Abstract
ekstracellulære vesikler (EVS) er viktige bidragsytere til kreft der de spiller en viktig rolle i celle-celle kommunikasjon og overføre pro-onkogene molekyler til mottakercellene dermed overdragelse en kreft fenotype. Her, renset vi elbiler bruker enkle biokjemiske tilnærminger fra flere kreftcellelinjer og deretter preget disse elbiler via flere biokjemiske og biofysiske metoder. I tillegg brukte vi fluorescens mikroskopi for å direkte vise internalisering av elbiler i mottakercellene i løpet av få minutter ved tilsetning av elbiler til mottakercellene. Vi bekreftet at trans protein EMMPRIN, antatt å være en markør for elbiler, ble faktisk utskilt fra alle cellelinjer studert her. Vi evaluerte responsen på EV stimulering på flere ulike typer mottakercellelinjer og målte evnen til disse rensede el-biler for å indusere sekresjon av flere faktorer sterkt oppregulert på humane kreftformer. Våre data tyder på at rensede elbiler fortrinnsvis stimulere sekresjon av flere proteiner involvert i å drive kreft i monocyttiske celler, men bare havn begrenset aktivitet i epitelceller. Nærmere bestemt viser vi at EV er kraftige stimulatorer for MMP-9, IL-6, TGF-β1 og induserer sekresjon av ekstracellulære EMMPRIN, som alle spiller en rolle i å drive immunsvik, invasjon og betennelse i svulsten mikromiljøet. Således, ved hjelp av en helhetlig tilnærming som omfatter biokjemiske, biologiske og spektroskopiske metoder, har vi begynt å belyse stimulerende roller
Citation. Redzic JS, Kendrick AA, Bahmed K, Dahl KD, Pearson CG, Robinson WA, et al. (2013) ekstracellulær Blemmer utskilt fra Kreftcellelinjer Stimulere Utskillelse av MMP-9, IL-6, TGF-β1 og EMMPRIN. PLoS ONE åtte (8): e71225. doi: 10,1371 /journal.pone.0071225
Redaktør: Jialin Charles Zheng, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 10. august 2012; Godkjent: 30 juni 2013; Publisert: 01.08.2013
Copyright: © 2013 Redzic et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert gjennom NIH søknadsnummer 1R01GM096019-01A1 til Eze Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Cellular shedding er en prosess som skjer i alle celler som et middel for å eliminere unødvendige cellulære komponenter, men den viktige rollen av utskilte vesiklene i celle-celle-kommunikasjon begynner å dukke opp [1], [2]. Membranproteiner blir felle via en rekke forskjellige mekanismer som omfatter ectodomain shedding og sekresjon av full lengde membranproteiner via utskilt vesikler [3]. Vesikulært avgivelse skjer ved ytre spirende av plasmamembranen med utgivelsen av en type vesikkel kjent som en mikrovesikkelen eller ved innover spirende av membranen med det endelige frigjøring av vesikler er kjent som exosomes [4]. Her vil vi kollektivt refererer til både mikrovesikler og exosomes som ekstracellulære vesikler (EVS). Dette fenomenet av vesikulært shedding, dvs. EV avgivelse, har også blitt observert i en rekke forskjellige sykdommer, inkludert nevrologiske sykdommer, virusinfeksjoner og kreft [5] – [7]. Faktisk opptrer EV shedding i større grad i kreftceller sammenlignet med friske celler og resulterer i utslipp av pro-onkogene molekyler, inkludert proteiner, RNA og DNA [8], [9]. Nylig har flere roller EVs fremkom som tillater partiklene å drive prosesser som er nødvendige for kreftutvikling og progresjon slik som angiogenese, betennelse og medikamentresistens [10]. Det er flere mekanismer som elbiler kan fungere på mottakercellene. For eksempel, kan disse omfatte enten direkte stimulering av cellulære reseptorer av proteiner på overflaten EV eller internalisering av el-biler av mottakeren i cellen, noe som både fører til etterfølgende stimulering av signalveier [1], [11]. Kreftceller synes å bruke elbil som et middel for celle-celle-kommunikasjon ved å overføre innholdet (DNA, RNA og protein) til en mottagercelle, og dermed føre til en transformasjon fra en ikke-ondartet til en malign fenotype av mottakercellen [12 ] – [14]. Proteininnholdet i elbiler spiller en integrert del i intern og aktivitet av elbiler. For eksempel, EV proteiner i inngrep med mottakercellene som resulterer i opptaket av el-biler [15], og EV ble vist å overføre onco-proteiner resulterer i fenotypisk forandring i mottakercellen [12] – [14]. Imidlertid er en av de gjenværende spørsmål med hensyn til EV aktivitet uansett om det er forskjeller i den observerte EV aktivitet blant de forskjellige mottakercelletyper, så vel som hvilke proteiner kan bli utskilt av el-biler. For å oppnå dette, vurdert vi forskjeller i EV stimulerende aktivitet i flere ulike mottakercelletyper ved sondering EV-stimulert sekresjon av flere ulike faktorer som har vist seg å spille viktige roller i kreft hos mennesker.
