redde eksperimentering (S1 fig.). Etter T24-celler ble transfektert med den MIR-101 lentivirus i 48 timer, ble de transient transfektert med VEGF-C overekspresjon plasmid (fig. 3A) for å undersøke utvinning av cellemobilitet. Den Transwell invasjonen analysen viste at den etterfølgende transfeksjon av VEGF-C delvis gjenvunnet cellenes evne invasjon i forhold til VEGF-C negativ kontroll og ikke-transfektert grupper (Fig. 3B). Som forventet, ble VEGF-C-proteinnivå reddet (Fig. 3C). Dermed er hemming av blærekreft celle invasjon av MIR-101 trolig en konsekvens av redusert VEGF-C uttrykk.
(A) Representative bilder av blæren kreftceller samtidig transfektert med MIR-101 /grønt fluorescerende protein (MIR -101 /GFP) og VEGF-C /rød fluorescerende protein (VEGF-C /RFP). (B) Representative bilder av invasive celler trenger inn i belagt Matrigel transfektert med enten MIR-101, MIR-101 og VEGF-C (MIR-101 /VEGF-C (+)), MIR-101 og en negativ kontroll av VEGF-C (MIR-101 /VEGF-C (-)), eller ikke-transfeksjon (mock). (C) Western blot analyse validering VEGF-C protein uttrykk i de transfekterte cellelinjer.
MIR-101 Overuttrykte og VEGF-C knockdown Uavhengig Forbedre Blære Cell Følsomhet for Cisplatin
MIR -101 overekspresjon økte følsomheten av både T24 og 5637-celler til cisplatin, med IC50-verdien øker fra 4,06 ± 0,69 mg /l til 9,17 ± 1,24 mg /l og fra 2,96 ± 0,46 mg /l til 5,56 ± 0,36 mg /l, henholdsvis (fig. 4A, 4B). For å bestemme VEGF-C rolle i cisplatin følsomhet, ble en VEGF-C forstyrrelser plasmid konstruert og transfektert inn i blærecancercellelinjer (Fig. 5A). Sensitiviteten av T24 og 5637-celler til cisplatin øket etter VEGF-C forstyrrelser, med IC50-verdien øker fra 2,56 ± 0,31 mg /l til 8,23 ± 0,83 mg /l og fra 3,01 ± 0,5 5 mg /l til 5,42 x 0,52 mg /l henholdsvis (fig. 5B, 5C). Disse resultatene tyder på at VEGF-C nedregulering, som den nedstrøms mål for MIR-101, forbedrer blærekreft celle følsomhet overfor cisplatin.
(A) Plott av dose inhibering ratekurvene for cisplatin måling av celleantallet etter transfeksjon med enten MIR-101-overekspresjon eller egge-sekvens lentivirus. (B) IC50 verdier betydelig redusert på MIR-101 overekspresjon. Data presentert som betyr ± SDS. **
p
. 0,01
(A) Western blot analyse av VEGF-C uttrykk i cellelinjer transfektert med VEGF-C shRNA eller kontroll shRNA. (B) plott av dose hemming rentekurvene for cisplatin måleceller etter transfeksjon med VEGF-C shRNA eller kontroll shRNA. (C) IC50-verdien signifikant redusert etter VEGF-C knockdown. Data presentert som betyr ± SDS. **
p
. 0,01
VEGF-C Overuttrykte berger MIR-101-indusert Cisplatin Sensitivity
Etter T24 celler ble transfektert med MIR-101 lentivirus i 48 timer, ble de deretter transient transfektert med enten en VEGF-C overekspresjon plasmid, et VEGF-C-kontroll-plasmid, eller en VEGF-C shRNA plasmid. Vi fant at VEGF-C overekspresjon delvis gjenvinnes blærekreft celle følsomhet overfor cisplatin, sammenlignet VEGF-C kontroll med IC50-verdier of10.05 ± 1,05 mg /l og 3,14 ± 1,02 mg /l til 0,63 ± 0,16 mg /l, henholdsvis (fig . 6A, 6B). Videre shVEGF-C mer betydelig forbedret blærekreft celle følsomhet for cisplatin sammenlignet med VEGF-C-kontroll (Fig. 6A, 6B).
(A) Tomter av dose hemming rentekurvene for cisplatin måle celletall etter transfeksjon med enten MIR-101 og VEGF-C (MIR-101 /VEGF-C (+)), MIR-101 og en negativ kontroll av VEGF-C (MIR-101 /VEGF-C (-)), eller speil 101 og VEGF-C shRNA (MIR-101 /shVEGF-C). (B) IC50 verdi ble betydelig økt etter transfeksjon med MIR-101 /VEGF-C (+).
