Abstract
Formål
abnormt aktivert Wnt /β-catenin signalering er viktig i leverkreft (HCC) utvikling. Nedstrøms genekspresjon involverer Wnt /β-catenin kaskade skje gjennom T-celle faktor (TCF) proteiner. Her viser vi onkogene potensial av menneskelige TCF-4 isoformer basert på uttrykk for en enkelt konservert SxxSS motiv.
Metoder
Vi undersøkte TCF-4J og K isoform par preget av nærvær (K) eller fravær (J) av SxxSS motiv. De mRNA-ekspresjon profiler ble undersøkt i 47 par av human HCCs og tilstøtende ikke-kreft levervev ved RT-PCR. Spredning, sfære analyser og immunoblot analyse ble utført under normoxia og hypoksi forhold. Evnen til HCC celler overekspresjon TCF-4J (J celler) og K (K celler) til å vokse som solide svulster i nakne mus ble utforsket.
Resultater
TCF-4J uttrykk var signifikant oppregulert i HCC svulster sammenlignet med tilsvarende peritumor og normal leveren og ble fortrinnsvis uttrykt i dårlig differensiert HCCs. I motsetning til dette ble TCF-4K nedregulert i de samme HCC tumorer. TCF-4J-overekspresjon HCC celler (J celler) avslørte en overlevelsesfordel i henhold hypoksiske forhold, høy spredning hastighet og dannelsen av aggregater /kuler i forhold til overekspresjon av TCF-4K (K-celler). De hypoksiske J cellene hadde høye uttrykk nivåer av HIF-2α og EGFR som mulige mekanismer for å fremme tumorigenesis. Økt stabilitet av HIF-2α under hypoxi i J-celler var assosiert med et redusert nivå av von Hippel-Lindau (VHL) protein, en kjent E3 ligase for HIF-aS. I en xenograft modell, J cellene raskt utviklet svulster i forhold til K-celler. Tumorvev avledet fra J celler utstilt høye uttrykk nivåer av HIF-2α og EGFR forhold til treg utvikling og små K celle avledet svulster.
Konklusjoner
Våre resultater tyder på at den spesifikke TCF-4J isoform, som mangler en regulerende SxxSS motiv, har robust tumor initiere potensialet i henhold hypoksiske forhold
Citation. Koga H, Tsedensodnom O, Tomimaru Y, Walker EJ, Lee HC, Kim KM, et al. (2012) Tap av SxxSS Motif i en human T-celle Factor-4 isoform overfører Hypoksi Motstand mot leverkreft: en onkogen Bryter i Wnt signalnettverk. PLoS ONE 7 (6): e39981. doi: 10,1371 /journal.pone.0039981
Redaktør: Vincenzo Coppola, Ohio State University Comprehensive Cancer Cente, USA
mottatt: 30 januar 2012; Godkjent: 30 mai 2012; Publisert: 29 juni 2012
Copyright: © 2012 Koga et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (CA-123 544 til jrw). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Wnt /β-catenin signalveien spiller en avgjørende rolle i celle skjebne besluttsomhet og stamcelle fornyelse i voksen vev [1], [2]. Genetisk og /eller epigenetisk deregulering av denne vei fører til avvikende kjernefysiske akkumulering av β-catenin, hvor det binder til T-cellefaktor-4 (TCF-4) for å danne en transkripsjonskompleks [3]; denne hendelsen driver genuttrykk som c
-Myc
,
cyclin D1
, og
EpCAM product: [4], [5], [6] som bidrar til en ondartet fenotype.
leverkreft (HCC) er den tredje vanligste årsaken til kreftdødelighet i verden [7]. Abnormt aktiverte Wnt /β-catenin signalisering grunnet overekspresjon av oppstrøms komponenter av denne reaksjonsvei som frizzled (FZD) reseptorer og wnt ligander er en vanlig tidlig begivenhet i molekyl patogenese av denne sykdom [8], [9], [10] . Men involvering av de kanoniske Wnt TCF-4 effektor proteiner i denne prosessen har ennå å bli undersøkt.