Vi har rene elbiler fra friske individer, kreftpasienter og fra flere forskjellige pattedyrkreftcellelinjer. Vår rensemetode ga en heterogen populasjon av elbiler som varierer i størrelse 20-300 nm som indikerer en blanding av exosomes og mikrovesikler [4]. Vi oppdaget den fulle lengde trans protein kalt ekstracellulær matriksmetalloproteinase induser (EMMPRIN), en foreslått markør for elbiler [16], i elbiler renset fra flere forskjellige biologiske væskeprøver og fra alle de forskjellige cellelinjer vi evaluert her. Vi har derfor brukt EMMPRIN som en markør for våre rene elbiler. Fluorescens mikroskopi viste at våre rensede EV ble internalisert av mottakercellen i en forholdsvis kort tid (5-15 minutter), og lokalisere rundt kjernen, for derved å bekrefte at vår rensemetoden medførte aktive EV er i stand til å overføre innholdet i mottakercellene . Vår bred evaluering av flere forskjellige mottakercellelinjer viser at EV renset fra disse forskjellige typer kreftceller utviser foretrukket stimulatorisk aktivitet av utskilte proteiner overfor monocytter, men ikke epitelceller. Faktisk, mens vi oppdaget at elbiler skilles fra alle cellelinjer studert her inneholder full lengde EMMPRIN, elbiler også stimulere utskillelsen av full lengde EMMPRIN seg i menneskelige monocyttiske leukemiceller. Vi har oppdaget at EV er kraftige stimulatorer for transformerende vekstfaktor beta-1 (TGF-β1), Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) og interleukin-6 (IL-6). Denne stimulerende aktivitet av el-biler for å indusere sekresjon av TGF-β1, MMP-9, IL-6 og EMMPRIN, antyder en rolle av el-biler i kjøretumorprogresjon ved stimulerende faktorer som er viktige for immunsvik, invasjon og inflammasjon [17] – [19 ]. Våre data bringer oss nærmere en bedre forståelse av biologi utskilte elbiler, blir den fortrinnsrett celletype stimulert av elbiler, og molekyler som utskilles av mottakercellene ved stimulering med utskilling av elbiler.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen for menneske (pasient /donor) Innsamling av biologiske væsker
Perifere blodprøver ble samlet inn i University of Colorado Hospital Kutan Oncology Clinic. Vacutainers rør (rød topp, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) ble brukt til serum samling. Prøver ble øyeblikkelig transportert til laboratoriet, sentrifugert ved 1200 x g i 10 minutter og deretter frosset ved -80 ° C inntil behov. Litium heparin inneholdende vacutainers (grønn topp, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) ble anvendt for plasmasamling, øyeblikkelig transportert til laboratoriet, ble sentrifugert ved 800 x g i 10 minutter ved 4 ° C. Plasmaprøvene ble frosset ved -80 ° C inntil behov. Ascitesvæske ble samlet inn fra pleuravæske kraner i intervensjonsradiologi ved University of Colorado Hospital ved hjelp av en Vacutainer (rød topp, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Prøver ble øyeblikkelig transportert til laboratoriet på is, sentrifugert ved 800 x g i 5 minutter ved 4 ° C for å fjerne cellerester. Prøvene ble frosset ved -80 ° C inntil behov. Samlingen av biologiske væskeprøver ble godkjent av Colorado Multi-Institutional Review Board (COMIRB # 05-0309), og prøvene ble samlet inn følgende informert skriftlig samtykke.
Påvisning av full lengde EMMPRIN i biologiske væsker
humant serum, plasma og ascites væskeprøver ble filtrert ved anvendelse av et 0,22 um filter for å fjerne celler og cellerester. 10 ug av Menneskelig EMMPRIN biotinylert polyklonalt antistoff (R Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA). L3.6pL celler ble dyrket i DMEM media supplert med L-glutamin, natriumpyruvat, 5 mM ikke-essensielle aminosyrer, 25 ug /ml plasmocin, 1% penicillin /streptomycin /amfotericin-b og 10% FBS. U937, Molm13, THP-1 og HFF-celler ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med L-glutamin, 1% penicillin /streptomycin /amfotericin-b og 10% FBS.
