Abstract
Snail1 er en transkripsjonsfaktor som induserer epiteliale til mesenchymale overgang (EMT). Under EMT, epitelceller miste sine veikryss, reorganisere sine cytoskeletons, og omprogrammere genuttrykk. Selv om Snail1 er en fremtredende repressor av E-cadherin transkripsjon, er dens nøyaktige roller i hver av de fenomener av EMT ikke er fullstendig forstått, spesielt i cytoskeletal endringer. Tidligere studier har ansatt genet knockdown systemer for å bestemme funksjonene Snail1. Imidlertid er ufullstendig protein knockdown ofte forbundet med disse systemene, som kan forårsake feil tolkning av dataene. For mer nøyaktig å evaluere funksjonene i Snail1, vi genereres en stabil cellelinje med en målrettet ablasjon av Snail1 (Snail1 KO) ved hjelp av CRISPR /Cas9n system. Snail1 KO-celler viser økt celle-celle-adhesjon, redusert celle-substrat adhesjon og cellevandring, endringer i deres cytoskeletal organisasjon som inkluderer noen spennings fibre og rikelig kortikale aktin, og oppregulering av epiteliale markørgener som E-cadherin, occludin, og claudin -1. Men morfologiske endringer ble indusert ved behandling av Snail1 KO celler med TGF-beta. Andre transkripsjonsfaktorer som induserer EMT ble også indusert ved behandling med TGF-beta. Den nøyaktige sletting av Snail1 av CRISPR /Cas9n system gir klare indikasjoner på at tap av Snail1 fører til endringer i aktin cytoskjelettet, reduserer celle-substrat heft, og øker celle-celle adhesjon. Behandling av RMG1 celler med TGF-beta antyder redundans blant de transkripsjonsfaktorer som induserer EMT
Citation. Haraguchi M, Sato M, Ozawa M (2015) CRISPR /Cas9n-mediert Sletting av sneglen 1Gene (
SNAI1
) avslører sin rolle i å regulere Cell morfologi, celle-celle interaksjoner og genuttrykk i Ovarian Cancer (RMG-1) celler. PLoS ONE 10 (7): e0132260. doi: 10,1371 /journal.pone.0132260
Redaktør: Michael Klymkowsky, University of Colorado, Boulder, USA
mottatt: 20 desember 2014; Godkjent: 11 juni 2015; Publisert: 10. juli 2015
Copyright: © 2015 Haraguchi et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan. Gi Nummer: 22590287 til MH. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
epithelial-til-mesenchymale overgang (EMT) er en vanlig prosess som oppstår under utvikling, sårheling og kreft metastasering. Under EMT, epitelceller miste sine veikryss, endre sin form, reorganisere sine cytoskeletons, og omprogrammere genuttrykk [1]. Denne endringen i genuttrykk induseres av flere mester regulatorer, inkludert Snail1, vri, og sink-finger E-box binding (ZEB) transkripsjonsfaktorer. Deres bidrag til induksjon av EMT avhengig av celletypen og den signalveien som initierer EMT. De kontrollerer ofte ekspresjonen av hverandre og funksjonelt samvirke ved målgener [1]. EMT er regulert av signalveier mediert av flere cytokiner, inkludert Wnt, hakk og transformerende vekstfaktor (TGF) -beta [2]. TGF-beta signalveien har en dominerende rolle blant dem [1]. Ved induksjon av EMT av TGF-beta, er transkripsjonsfaktorer som Snail1 oppregulert [3]. Snail1 rolle i EMT har blitt grundig studert. Snail1 er en sterk repressor av epitel-markører som E-cadherin, er Claudins og occludins. På den annen side øker Snail1 ekspresjonen av mesenchymale markører slik som vimentin og fibronektin [4], [5]. Vi har bekreftet at Snail1 regulerer celle-matrise-adhesjon gjennom regulering av ekspresjonen av integrin og basalmembranproteiner, slik som laminins [6]. Snail1 er primært tenkt for å indusere EMT gjennom direkte undertrykkelse av E-cadherin, noe som fører til kjernefysisk beta-catenin translokasjon og ytterligere endringer i transkripsjon [7]. Snail1 genekspresjon rapportert å indusere endringer i celleform og bevegelser [5]. Disse endringene krever endringer i aktin organisasjon. Imidlertid er de molekylære mekanismene som kontrollerer F-aktin dynamikk i løpet av EMT ikke fullt ut forstått [1]. Nylig McGrail undersøkt hvilken rolle Snail1 i cytoskeletal reformasjon og aktin dynamikk. De undersøkte effekten av Snail1 på ekspresjonen av aktin-cytoskjelett-relaterte gener [8]. Vi prøvde også å avklare effekten av Snail1 på cellen form og aktin konformasjon ved å slette Snail1 fra RMG1 celler.