Den menneskelige TCF-4 genet (
TCF7L2
) består av 17 eksoner og har flere alternativ spleising steder i eksoner 13-17 og exon 4 [11]. De alternative spleise områder i det sentrale domenet av TCF-4, kan også generere isoformer med eller uten den konserverte LVPQ og SxxSS motivene plassert ved enden av exon 7 og begynnelsen av exon 9, henholdsvis [11], [12]. Nylig har vi identifisert og karakterisert 14 (12 som er unikt) TCF-4-isoformer avledet fra humane cellelinjer HCC [13]. Blant slike isoformer, tre strukturelt identiske par (TCF-4J og K, TCF-4A og B, TCF-4G og H) ble observert som avvek bare ved tilstedeværelse (K, A og H) eller fravær (J, B, og G) av en SxxSS motiv. I denne sammenheng, to par isoformer (TCF-4A og B, og TCF-4H og G) er kortformer, mens TCF-4K og J er lange former på grunn av inkluderingen av en C-terminal hale (ekson 13-17 ) [1. 3]. Tidligere studier antyder at SxxSS motivet kan modulere transkripsjonen aktivitet av TCF-4 [12]; Men både cellebasert og
in vivo
funksjonelle konsekvenser av SxxSS motiv uttrykk samt påfølgende gen regulatoriske aktiviteten er ikke bestemt.
Emerging bevis indikerer at både embryonale (ES) , voksen og induserbare pluripotent stilk (iPS-celler) [14] foretrekker hypoksiske betingelser for vekst og overlevelse [15]. Hypoksi genererer ulike cellulære signaler gjennom stabilisering av hypoksi-induserbar faktorer (HIF-aS) som HIF-1α og HIF-2α. Nyere studier viser at HIF-aS samvirke med β-catenin, og derfor kan regulere TCF-4-drevet genekspresjon ikke bare på stammen /stamceller, men også tumorceller som opplever hypoksiske betingelser under rask vekst [16], [17]. Disse funnene antyder at Wnt /β-catenin /TCF-4 signale kan være direkte regulert av profesjonell oksygen-sensing system i kjernen. For eksempel, stabiliserte HIF-2α, en partner av β-catenin og ofte funnet i hypoksisk kjerne av tumoren, oppregulerer ekspresjonen av epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR), og kan bidra til tumorvekst [18]. I human HCC, blir HIF-aS involvert i flertrinnsprosessen av tumor dedifferentiation via fremming av angiogenese [19]. Følgelig bestemmes vi om ulike funksjonelle egenskaper av TCF-4 isoformer assosiert med HCC ondartede fenotype ble regulert i forbindelse med en SxxSS motivavhengig mekanismer under forhold med oksygenmangel.
Materialer og Metoder
Etikk erklæringen
Full etisk godkjenning ble innhentet for alle menneskelige prøvekolleksjoner fra enten Asan Medical Center etikkutvalg eller Kurume Universitetet Ethics Committee. Alle prøver ble innhentet skriftlig samtykke. Alle dyreforsøk ble utført i henhold til NIH Retningslinjer for omsorg og bruk av forsøksdyr, og ble godkjent av Livsløp Animal Welfare Committee of Rhode Island Hospital, Providence, RI (tillatelse nummer A3922-01).
påvisning av TCF-4-isoformer i HCC tumorer ved RT-PCR
preparater av human TCF-4A, B, J og K-myc plasmider er tidligere blitt beskrevet [13]. To uavhengige RT-PCR-analyser ble utført ved anvendelse av 47 parene av humane HCCs (tabell 1 og 2) som tidligere beskrevet [13].
Cellelinjer og kulturer
humane cellelinjer Hep3B, Huh7, HepG2, og HEK293 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). FOKUS cellelinjen ble hentet fra Dr. tryllestaver (Liver Research Center, Rhode Island Hospital, RI). HAK-1A og HAK-1B celler ble gitt av Dr. Yano (Kurume University School of Medicine, Japan). Den udødelig hepatocytter avledet cellelinje OUMS-29 var en slags gave fra legene. Namba og Kobayashi (Okayama University, Japan). Hep3B, Huh7, HepG2, og fokus cellelinjer er hepatitt B-virus (HBV) -relaterte HCC celler. HAK-1A og HAK-1B cellene er hepatitt C virus (HCV) -relaterte HCC cellelinjer. Alle celler er blitt beskrevet og anvendt i tidligere studier (Hep3B [20], Huh7 [21], HepG2 [20], HEK293 [22], FOCUS [23], og HAK-1A og HAK-1B [24]). For å generere stabile transfektanter ble HAK-1A celler transfektert med TCF-4 eller tom vektor plasmid ved hjelp av transitt-LT1 Reagens (Mirus Bio Co, Madison, WI) og valgt av G418.