Rensing av el-biler
Adherente cellelinjer (MCF-7, MDA-MB-231, og L3.6pL Hek293Fpl) som benyttes til vesikkel-rensning, ble dyrket i 150 mm plater inntil cellene var 70% sammenflytende. Media ble fjernet, og cellene ble vasket med 1 X PBS to ganger. Passende media supplert med 3% FBS utarmet av elbiler via ultrasentrifugering ble lagt inn i cellene [26].
elbiler fra 5 × 10
5 celler /ml U937 celler ble dyrket i T-75 kolber i RPMI 1640 medium og 3% vesikkel gratis FBS. Ved innsamling ble cellene pelletert ved sentrifugering i 5 minutter ved 1100 rpm og supernatanten ble oppsamlet. Supernatanten fra alle cellene ble oppsamlet hver 48. time og 4 mM Etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA) ble tilsatt til supernatanten umiddelbart etter innsamling. Supernatanten ble sentrifugert ved 8000 rpm i 10 minutter for å fjerne eventuelle cellerester, og deretter filtrert ved anvendelse av et 0,22 um filter. Ved hjelp av et 100 kDa molekylvekt cut off filter-membran (Millipore, Bedford, MA, USA) supernatanten ble konsentrert til et volum på 1-2 ml. EV fra den konsentrerte prøven ble renset ved å bruke en forberedende Superose 6 størrelse-utelukkelses-kromatografi-kolonne (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) ekvilibrert i 1 x PBS, pH 7,5. Totalt proteininnhold av renset elbiler ble målt ved hjelp av Bradford totale proteinanalyse (BioRad, Hercules, CA, USA).
Identifikasjon av full lengde EMMPRIN innen Renset EVS
ugyldig volumfraksjoner fra størrelse-utelukkelses-kromatografi, ble samlet og konsentrert til 500 mL. 10 ug av Menneskelig EMMPRIN biotinylert polyklonalt antistoff (R 0,05 ble betraktet som signifikant
nanopartikler Tracking Analyse Måling
nanopartikkel sporing analyse (NTA) er en av metodene som brukes for å påvise utskilte elbiler innen en gitt prøve.. Superose 6 størrelse utelukkelse kromatografi fraksjoner med høy molekylvekt ble analysert ved hjelp av NTA Versjon 2.2 Build 0375 instrument (NanoSight, Amesbury, Wiltshire, Storbritannia). Prøvene ble analysert ved 1:10,000 fortynning og 1 ml av den fortynnede prøve ble benyttet for analyse.
Fluorescensmikroskopi
1 x 10
6 celler /ml celler ble sentrifugert ved 1100 rpm i 5 minutter for å pelletere cellene. Celler ble fiksert med 200 pl av 1% formalin (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA) i 10 minutter ved romtemperatur. Cellene ble sentrifugert som ovenfor, supernatanten fjernet og cellene ble vasket med 1 X PBS to ganger. Celler ble inkubert i 20 pl EMMPRIN-FITC-konjugert antistoff (Ancell, Bayport, MN, USA) fremstilt ved en 1:50 fortynning og inkubert ved romtemperatur i 15 minutter. Cellene ble vasket med 1 X PBS to ganger etter inkubasjonsperioden. Nukleær farging ble utført ved romtemperatur i 10 minutter under anvendelse av 1 pl /ml av 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) flekk (Invitrogen, Grand Island, NY, USA). Celler ble vasket to ganger med 1 X PBS og montert på objektglass.
For å vurdere interaksjon og lokalisering av el-biler med THP-1-celler, EV ble inkubert med Texas Rødt flekk i 30 minutter ved romtemperatur i mørk. EV ble sentrifugert i 90 minutter ved 100 000 x g i TLA-55 rotor. Supernatanten ble aspirert og pelleten vasket i 1 x PBS og deretter sentrifugert på nytt som ovenfor 2 ganger. Supernatanten ble fjernet og pelleten resuspendert i 20 ul av 1 x PBS. Farget EV ble deretter tilsatt til cellene og inkubert ved forskjellige tider varierende fra 5 minutter opp til 24 timer ved 37 ° C. Cellene ble visualisert ved hjelp av et Nikon Ti Eclipse (Nikon Instruments Inc., Melville, NY, USA) invertert mikroskop med et Nikon 100X PlanApo NA 1.4 objektiv. Bilder ble tatt med en Andor iXon EMCCD 888E kameraet (Andor Technologies, South Windsor, CT, USA). Bildeanalyse og kvantifisering ble utført ved hjelp av NIS Elements bildebehandlingsprogrammer (Nikon Instruments Inc., Melville, NY, USA). Alle bilder tatt ble ervervet ved romtemperatur. Innhentingstider for bildene var 80 msek, 500 msek og 300 msek for de blå, grønne og røde kanaler, henholdsvis. Bilder ble behandlet for tall som bruker ImageJ og deretter produsert ved hjelp av Corel Draw.