Funksjonen Snail1 har blitt evaluert i flere typer kreftceller gjennom bruk av RNA interferens (RNAi) [9]. Imidlertid er knockdown av target-genekspresjon av RNAi ufullstendig og midlertidig [10]. For å fastslå den nøyaktige rollen Snail1 under induksjon av EMT, har vi ansatt en ny genom redigering system kalt «gruppert regelmessig interspaced Korte palindromic Gjentar (CRISPR) /CRISPR-assosiert 9 (Cas9)» The CRISPR /Cas9 Systemet består av to komponenter : den Cas9 protein og en guide RNA (gRNA). Den Cas9 protein besitter nuklease-aktivitet og kan indusere dobbelt-trådet pauser (DSB) i en hvilken som helst genomisk DNA-sekvens styrt av et gRNA, forutsatt at en protospacer tilstøtende motiv (PAM) sekvens eksisterer på målet locus [11]. I fravær av en reparasjon mal, blir ligert gjennom en ikke-homolog ende-sammenføyning prosess, noe som fører til små innsetting eller delesjonsmutasjoner som er kjent som indels. Således CRISPR /Cas9 muliggjør spesifikk genomisk avbrudd [12]. Nyere studier har vist at CRISPR /Cas9 kan være svært aktive i humane celler, selv med ufullstendig passet RNA-DNA-grensesnitt. Derfor kan CRISPR /Cas9 system induserer høyfrekvente off-target mutagenese i humane celler [13]. For å unngå off-target mutagenese, Ran et al [14] utviklet en strategi som kombinerer aspartae til alanin (D10A) mutant nickase versjon av Cas9 (Cas9n) med et par offset gRNAs komplementær til motsatte tråder av målområdet. Cas9n hakk DNA for å gi enkeltrådet pauser. Disse pausene er fortrinnsvis reparert gjennom homologi-rettet reparasjon, noe som reduserer hyppigheten av uønskede Indel mutasjoner som følge av off-target DSB sin [12]. Når Cas9n er kombinert med et par av gRNAs, fører dobbelthakkdannelsen DSB ved bare den genomiske loci hvor begge gRNAs bindes i en passende avstand. Dette øker effektivt spesifisitet målet anerkjennelse. Dette dobbelthakkdannelsen systemet er rapportert å redusere off-target-aktivitet ved 50- til 1500 ganger i cellelinjer [14].
I denne studien vi benyttet det CRISPR /Cas9n system spesifikt blokkere Snail1 ekspresjon i humane eggstokkene adenokarsinom (RMG-1) celler [15] og bestemmes effekten av denne sneglen knockout (KO) på celle morfologi og funksjon, samt TGF-beta-indusert EMT.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Forsøk med rekombinant DNA-teknologi ble utført i samsvar med retningslinjene i Kagoshima Universitetet komité for rekombinant DNA. Sikkerheten godkjenningsnummer er 26005.
cellelinje og kultur
Menneskelig eggstokkene mesonephroid adenokarsinom cellelinje RMG1 [15] ble innhentet fra JCRB (japansk Innsamling av forsknings Bioressurser, Osaka) Cell Bank og dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) (Nissui, Tokyo) supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS) (Nichirei Biosciences, Inc. Tokyo).