Hypoksi Induksjon
hypoksiske betingelser (1% oksygen) ble fremstilt ved en inkubator utstyrt med en oksygenkonsentrasjon regulator system (ASTEC, Fukuoka, Japan). Alternativt cellene ble utsatt for hypoksi-ligne kjemisk kobolt klorid (CoCl
2, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri) [25].
Confocal Laser Scanning Mikros
Celler , dyrket på 35 mm diameter Glass Bottom Retter (Mattek, Ashland, MA), ble fiksert med kald aceton /metanol (01:01) i 10 minutter, og deretter vasket i PBS inneholdende 0,05% Tween 20 (PBS-T). Uspesifikke reaksjoner ble blokkert med Protein Block Serum-Free (DAKO Nord-Amerika, Carpinteria, CA) og deretter inkubert med en mus anti-myc-tag antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California) eller en kanin anti-HIF-2α antistoff (Abcam, Cambridge, UK) ved 4 ° C over natten. Etter vasking i PBS-T, ble prøvene behandlet med Alexa Fluor geite-anti-mus eller geit-anti-kanin IgG (H + L) antistoff (Molecular Probes, Eugene, OR) i 40 minutter ved RT, og deretter motfarget med Vectashield Monterings medium med 4 «, 6-diamino-2-fenylindol (DAPI) (Burlingame, CA). Den Zeiss LSM510 Confocal Laser Scanning Microscope (Carl Zeiss MicroImaging, Inc., Thornwood, New York) er utstyrt med brukergrensesnittet programvare Zen 2008 ble brukt til å visualisere immunfluorescens farging for Myc-tag eller HIF-2α og kjernefysiske lokalisering ble levert av DAPI. De negative kontroller ble oppnådd ved å inkubere celler med uspesifikk mus-IgG eller kanin-IgG som beskrevet ovenfor.
immunoblotanalyse og Immunoutfelling
primære antistoffer ble brukt var mot for Myc-tag, β- catenin, aktin, γ-tubulin, Lamin A /C, HIF-1α, c-myc, og ubiquitin (Santa Cruz Bio, Santa Cruz, CA), TCF-4, EpCAM, og von Hipple-Lindau (VHL) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), HIF-2α (Abcam, Cambridge, UK), og keratin-19 (K-19) (DAKO, Carpinteria, CA). En TCF-4 kanin avledet mAb (Cell Signaling Technology, Cat # 2569) anerkjenner rundt Leu330 av menneskelig TCF-4 og oppdager endogene TCF-4 proteiner inkludert både på kort og lang isoformer. For immunoutfelling, celleekstrakter ble fremstilt som tidligere beskrevet [26]. Totale cellelysat eller kjerneekstrakt ble inkubert med antistoffer mot HIF-1α, HIF-2α, og VHL fulgt av rekombinant protein G-agarose (Invitrogen, Carlsbad, CA). Immunoblot ble probet med antistoffer overfor ubiquitin, HIF-1α, HIF-2α, og VHL og påvist med HRP-merket anti-mus eller anti-kanin-IgG (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK) ved anvendelse av ECL Advanced kit (Amersham). Positive signaler ble tatt til fange av bildeanalyse LAS-1000plus (Fujifilm, Tokyo, Japan), og bandet intensiteten av protein ble bestemt ved hjelp av Image Gauge versjon 3.45 (Fujifilm).
Cell Proliferation Assay
Celler ble sådd ut i 24-brønners plater i en tetthet på 2,5 x 10
3 /brønn. En kolorimetrisk analyse (CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay; Promega, Madison, WI) ble utført på dagene 0, 1, 3, 5 og 7, og de signaler som ble målt ved bruk av Spectra Max M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
Anchorage uavhengig vekst (Sphere analyse)
encellede suspensjoner ble satt i Ultra Low Vedlegg 6-brønners plater (Corning, Lowell, MA). Etter 27 dager, antall celleaggregater /sfærer per brønn ble kvantifisert og fotografert under Zeiss Axiovert 200 M fluorescens mikroskop (Carl Zeiss MicroImaging). Arealet av celleaggregater ble målt ved bruk av MetaMorph 6,0 software (Molecular Devices)
Evaluering av proteinstabilitet
Cellene ble eksponert til 5 pg /ml cykloheksimid (CHX, Sigma-Aldrich). for 0 eller 60 minutter ved den siste fase av 48 timer CoCl
2 behandling. Totalt celle lystes ble brukt for immunoblot analyse for å vurdere HIF-1a og HIF-2α uttrykk nivåer etter proteinsyntesen ble hemmet av CHX.