Diskusjoner
Emerging bevis viser at Mir-101 uttrykk er tapt i blære kreft vev og blærekreft cellelinjer [15,31]. De NDY1 /KDM2B-MIR-101-EZH2 aksen har blitt identifisert som aktive i blærecancerceller [32], karakterisert ved at MIR-101 undertrykker motiliteten av T24 blærecancerceller ved å målrette c-Met 3′-UTR [33]. Det gjenstår imidlertid den detaljerte molekylære mekanisme (r) av MIR-101 rolle i blærecancerceller til å bli belyst. Derfor, ved å benytte en TargetScan basert bioinformatiske tilnærming for å søke etter potensielle MIR-101 mål, identifiserte vi VEGF-C som en potensiell MIR-101 mål. Vi konstruerte en MIR-101-overekspresjon lentivirus for transfeksjon inn i T24 og 5637 blærekreft cellelinjer og viste at MIR-101 overekspresjon hemmer blærekreft celle migrasjon og invasjon. Videre viste vi at MIR-101 regulerer negativt VEGF-C protein uttrykk, og VEGF-C overekspresjon redder effektene av MIR-101 overekspresjon, noe som tyder på at MIR-101 regulerer negativt VEGF-C uttrykk post-transcriptionally. Til slutt viste vi at både MIR-101 og VEGF-C forstyrrelser uavhengig forbedret cisplatin cytotoksisitet i blæren kreftceller, og VEGF-C også reddet MIR-101 effekt på blærekreft celle følsomhet for cisplatin.
Produksjon og sekresjon av VEGFs-potente stimulatorer for angiogenese som påvirker endotelial celleproliferasjon og motilitet, så vel som vaskulær permeabilitet-har vanligvis blitt observert i flere aggressive krefttyper og påvirker prognose av kreftpasienter [28] i betydelig grad, selv om VEGF-C har vist seg å har angiogene effekter på endotelceller [34], VEGF-C virker primært lymphatically gjennom Flt4 /VEGFR-3 og KDR /VEGFR-2-reseptor-tyrosin-kinaser [35], som utelukkende er uttrykt i lymfatisk endotel og høy venular endotel av lymfe noder i normale voksne vev. For eksempel har VEGF-C overekspresjon vist seg å gi lymfatisk endotel proliferasjon og hyperplasi av selektiv det lymfatiske vaskulaturen [36].
Når det gjelder VEGF-C rolle i malignitet, VEGF-C-mRNA-ekspresjon ble først oppdaget i et blandet sett av faste humane tumorer med VEGF-C rolle i lymphangiogenesis å tilveiebringe en mulig mekanisme for metastasering via nydannede lymfekar [37]. Senere studier oppdaget at VEGF-C primære reseptor Flt4 /VEGFR-3 er uttrykt i en rekke menneskelige maligniteter, inkludert lunge, colorectal, prostata, og plateepitelkarsinom i hode og nakke samt Kaposis sarkom [28]. Dessuten har positive korrelasjoner er funnet mellom VEGF-C-ekspresjon og lymfatiske spredning i blæren TCC [38] samt i prostata [39], kolorektal [40], gastrisk [41], skjoldbrusk [42], og neuroblastom-kreft [43 ]. VEGF-C downregulation reduserer muse lunge og tykktarm kreft metastaser, og Flt4 /VEGFR-3-hemming har vært forbundet med redusert angiogenese /lymphangiogenic aktiviteter samt redusert vekst og metastasering i bryst, bukspyttkjertel, og eggstokkreft, banet vei for utviklingen og testing av VEGFR3 hemmere som målrettede kjemoterapeutika [44]. Her, MIR-101 overekspresjon trykt VEGF-C proteinekspresjon, svekke blærekreft cellemigrering og invasjon
in vitro
i fravær av lymphangiogenesis. Disse funnene tyder på at VEGF-C virker gjennom ikke-lymphangiogenic mekanismen (e) for å fremme blære tumor progresjon. Videre forskning er nødvendig for å bestemme nedstrøms affector (e) av VEGF-C-Flt4 /VEGFR-3 akse i blæren kreftceller som fremmer blærekreft celle mobilitet.