Antistoffer og reagenser
mus monoklonalt antistoffer (mAbs) mot menneske E-cadherin (klone 36, BD Biosciences, San Jose, CA), human Snail1 (klone L7042, Cell Signaling, Danvers, MA), human vimentin (klone V9, Zymed, Carlsbad, California), human vinculin (klone hVIN-en, Sigma, St. Louis, MO), humant vitronektin (klon 342 603, R en halv ble utsatt for forplantning og den andre halvparten ble brukt for å vurdere ekspresjonen av Snail1 ved hjelp av Western blotting. Fem kloner viste en signifikant reduksjon i Snail1 uttrykk. Derfor ble de genomiske DNA fra disse klonene isoleres. DNA-fragmenter (182 bp i størrelse) som dekket gRNA målområder ble forsterket ved hjelp av PCR. Primere -57F (5′-GAGTGGTTCTTCTGCGCTAC-3 «) og 125R (5′- CCCACGCAGCCTTCGCCTGT-3») ble brukt for PCR. PCR-produktene ble bekreftet ved hjelp av gelelektroforese, renset ved anvendelse av QIAquick gel utvinning kit (Quiagen, Hilden Tyskland), og direkte sekvensert for å detektere mutasjonen slettingen. PCR-produkter fra 5 kloner inneholdt delesjonsmutasjoner. For å bekrefte hvorvidt disse koloniene har mutasjoner i begge allelene (såkalte bi-allelisk KO), disse PCR-produktene ble sub-klonet inn i pGEM-T Easy vektor (Promega Fitchburg, WI) og forsterkes i en bakteriell vert; deretter plasmid DNA fra individuelle kolonier ble sekvensert.
Transfeksjon av Snail1 KO celler med Snail1 (rednings eksperiment)
Snail1 KO celler (2 × 10
5) ble transfektert med 2,5 mikrogram av HA-merket human Snail1 plasmid (pCAGGS-Snail1 HA) med Lipofectamine 2000 eller polyetylenimin max (Polysciences Inc, Warrington, PA). Vi var i stand til forbigående transfektere Snail1 KO celler med Snail1, men vi klarte ikke å stabilt transfektere Snail1 KO celler med Snail1.
Western blotting
Western blotting ble utført som beskrevet tidligere, med mindre modifikasjoner [6]. Celler ble kokt i 5 minutter i natriumdodecylsulfat (SDS) gel-prøvebuffer. Identiske mengder protein ble separert med 10% polyakrylamidgelelektroforese, og ble overført på nitrocellulosemembraner (Whatman Protran BA83, 0,2 mikrometer, GE Healthcare, Wauwatosa WI). Membranene ble blokkert med 5% ikke-fettholdig melk i Tris-bufret saltvann (TBS), og ble deretter inkubert med spesifikke primære antistoffer (1: 1000) over natten. Dette ble etterfulgt av behandling med peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer. Etter vasking med TBS, ble proteinbånd visualisert ved forsterket kjemiluminescens (ECL) (PRN 2106, GE Healthcare, Wauwatosa WI).
immunfluorescens farging
Celler ble dyrket på dekkglass i 48 timer og fast med 3% paraformaldehyd i fosfat-bufret saltvann (PBS) (-) i 30 minutter ved romtemperatur. Cytoskjelettet ble visualisert ved farging med rhodamin-konjugert X phalloidine i PBS (-) inneholdende 0,1% TritonX-100 i 30 minutter ved romtemperatur. Celler ble analysert ved hjelp av en konfokal laser scanning mikroskop (Carl Zeiss LSM700).
RNA isolering og real-time PCR-analyse
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp ISOGEN II (Wako, Osaka) og reverse transkribert ved hjelp ReverTra Ace revers transkriptase (Toyobo, Osaka). Den resulterende cDNA ble utsatt for kvantitative RT PCR (QRT-PCR) med Syber premix Ex Taq (PR820, Takara Bio, Ohtsu). QRT-PCR ble utført ved hjelp av Step One Plus Real-Time PCR system (Applied Biosystems, Fostercity, CA). Expression nivåer ble kvantifisert ved hjelp av ΔΔCt metoden med
GAPDH
som kalibratoren. Primere som brukes i denne analysen er oppført i Tabell 1.
Vedlegg analysen
Vedlegget Analysen ble utført som tidligere beskrevet, med mindre modifikasjoner [6]. Cellene ble vasket og inkubert med 0,125% trypsin-0,01% EDTA i 10 minutter ved romtemperatur. De frigjorte cellene ble oppsamlet og suspendert i DMEM supplert med 10% FCS. Celler (1,5 x 10
4) ble sådd på ikke-belagte 96-brønners plater eller 96-brønners plater som var blitt pre-inkubert med DMEM inneholdende 10% FCS. Det samme antall av celler ble sådd ut i 96-brønners plater som var forhåndsbelagt med poly-lysin for normalisering. Etter 4 timer inkubasjon ble ikke-adherente celler ble fjernet ved vasking og adherente celler ble fiksert med 70% etanol i 20 min. Etter farging med en 0,1% oppløsning av krystallfiolett i PBS i 30 minutter, ble cellene skylt og deretter oppløst ved hjelp av 0,5% TritonX-100 i PBS. Den optiske densitet av de oppløste cellene ble målt ved 595 nm. Antallet vedlagte celle ble kalkulert ved hjelp av en standardkurve (celleantall sammenlignet med absorbansverdier). Forholdet mellom festede celler ble uttrykt som antall festede celler i ikke-belagte eller pre-inkuberes brønnene dividert med de i poly-lysin belagte brønner.