Xenotransplantat Tumor Model i hårløse mus
HAK-1A-avledet stabile kloner ble brukt; foreldre HAK-1A celler ikke danne tumorer i nakne mus, og er derfor egnet for vurdering av malign transformasjon etter stabil transfeksjon med TCF-4-isoformer [24]. -Celler (1 x 10
6) ble subkutant injisert inn på baksiden av 5 uker gamle BALB /c nakne mus (n = 12) (Taconic Farms, Cranbury, New Jersey). Svulsten størrelse ble målt to ganger per uke, og svulsten volum (mm
3) ble beregnet ved hjelp av formelen lengde × (bredde)
2 × 0,5. Når den lengre diameter nådde 10 mm, ble musene avlivet og tumorene ble fremstilt for etterfølgende analyse.
immunohistokjemi av xenografttumorer
Parafin-vevssnitt ble deparaffinized og oppvarmet i 10 mM citrat buffer ved 120 ° C i 5 minutter for antigen gjenfinning. Seksjonene ble forhånds blokkert av Protein Block Serum-Free (DAKO) og inkubert med primære antistoffer for HIF-2α (Abcam) og EGFR (D38B1 XP ™) (Cell Signaling Technology). Etter vasking, ble seksjonene inkubert med seg sekundære antistoffer merket med HRP-polymerkomplekser (DAKO) og synliggjort med 0,1% 3-3 » – diamino-benzidin-tetrahydroklorid. Cellekjerner ble kontra med hematoksylin. Prøve inkubert med mus eller kanin IgG ble satt som de negative kontrollene.
Statistical Analysis
Statistisk signifikans ble utført av Mann-Whitney U test ved hjelp GraphPad Prism 4.0-programvaren (San Diego, CA) .
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Pearsons korrelasjonskoeffisient ble brukt til å beregne korrelasjon mellom uttrykk for TCF-4J og K.
Resultater
Differensial Expression Profilen til TCF-4J og TCF-4K i Human HCC Vev
Ekspresjon av TCF-4-isoformer med eller uten SxxSS motivet kan påvirke deres transkripsjonelle aktivitet [12], [13], [27]. Derfor fant vi ut om tre par isoformer (TCF-4A og B, TCF-4G og H, og TCF-4J og K) utstilt forskjellige uttrykk profiler som kan tyde SxxSS avhengig regulering i menneske HCC svulster. De relative mRNA-nivåer av disse TCF-4-isoformer i 27 par av HCC tumorer og tilsvarende tilstøtende levervev erholdt fra kronisk HBV-relaterte (26/27) sykdom ble målt. Sammenligninger ble utført for å tre normale leverprøver ved semi-kvantitativ RT-PCR (fig. 1A, fig. S1A og C, og tabell 1) som tidligere beskrevet [13]. TCF-4J uttrykk var signifikant oppregulert i HCC svulster i forhold til peritumor vev og normal leveren. Blant de 27-parede prøver, hadde 85% økt TCF-4J uttrykk i HCC sammenlignet med matchet-peritumor vev. I motsetning til dette ble TCF-4K signifikant nedregulert i tumorer sammenliknet med normal lever og peritumor vev (Fig. 1A). Videre ble det observert en lignende uttrykk Profilen til disse TCF-4-isoformer i et andre kohort av HCC-tilstøtende affisert vev fra individer hvor parene 85% (17/20) av tumorene ble relatert til kronisk HCV-infeksjon (fig. 1B, Tabell 2). Men dette differensial uttrykket mønster ble ikke observert i de andre to par av korte isoformer (TCF-4A og B, G og H) (fig. S1). TCF-4A, en kortform av K var signifikant nedregulert i HBV-relatert HCC svulst i forhold til normal leveren samt peritumor vev. I tillegg er ekspresjonsnivået av TCF-4B, en kort form av J, ble funnet å være lik blant normale, tumor, og peritumor vev (Fig. S1A). Videre er det andre paret av TCF-4-isoformene (G og H) viste også ingen forskjeller i deres ekspresjonsnivåer blant normale, HCC svulst, og peri-tumorvev (fig. S1C). I HCV-relaterte HCC vev, men alle fire isoformer (TCF-4A og B, G og H) var signifikant nedregulert i begge peritumor og tumorvev sammenlignet med normalt leveren; i tillegg er ingen forskjell ble funnet mellom tumor og peritumor prøver (fig. S1B og D). Disse resultatene indikerte at påvirkning av SxxSS motiv på genereringen av en HCC ondartet fenotype kan være forbundet med den lange (TCF-4J og K), ikke er kortere isoformer (TCF-4A og B, G og H).