Cisplatin cellegift forblir førstelinjebehandling for lokalt avansert blære kreft, så cisplatin resistens er en vesentlig klinisk problem for pasienter med blærekreft [45]. Selv om vi fant ingen tidligere arbeids gransker MIR-101 rolle om cisplatin motstand i blærecancerceller, MIR-101 uttrykk er blitt vist å bli nedregulert i docetaxel-indusert cisplatin kryssresistente hode og hals squamous cell carcinoma-cellelinjer [46], mens MIR-101 er blitt vist å virke synergistisk med cisplatin, doksorubicin, og fluoruracil i indusering av apoptose i leverkreft celler [47,48]. Som MIR-101 s-antagonist, fremmer VEGF-C cisplatin motstand i magekreftceller [29], og VEGF-C oppregulering resulterer i tumorresistens til anti-VEGF-terapi i en murin modell lungekreft [49]. Etter avtale med disse tidligere funn, her både MIR-101 og VEGF-C forstyrrelser ble vist til selvstendig forbedre cisplatin cytotoksisitet i blæren kreftceller, og VEGF-C også reddet MIR-101 effekt på blærekreft celle følsomhet for cisplatin. Imidlertid er mekanismen (e) underliggende VEGF-C rolle i cisplatin motstanden av blærecancerceller forblir ukjent, og krever videre studier.
Det er to begrensninger for denne studien. For det første viser denne studien at VEGF-C spiller en nøkkelrolle i blærekreft celle migrasjon, invasjon, og cisplatin kjemosensitivitet og er et direkte mål på MIR-101. Men dette faktum ikke utelukke muligheten for at MIR-101 har andre mål som har lignende cellulære funksjoner til VEGF-C. Bruke TargetScan databasen, fant vi 803 transkripsjoner som er spådd til å bli mål for HSA-MIR-101, inkludert EZH2, BTBD3, NLK, og MITF. Videre studier er nødvendig for å fastslå om disse 803 mulige målene er faktiske mål av MIR-101, og om slike protein mål er assosiert med blærekreft celle migrasjon, invasjon, og cisplatin kjemosensitivitet. For det andre har tidligere arbeid vist at MIR-101 er nedregulert i TCC og at MIR-101 hemmer TCC celleproliferasjon og kolonidannelse gjennom direkte undertrykke den histone metyltransferase EZH2 [15]. Derfor, i denne studien, hadde vi ikke vurdere MIR-101 er effekter på blærekreft celleproliferasjon men heller spesielt fokusert på MIR-101 innflytelse på blærekreft celle migrasjon og invasjon gjennom VEGF-C. Dermed hvorvidt MIR-101-VEGF-C akse påvirker blærekreft celleproliferasjon fortsatt et åpent spørsmål. For det tredje, transfeksjonseffektiviteten av MIR-101 lentivirus var 99%, men transfeksjonseffektiviteten av VEGF-C plasmid var bare 40%; på grunn av tekniske problemer fotografiske, antok vi at alle celler ble MIR-101 + (GFP +) og derved utvalgte celler ved FACS utelukkende på grunnlag av VEGF-C + (RFP +). Kort sagt, VEGF-C + (RFP +) celler ble ansett som dobbelt-positive celler. På grunn av denne tekniske begrensninger, var det vanskelig å riktig vurdere samlokalisering av MIR-101 og VEGF-C mRNA.
Oppsummert viser vi MIR-101 post-transcriptionally undertrykker VEGF-C uttrykk, hemmer blære kreft celle migrasjon og invasjon, og øker cisplatin følsomhet. Selv om mer forskning er nødvendig for å identifisere andre relevante mål av MIR-101, denne studien gir ny innsikt i MIR-101 rolle i blærekreft, og viser MIR-101 løfte som en potensiell molekylære mål for blærekreft.
Hjelpemiddel informasjon
S1 data. Byggingen av MIR-101-overekspresjon Plasmid og VEGF-C-overekspresjon Plasmid
doi: 10,1371 /journal.pone.0117809.s001 plakater (DOC)
S1 Fig. Representant Bilde av blærekreft T24 celler samtidig tilført med MIR-101 /grønt fluorescerende protein (MIR-101 /GFP) og VEGF-C /rød fluorescerende protein (VEGF-C /RFP)
doi: 10,1371 /journal.pone. 0117809.s002 product: (TIF)
S1 Table. Firely /Renilla luciferase Analyser av Transfeksjon med vekt og mut VEGF-C 3’UTR og enten MIR-101-overekspresjon Vector eller en egge-sekvens Vector
doi:. 10,1371 /journal.pone.0117809.s003
(XLSX)