Scattering assay
spredning analysen var utført som tidligere beskrevet, med mindre modifikasjoner [17]. Cellene ble vasket og inkubert med 0,125% trypsin-0,01% EDTA i 10 minutter ved romtemperatur. De frigjorte cellene ble oppsamlet og suspendert i DMEM supplert 10% FCS. Celler (1,5 x 10
4) ble utsådd i 96-brønners plater. Etter 72 timers inkubering ble celle spredning undersøkt ved hjelp av fasekontrastmikroskopi. Celle spredning ble kvantifisert ved å telle antall isolerte celler fra kolonier i tilfeldig valgte fase-kontrast. Det relative antall av spredning ble bestemt ved å dele antall sprednings celler avledet fra Snail1 KO1 eller fra Snail1 KO1 + Snail1 celler med antall sprednings celler avledet fra villtype (WT) celler.
Dissosiasjon assay
dissosiasjon analysen ble utført som beskrevet tidligere, med mindre modifikasjoner [18]. Celler (5 x 10
4) ble utsådd i 24-brønners plater og dyrket i DMEM med eller uten TGF-beta. Etter å ha nådd konfluens ble cellene vasket og inkubert med 0,125% trypsin eller 0,125% trypsin-0,01% EDTA i 10 minutter ved 37 ° C. Frigjorte celler ble nøye vasket med PBS (-) og utsettes for mekaniske påkjenninger ved pipettering med en 1 ml pipette fem ganger. Celle fragmenter ble fikset med 3% paraformaldehyde i 20 min og farget med krystallfiolett (Sigma Aldrich, St. Louis MO). Etter nøye vasking ble antallet partikler per felt telles (minst fem ulike felt). Det relative antall partikler som er representert ved antall fragmenterte cellepartikler avledet fra det angitte celletype dividert med antall fragmenterte cellepartikler avledet fra WT-celler dyrket uten TGF-beta.
Migration assay
migrasjon analysen ble utført som beskrevet tidligere, med mindre modifikasjoner [6]. Migreringsforsøk ble utført i Transwell kamre med et 8 pm porestørrelse (Corning, 3422, Tewksbury, MA). I korthet ble 0,1 ml celler (4 x 10
5 celler /ml) i DMEM supplert med 0,1% bovint serumalbumin (BSA) ble sådd på de øvre brønnene. I de lavere brønner, 0,6 ml DMEM supplementert med 0,1% BSA som inneholdt 2,5% FCS ble tilsatt. Etter 4 timers inkubasjon ble ikke-migrerende celler på den øvre overflaten av membranen helt skrubbes av og 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) (sluttkonsentrasjon 0,5 mg /ml) ble tilsatt til de nedre brønnene og inkubert i 3 timer. Den trekkende cellene er festet til den nedre overflate av membranen dannede blå flekker som inneholder formazan. Disse stedene ble fotografert og telles. Det relative antall migrerte celler er representert ved antallet migrerte celler av angitte celletype dividert med antall migrerte WT celler dyrket uten TGF-beta.
Statistiske analyser
Statistiske analyser av uavhengige prøver ble utført ved anvendelse av Students t-test. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.M. To nivåer av statistisk signifikans er merket med en stjerne (**
P
0,05 og *
P
0,01).