(A) Sammenlignende analyse av TCF-4J og K mRNA-ekspresjonsnivåene i 27 HBV-relaterte tumorer HCC (T) tilstøtende peritumor vev (pT) og histologisk normale lever (N) ved RT-PCR. Verdiene er normalisert til GAPDH. Røde rektangler betegne dårlig differensiert (PD) HCC. WD, godt differensiert; MD, moderat differensiert. Statistiske resultater fra alle vev eller PD HCC uttrykkes som gjennomsnitt + SD (høyre panel). (B) En annen 20 HCC tumorer inkludert fem WD HCCs fra et annet klinisk område. Sytten individer hadde HCV-relaterte kronisk leversykdom, og de resterende hadde kronisk HBV-infeksjon. Se også tabell 1 og 2. (C) Expression nivåer av TCF-4J og K mRNA i humane cellelinjer HepG2 (G2), Hep3B (3B), Huh-7 (H7), FOCUS (FO), HAK-1A (1A ), HAK-1B (1B), OUMS-29 (OU), og HEK293 (293). (D) omvendt korrelasjon mellom TCF-4J og K uttrykk i alt HCC (venstre panel) og PD HCC (høyre panel). Legg merke til den svake omvendt korrelasjon i alle tilfeller (
r
= 0,297), mens økt invers korrelasjon i PD HCC (
r
= 0,437). *
p
0,01; **
p
. 0,05
Deretter analyserte vi sammenhengen mellom clinicopathological funksjoner og uttrykk av disse TCF-4 isoformer (Tabell 3, tabell S1). Resultatene tyder på at bare den grad (er) av tumor differensiering signifikant korrelert med TCF-4J og K uttrykk nivåer (tabell 3). Faktisk, TCF-4K nivået ble signifikant redusert i dårlig differensiert (PD) HCC tumorer, som var i motsetning til høyt nivå av TCF-4J funnet i de samme HCC tumorer (Fig. 1A og B, tabell 3). Slike studier tyder på at den oppregulert ekspresjon av TCF-4J, kan være et vanlig trekk ved PD HCC. Til støtte for denne hypotesen, ble TCF-4J sterkt uttrykt i både HBV-relatert (HepG2, Hep3B, Huh7, og FOKUS) og HCV-relaterte (HAK-1A og HAK-1B) cellelinjer (Fig. 1C). Dette isoform ble også uttrykt i OUMS-29 og HEK293. I motsetning til dette, var meget lav i PD HCC tumorer og cellelinjer med unntak av HAK-1B og HEK293 TCF-4K ekspresjonsnivået (Fig. 1A, B, og C). I motsetning til dette har de to parene med korte isoformer (TCF-4A og B, eller G og H) ikke viser en slik sammenheng mellom clinicopathological funksjoner og deres ekspresjon av SxxSS motiv (Tabell S1).
Videre analyser viste at TCF-4J uttrykk i HCC var signifikant negativt korrelert med TCF-4K (figur 1D, venstre panel;.
p
= 0,0031, korrelasjonskoeffisient
r
= 0,297). Den inverse sammenhengen mellom TCF-4J og K uttrykk nivåer var mer tydelig i PD HCC (figur 1D, panel høyre;.
p
= 0,0077,
r
= 0,437). Således tap av SxxSS motiv i de lange isoformer av TCF-4 på grunn av en skjøte arrangement var forbundet med en PD HCC fenotype.
subcellulær lokalisering av TCF-4J og K-isoformer i HAK-1A HCC Cell linje
for bedre å forstå hvordan uttrykk for SxxSS motivet kan fremme ondartet fenotype av HCC
in vitro
, vi først undersøkt lokalisering av TCF-4J og K i HAK-1A HCC cellelinjer etter transient transfeksjon. Som vist på fig. 2, cellulær ekspresjon ble hovedsakelig observert i kjernen som bedømt ved konfokal mikroskopi og kjernefysiske /cytoplasmiske fraksjoneringsstudier tyder på at eksogen ekspresjon av TCF-4J og K proteiner vil lokaliseres til kjernen rommet.
(A) Organization av «korte» (A, B) og de «lange» (J, K) isoformer; TCF-4B og J mangler SxxSS motiv. (B) Confocal laser-scanning mikros demonstrerer kjernefysiske lokalisering av TCF-4J og TCF-4K (grønn). Atomkjerner er kontra av DAPI. (C) Nuclear (Nuc) /cytoplasma (Cyto) fraksjonering etterfulgt av immunoblot analyse bekrefter kjernefysiske lokalisering av TCF-4J og K isoformer. Lamin (Lamin A /C) og γ-tubulin ble brukt som kjernefysiske og cytoplasmatiske markører, henholdsvis.