Resultater
Generation av Snail1 KO celler ved hjelp av CRISPR /Cas9n system
for å bestemme roller Snail1 under induksjon av EMT, brukte vi CRISPR /Cas9n system for å generere stabile RMG1 cellelinjer stiller ablasjon av genet som koder Snail1. RMG1 celler ble ko-transfektert med pX335-Cas9-g snail1 1, som bæres target en sekvens, pX335-Cas9-g snail1 2, som bæres mål-2-sekvensen, (Fig 1 A) og pEGF-N1, som bar en G418-resistens markør. Ca. 50 kolonier ble analysert etter G418-seleksjon. Halvparten av cellene i hver koloni ble lysert, og deretter lysatet ble brukt for å vurdere Snail1 ekspresjon ved western blotting. Fem kloner viste en signifikant reduksjon i snegle uttrykk. Derfor ble genomisk DNA isolert fra hver av disse klonene. DNA-fragmenter som dekker både gRNA målregioner ble amplifisert og de resulterende PCR-produkter ble utsatt for direkte sekvensering. Hver av disse PCR-produkter hadde delesjonsmutasjoner. For å bekrefte hvorvidt begge allelene hadde delesjonsmutasjoner, ble PCR-produktene klones inn i en pGEM-T vektor og forsterkes i en bakteriell vert. Plasmid DNA isolert fra flere kolonier som stammer fra hvert PCR-produkt ble sekvensert. To kloner viste 24 bp slettinger i begge alleler (fig 1B og 1C). Vi utpekt disse klonene Snail1 KO1 og Snail1 KO2. Hver av de resterende tre kloner inneholdt en WT allel. Fordi Snail1 KO 1 og Snail1 KO2 hadde samme sletting, brukte vi Snail1 KO 1 celler i følgende eksperimenter. Fraværet av Snail1 uttrykk i Snail1 KO 1 celler ble bekreftet av kvantitativ real-time PCR (Fig 2B) og western blotting (Fig 2C).
(A) Representative bilder viser cellen morfologi av villtype ( WT) RMG celler (I), Snail1 KO1 celler (II). Celler blir visualisert ved fasekontrastmikroskopi. Scale bar indikerer 50 mikrometer. WT celler utstilt brosteinslignende morfologi, mens de fleste av de Snail1 KO1 cellene viser en mer avrundet morfologi. Representative bilder av aktin cytoskeletons av WT celler (III) Snail1 KO1 celler (IV) farget med rhodamine X-konjugert phalloidine og visualisert ved hjelp av en konfokal laser scanning mikroskop (Zeiss LSM700). Bilder fra 5 til 10 bilder per prøven ble tatt. Forsøkene ble gjentatt 5 ganger. WT celler som er rike på stress-fibre, mens Snail1 KO1 celler har knappe spennings fibre, men kortikal aktin på deres celleoverflater. Scale bar indikerer 20 mikrometer. (B) Kvantitativ RT-PCR av indikert gener i vill-type (WT) RMG celler, Snail1 KO1 celler og Snail1 KO1 celler transient transfektert med en Snail1 ekspresjonsvektor (Snail1 KO1 + Snail1 celler). Verdier er uttrykt som gjennomsnittet verdier ± S.E.M. av triplikate prøver. Forsøkene ble gjentatt tre ganger. Statistisk signifikans er merket med en stjerne (*
P
0,05 og **
P
0,01 hjelp Studentenes
t
-test). Snail1 KO1 celler viste en fullstendig tap av Snail uttrykk og økt uttrykk av
E-cadherin
,
claudin-en
,
occludin
,
beta-aktin
og
alpha-tubulin
, samt redusert uttrykk for
grin alpha 5
. Forbigående uttrykk for Snail1 i Snail1 KO celler reversert disse effektene, med unntak av økningen i
occludin
uttrykk. (C) Western blot-analyse av proteiner som er angitt i villtype (WT) RMG celler, Snail1 KO1 celler og Snail1 KO1 celler transient transfektert med en ekspresjonsvektor Snail1 (Snail1 KO1 + Snail1 celler). Snail1 KO1-celler viste et fullstendig tap av Snail1 uttrykk og en økning av E-cadherin, occludin og claudin-1, beta-aktin, tubulin alfa, så vel som et redusert i integrin alpha 5 uttrykk. Transient ekspresjon av Snail1 i Snail1 KO-celler reversert disse effektene, med unntak av redusert i integrin alpha 5 uttrykk. Vinculin ble anvendt som en kontroll lasting. Forsøkene ble gjentatt tre ganger.
Ablasjon av Snail1 genet endrer morfologi og genuttrykk i RMG1 celler
Wild-type RMG1 celler utstilt brosteinslignende morfologi (fig 2A-2I, S1 fig-i), mens de fleste av de Snail1 KO-celler viste en mer avrundet morfologi (fig 2A-II, fig S1-II). Fordi cytoskeletal organisasjonen er kjent for å være direkte knyttet til celle morfologi, undersøkte vi lokalisering av aktin cytoskjelettet hjelp rhodamine X-konjugert phalloidin. WT-celler viste aktin spennings fibrene i deres cytoplasms (figur 2A-III, fig S1-III). I motsetning til det kortikale aktin av Snail1 KO-celler viste et tykt, avrundet form (figur 2A-IV, fig S1-IV). Snail1 undertrykker ekspresjonen av epitel-markører som E-cadherin, claudin-1 og occludin [19]. Analyse ved hjelp QRT-PCR viste at Snail1 KO1 celler utstilt økt uttrykk av
E-cadherin
,
claudin-en
,
og occludin
. For å utføre en rednings eksperiment ble en Snail1 ekspresjonsvektor innføres i Snail1 KO1 celler. Fordi vi ikke kunne få en transfektant som viste stabil uttrykk for Snail1, brukte vi forbigående transfektanter av Snail1 (Sanil1 KO1 + Snail1) som kilde av reddet Snail KO1 celler. Snail1 KO 1 + Snail1 celler viste redusert uttrykk for
E-cadherin og claudin-en product: (Fig 2B) Western blotting eksperimenter også støttet disse funnene. Den ekspresjon av E-cadherin, claudin-1 og occludin ble forbedret i fravær av Snail1 uttrykk. Transient transfektert Snail1 i Snail1 KO1 celler støttet redusert uttrykk for E-cadherin og claudin-en og occludin (Fig 2C). Omvendt, ble ekspresjonen av integrin alfa-5 redusert i Snail1 KO-celler (Fig 2B og 2C). Det er bemerkelsesverdig at ekspresjon av beta-aktin ble påvirket av nærvær eller fravær av Snail1 protein (Fig 2B og 2C).
ablasjon av sneglen genet fører til endringer i celle-substrat adhesjon, cellespredning, celle dissosiasjon, og cellemigrasjon
på grunn redusert uttrykk av integrin alpha 5 ble observert i Snail1 KO1 celler, antok vi at celle-substrat heft kan bli svekket i disse cellene. Faktisk Snail1 KO1 celler viste signifikant redusert celle-substrat adhesjon sammenlignet med WT-celler (figur 3A og 3B svart kolonne). Således sletting av Snail1 i RMG1 cellene redusert celle-substrat adhesjon. Det er en annen mulighet; at reduksjonen av celle-substratadhesjon i snail1 KO1 celler kan resultere fra reduksjonen av ECM avsetning. Derfor forinkubert vi brønnene med serumholdig medium for å tillate vitonectin /fibronektin å adsorbere til brønnene, og reexamined celle-substrat adhesjon. Denne behandlingen reddet nesten reduksjon av celle-adhesjon grunnen sett med Snail1 KO1 celler. Omtrent 30,6% av WT-celler og 28,9% av Snail1 KO1 celler ble knyttet til brønner preinkubert med serumholdig medium (figur 3B grå søyle). Derfor, undersøkte vi uttrykket av vitronektin og fibronektin. I motsetning til forventning, gjorde Snail1 KO1 celler ikke utvise redusert ekspresjon av disse proteiner (Fig 2B og 2C).
(A) Representative bilder av substratadhesjon av villtype (WT) RMG1 celler (I), Snail1 KO1 celler (II) og Snail1 KO-celler transient transfektert med en ekspresjonsvektor Snail1 (Snail1 KO1 + Snail1-celler) (III) 4 h etter utsåing i ikke-belagte brønner. (B) Bestemmelse av forholdene mellom festede celler representert ved antall feste celler til ikke-belagte brønner (sort kolonne) eller på brønner på forhånd er dekket med DMEM inneholdende FCS (grå søyle) dividert med antall feste til brønner forbelagt med poly-lysin . Verdier er uttrykt som gjennomsnittet verdier ± S.E.M. av triplikate prøver. Forsøkene ble gjentatt tre ganger. (C) Representative bilder av sprednings celler fra WT (I), Snail1 KO1 (II) og Snail1 KO1 + Snail1 (III)-celler 72 timer etter såing. (D) Bestemmelse av den relative antall sprednings celler representert ved antall isolerte celler fra kolonier av hver type celler dividert med antall isolerte celler fra kolonier av WT celler. Verdier er uttrykt som gjennomsnittet verdier ± S.E.M. fem bilder per prøve. Eksperimentene ble gjentatt fire ganger. (E) Representative bilder av celledissosiasjon blant WT-celler (I), Snail1 KO1 celler (II) og Snail1 KO1 + Snail1 (III) celler. (F) Bestemmelse av det relative antall fragmenterte partikler, presentert som antall fragmenterte partikler av hver type celler dividert med antall fragmenterte partikler av WT celler. Verdier er uttrykt som gjennomsnittet verdier ± S.E.M. på 5-10 bilder pr prøve. Forsøkene ble gjentatt to ganger. (G) Representative bilder av WT-celler (I), Snail1 KO1 celler (II) og Snail1 KO + Snail1 (III) celler som har migrert til de nedre overflater av Transwell membraner. (H) Bestemmelse av den relative antall migrerte celler, presentert som antallet migrerte celler av hver type celler dividert med antall migrerte WT celler. Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.M. fem bilder per prøve. Forsøkene ble gjentatt tre ganger. Statistisk signifikans er merket med en stjerne (*
P
0,05 og **
P
0,01 hjelp Students «
t
-test).