TCF-4J-overekspresjon HCC Cells ha en proliferativ Advantage henhold hypoksiske betingelser
under flertrinnsprosess hepatocarcinogenesis oppstår mindre differensierte HCC celler fra sentrum av HCC tumornoduler avsløre en «knute-in-knute» histologisk utseende på patologisk undersøkelse av vevssnitt [28]. Det sentrale tumorområdet frembringer hypoksisk stress til tumorceller og fremmer apoptose [18], [29]. Imidlertid kan det være en hypoksi-resistent populasjon av HCC celler som overlever under disse strenge betingelser for å fremme tumorvekst gjennom akselerert angiogenese og vaskulær invasjon. Disse to fenomenene er regulert av HIF-1α og HIF-2α [30], [31]. Derfor har vi antatt at den høye ekspresjon av TCF-4J i PD HCC var en mulig refleksjon av en indusert hypoksi-resistent fenotype HCC. For å teste denne ideen, var stabile cellekloner overekspresjon TCF-4J (J celler) og TCF-4K (K-celler) etablert, og sammenligninger ble gjort til tomme vektor transfekterte cellekloner (EV celler), samt foreldre HAK -1A celler. Under fasekontrastmikroskopi, er morfologisk utseende av disse klonene var lik og sammenlignes med de parentale celler (fig. 3A), som var i kontrast til den HAK-1A-avledede dedifferensieres celleklon HAK-1B [24].
(A) fase-kontrastmikroskopi av foreldre HAK-1A (1A) og 1A-avledet stabile kloner, inkludert den tomme vektoren transfekteres klon (EV2), den TCF-4J-transfekterte kloner (J1 og J15), og de TCF-4K-transfekterte kloner (K2 og K5). Den morfologisk utseende av den svært maligne HAK-1B (1B) cellelinje, en klonalt dedifferensieres celletype fra 1A, er også presentert for sammenligning. Bar = 50 mikrometer. (B) Immunoblot-analyse av stabile cellekloner. Positive signaler for Myc-tag er vist i J1, J15, K2 og K5. HepG2-celler (G2) som er kjent for å uttrykke både i full lengde (92 kDa) og avkortet β-catenin (75 kDa), oppviste et nedre bånd for β-catenin (β-Cat) HepG2 ble også anvendt som en positiv kontroll for EpCAM og K-19 uttrykk. HEK293 ble anvendt som en negativ kontroll for K-19. (C) Cell vekstrater på stabile kloner under hypoksiske forhold generert av CoCl
2 (150 mm) i 7 dager. Veksthastigheten er representert som fold-økning sammenlignet med dag 0. (D) Cellevekst av stabile kloner i normoxia (20% O
2) eller hypoksiske betingelser (1% O
2) Cellene ble eksponert for enten 20% eller 1% oksygen i 5 dager. Legg merke til at reduksjonen av cellevekst i hypoksiske Contidions var mindre i J celler (13%) i forhold til EV (22%) og K (27%) celler. (E) krings-uavhengig vekst assay (sfære analyse). Fase-kontrast mikroskopiske visninger av representative celleaggregater er vist på 0, 75 og 150 uM av CoCl
2. Bar = 300 mikrometer. Legg merke til den slående forskjell i koloni vekst og utseende på 150 mikrometer av CoCl
2. *
p
0,05; **
p
. 0,01
Wnt /β-catenin signal korrelerer ofte med stamcelleliknende molekylære endringer [32], [33]. I denne forbindelse, ekspresjon av EpCAM, en antatt stamcelleleverkreft (CSC) markør og en β-catenin /TCF-4 nedstrøms target-genproduktet [6], ble ikke oppregulert i disse cellene. Imidlertid ble ekspresjonen av K-19, et galle avstamning markør for en aggressiv fenotype HCC [34], økes i J-celler, men ikke i K, EV, eller paren HAK-1A-celler (fig. 3B).