Snail1 er blitt rapportert å spille en rolle i celle-spredning [20], så vi undersøkte spredning aktiviteten av Snail1 KO1 celler. Faktisk, 72 timer etter såing, WT celler vises mange spredning kolonier (figur 3C-I og 3D). I motsetning til dette, Snail1 KO1 celler viste en signifikant lavere antall sprednings kolonier (figur 3C-II og 3D). Snail1 KO1 celler transfektert med Snail1 gjenvunnet spredning aktivitet (figur 3C-III og 3D). Dermed sletting av Snail1 i RMG1 cellene redusert celle spredning aktivitet.
Snail1 regulerer celle adhesjon [5], så vi antok at celle-celle adhesjon kan bli styrket i Snail1 KO1 celler. For å teste denne muligheten, utførte vi en dissosiasjon analyse for å undersøke epithelial arket integritet Snail1 KO1 celler. Behandling med trypsin-EDTA tillot WT celler til å løsne fra retter som små partikler av celler. Disse partiklene dissosiert helt etter pipettering (Fig 3E-I og 3F). I motsetning til dette ble Snail1 KO1 cellene løsnet i store ark som var resistente mot pipettering basert mekanisk dissosiasjon (figur 3E-II og 3F) Transfeksjon av Snail1 KO1 celler med Snail1 førte til delvis utvinning av dissosiasjon aktivitet (figur 3E-III og 3F ). Dermed sletting av Snail1 i RMG1 celler økt celle-celle adhesjon.
Snail1 forbedrer celle migrasjon [6], så vi brukte en transwell analyse for å vurdere flytting av Snail1 KO1 celler. Sammenlignet med WT-celler, ble migrering av Snail1 KO1 celler mot FCS undertrykte betydelig. Transfeksjon av Snail1 KO1 celler med Snail1 førte til delvis gjenoppretting av migrasjon aktivitet (Fig 3G og 3H). Dermed sletting av Snail1 i RMG1 cellene redusert celle migrasjon aktivitet.
Tap av Snail1 ikke hindre TGF-beta-indusert endring av morfologi og genuttrykk
TGF-beta induserer uttrykk for Snail1 [3] og snegle styrer TGF-beta respons [21]. Derfor, antok vi at TGF-beta-indusert EMT kan bli hindret i fravær av Snail1 uttrykk. Faktisk, slik det ble vist i TGF-beta behandlede WT-celler (figur 4A-I, II), behandling av Snail1 KO1 celler med TGF-beta-indusert morfologiske endringer (fig 4A-III, IV). TGF-beta behandling også resulterte i redusert ekspresjon av E-cadherin i Snail1 KO1 celler (figur 4B og 4C). Ekspresjon av andre EMT-relaterte transkripsjonsfaktorer, for eksempel
ZEB1 og VRI
, økte i Snail1 KO1 celler, sammenlignet med WT-celler, og ble ytterligere forsterket av TGF-beta-behandlingen (figur 4B). Disse faktorene kan bidra til de observerte morfologiske endringer og endringer i genuttrykk.
Scale bar indikerer 100 mikrometer. Bilder ble tatt av 5-10 bilder per prøve. Forsøkene ble gjentatt tre ganger. (B) Kvantitativ RT-PCR vurdering av cellene er vist i (A) for de angitte gener. Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.M. av triplikate prøver. Forsøkene ble gjentatt to ganger. Statistisk signifikans er merket med en stjerne (*
P
0,05 og **
P
0,01 hjelp Studentenes
t
-test). (C) Western blot-analyse av cellene som er vist i (A) for de angitte proteiner. Vinculin ble anvendt som en kontroll lasting.