i tråd med vår forrige rapport i Huh7 celler [13], J cellene hadde en økt basal vekstrate i forhold til K og EV kontrollceller. J celler var resistente etter kjemisk indusert, alvorlige hypoksiske forhold (150 mikrometer CoCl
2), proliferated betydelig raskere enn K eller EV celler (fig. 3C). Denne iakttakelse ble ytterligere understøttet når cellene ble utsatt for 1% oksygen i 5 dager (Fig. 3D). Cellevekst i hypoksi (1% oksygen) ble redusert i EV og K-celler sammenlignet med celleformering i normoxia (20% oksygen) ved 22 og 27%, henholdsvis, mens J-celler demostrated bare en 13% reduksjon av cellevekst. Videre robust motstand til alvorlig hypoksi i J-celler, ble også utstilt i en sfære assay. I denne sammenheng er J-celler som dannes de største celleaggregater ved alle former for COCl
2 konsentrasjonene som blir anvendt. J cellenes potensial for forankringsuavhengig vekst var mest tydelig med alvorlig hypoksi indusert av 150 mikrometer CoCl
2 (Fig. 3E).
Tap av SxxSS Motif Bidrar til uttrykket nivåer av HIF- aS
Basert på hypoksi-resistente egenskaper utstilt ved J celler, bestemt vi hvis disse cellene uttrykte HIF-aS etter hypoksi. Både HIF-1α og HIF-2α ekspresjon i J og K-celler ble undersøkt siden HIF-2α er nylig blitt vist å være et viktig molekyl som fremmer overlevelsen av cscs henhold hypoksiske betingelser [35], [36], [37]. Som forventet, ble HIF-1α og HIF-2α ekspresjon indusert med moderat hypoksi (75 mM CoCl
2) i EV, J og K-celler; imidlertid, under krevende hypoksiske betingelser (150 mM CoCl
2), bare J cellene holdt disse høye proteinnivåer (Fig. 4A). Stabilisert HIF-2α, ofte funnet i hypoksisk kjerne av tumoren, oppregulert ekspresjon av EGFR som kan bidra til reduksjon av tumorvekst [18], og aktivering av EGFR-signalreaksjonsveien var assosiert med utvikling av K-19-positive HCC [ ,,,0],38]. I J-celler, ble ekspresjon av EGFR og K-19 forbundet med økt nivå av HIF-2α (Fig. 4A). Den konsekvente HIF respons ble også observert i 1% oksygen-eksponerte J-celler (Fig. 4B). Videre er 150 uM CoCl
2-indusert HIF-2α ekspresjon ble lokalisert i kjernen av J-celler som vurdert ved immunofluorescens-farging (fig. 4C).
(A og B) Immunoblot-analyse av tom vektor-transfekterte (EV), TCF-4J-overekspresjon (J), og TCF-4K-overekspresjon celler (K). Cellene ble behandlet med 0 og 150 mM CoCl
2 (A) eller dyrket med 1% oksygen spenning i 48 timer (B). Cellelysater ble utsatt for å oppdage HIF-aS og Myc-tag TCF-4 isoform protein uttrykk. Ekspresjonsnivåer ble plottet som et forhold til aktin (høyre panel). (C) Konfokalmikroskopi for kjernefysiske lokalisering av HIF-2α protein. Celler ble behandlet med 0 um (Normoxia) eller 150 pM (hypoksi) CoCl
2 og farget med et anti-HIF-2α antistoff (grønn). DAPI ble ansatt for nukleær farging. (D) Immunoblot-analyse av totale cellelysater fra celler behandlet med 0 eller 150 mM CoCl
2 i 48 timer. A og B representerer HAK-1A celler som overuttrykker TCF-4A ( «kortform» av TCF-4K) og TCF-4B ( «kortform» av TCF-4J), henholdsvis (se figur 2A). Legg merke til robust vekst i uttrykk av HIF-1α og HIF-2α i B-celler.
Vi har også bestemt om HIF-aS oppregulering under alvorlig hypoksi i J-celler ble knyttet til tap av SxxSS motiv. Hvis dette var tilfelle, vil et lignende resultat bli funnet i TCF-4B-overuttrykkende celler (B-celler), den såkalte «short isoform» av TCF-4J (fig. 2A). I denne forbindelse ble det totale cellelysater kastet immunoblotanalyse å sammenligne B med A-celler hvor TCF-4A er overuttrykt som «kort form» motstykke av TCF-4K (fig. 2A). Det er viktig å merke seg at en økning i den totale cellelysat HIF-α ekspresjon var tydelig i B-celler (fig. 4D), og antyder at SxxSS motivet kan ha en regulatorisk rolle ved modulering av HIF-aS ekspresjon under strenge hypoksiske betingelser som genereres av 150 iM CoCl
2 i to par av TCF-4 isoformer.
Akselerert ubiquitin avhengig Nedbrytning av HIF-aS i K Cells
Fordi HIF-aS proteiner er sterkt forringet av ubiquitin -avhengig proteasomal vei, ble det antatt at en differensial HIF-aS degradering mekanisme kan eksistere under alvorlig hypoksi i J og K celler. Nivåene av HIF-1α og HIF-2α ble betydelig økt i K celler behandlet med en proteasomal inhibitor (MG-132) sammenlignet med ikke-behandlede K celler; I motsetning observerte vi mindre av en økning i disse proteiner i EV og J-celler (Fig. 5A). Opphopning av HIF-aS i MG-132-behandlede K celler sterkt antyder at SxxSS motiv-husing K celler kan degradere HIF-aS etter hypoksiske forhold i en proteasomal avhengig måte. Faktisk ble proteinstabilitet av HIF-aS funnet å være redusert i K-celler (Fig. 5B). Vi har funnet at nivået av VHL protein, et kjent E3 ligase for HIF-aS, i K-celler ble høyere sammenlignet med J cellene i kjernen, men ikke cytoplasma, som falt sammen med intens atom akkumulering av HIF-1α og HIF-2α i J celler under hypoksiske betingelser (fig. 5C). Vi videre undersøkt samspillet mellom HIF-2α og VHL om atom ekstrakter og funnet ut at atom VHL i K celler sterkt samhandlet med HIF-2α forhold til J celler for å fremme HIF-2α ubiquitinering i kjernen (Fig. 5D). Videre K-celler viste poly-ubiquitinering av HIF-2α i forhold til J-celler som støtter konseptet med akselerert degradering av HIF-α i K-celler (fig. 5E). Dette funnet innebærer en mulig rolle for kjernekraft VHL i å regulere stabiliteten i HIF-aS i TCF-4 isoform-overekspresjon celler.
(A) Cellene ble behandlet med 150 mikrometer CoCl
2 for 36 timer, etterfulgt ved inkubasjon med eller uten MG-132 (10 uM) i 2 timer. Totalt cellelysater ble ansatt for immunoblot analyse. Relativ ekspresjon av HIF-aS ble normalisert til aktin. (B) Protein stabilitet av HIF-aS ble evaluert ved immunoblotanalyse, hvor cellene ble utsatt for 5 pg /ml cykloheksimid (CHX) til å hemme proteinsyntese for 0 eller 60 minutter ved den siste fase av 48 hr CoCl
2 behandlingsperiode. (C) Uttrykk av VHL i TCF-4J og K celler. Cellene ble behandlet 0 eller 150 mikrometer CoCl
2 og kjernefysiske og cytoplamic fraksjoner var forberedt på immunoblot analyse. Expression nivået av HIF-2α og VHL ble normalisert ved Lamin (nedre panel); VHL-C, cytoplasma VHL. (D) Samspill mellom VHL og HIF-2α i kjernen av TCF-4J og K celler. (E) Polyubiquitination av HIF-2α i cytoplasmiske og kjernefraksjoner av TCF-4J og K-celler. Immunoutfelling (IP) /immunoblot (IB) analyse ble utført ved anvendelse av antistoffer for HIF-2α og ubiquitin (Ub); *, IgG tung kjede. Legg merke til redusert ubiquitinering av HIF-2α og svak VHL-HIF-2α samhandling i J-celler, som var i motsetning til observasjonene i K-celler.
TCF-4J isoform Expression ensidige Svulst Phenotype til HCC Cells
tumorigent potensialet i EV, J og K-celler ble undersøkt i nakne mus. Som kan forutsies fra
in vitro
funn, J celler var svært tumorigent. Selv om K-celler generert små svulster, de dukket opp senere (ca 40 dager) etter tumorcelle injeksjon og vokste veldig sakte (Fig. 6A). Control (EV) celler ikke produsere svulster som rapportert tidligere [24].
(A) Representant eksperiment som viser xenograft tumor utvikling og vekst. EV2, kontroll; J1, J celle; K2 og K5, K celle kloner. (B) Protein ekspresjon av de angitte molekyler i J1 tumorer (1-5) og K2 tumorer (13-17) ved immunblotanalyse. Nuclear (N) og cytoplasmiske (C) proteiner uttrykt i 150 mM CoCl
2-behandlede J-celler (Hypo-J) ble anvendt som positive kontroller. (Nedre panel) TCF-4J og K mRNA uttrykk ble verifisert ved RT-PCR i J1 og K2 svulster; *
p
0,01;