Måling av endring i EMMPRIN Expression Ved Vesikkel Stimulering
Flowcytometri analyse av THP-1 celler farget med EMMPRIN-FITC konjugert antistoff ble utført for å bestemme om det er noen endringer i nivået av celleoverflaten EMMPRIN uttrykk ved behandling med elbiler. EMMPRIN bety fluorescensintensitet (MFI) ble målt ved hjelp av Beckman Coulter celle Lab Quanta SC Flowcytometer på ubehandlede celler, celler behandlet med 1 X PBS (buffer behandlede celler) og EV behandlede celler. Alle målinger ble tatt 24 timer etter stimulering og ble utført ved hjelp av hele cellen befolkningen, dvs. 1 × 10
6 celler /ml stimulert i 24 timer.
Måling av endring i EMMPRIN Utskillelse Ved Vesikkel Stimulering
supernatanten fra kontroll, bufferbehandlet og EV behandlede prøvene ble samlet opp for å bestemme om det er noen endringer i mengden av utskilt EMMPRIN ved stimulering. 100 ul av supernatanten ble deglykosylert som beskrevet tidligere, og proteinene separeres ved hjelp av SDS-PAGE elektroforese. EMMPRIN sekresjon ble målt ved anvendelse av Western blot-analyse som beskrevet tidligere.
aktivitetsanalyser
Sekresjon av MMP-9 og IL-6 ble målt i flere cellelinjer ved hjelp av enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) deteksjon kits (ELISA Tech, Aurora, CO, USA). For celler i suspensjon, 5 x 10
5 celler /ml ble brukt per 0,5 ml av media i en 12-brønns plate. For adherente celler, ble stimuleringer utført i 12-brønners plater med celler ved 70-80% konfluens. Alle aktivitetsanalyser ble utført i serumfritt medium. Supernatant fra de stimulerte celler ble samlet opp ved 24 timer etter stimulering og lagres i -20 ° C inntil behov. 100 ul av supernatanten ble påført på ELISA-plate. TGF-β1 utskilles i latent form, og derfor prøver ble surgjort til pH 2 under anvendelse av 1 M saltsyre (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA) og inkubert i en time ved romtemperatur for å generere den immunreaktive formen av TGF-β1 . Prøvene ble deretter nøytralisert med 1 M natriumhydroksid (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA). 100 ul av den aktiverte prøven ble påført til ELISA-platen. Målingene ble utført i henhold til produsentens protokoll (ELISA Tech, Aurora, CO, USA).
Resultater
Full Length EMMPRIN Fungerer som en generell markør for elbiler utskilles i biologiske væsker samt fra dyrkede celler
tilstedeværelsen av ekstracellulær EMMPRIN skjema (e) ble først undersøkt i flere typer av biologiske fluider, inkludert humant serum, plasma, og ascites fluid for å bestemme hvorvidt EMMPRIN kan anvendes som en generell markør for nærværet av elbiler som har nylig blitt foreslått [16]. Prøvene ble filtrert ved anvendelse av et 0,22 um filter for å fjerne eventuelle celler eller cellerester og immunopresipitert (iPed) ved hjelp av en EMMPRIN antistoff. Etter deglykosylering, ble den fulle lengde formen av protein (28 kDa) detektert i humane sera og plasma fra både friske donorer og kreftpasienter, samt i ascitesvæsken samlet fra kreftpasienter med ingen observerbare nivåer av eventuelle spaltede former innenfor disse biologisk fluider (se fig. S1A og fig. S1B for humant serum og ascitesvæske, henholdsvis). Massespektrometri analyse av tryptiske fordøyinger ble anvendt for å bekrefte at entydig EMMPRIN er i iPed serumprøve, fig. S1C. Flere peptider tilordning til den ectodomain av EMMPRIN ble detektert og anvendt for å bekrefte tilstedeværelse av ekstracellulære EMMPRIN i serumprøvene, fig. S1C. Tilstedeværelsen av en full lengde transmembranprotein som EMMPRIN identifisert her er i overensstemmelse med en generell sekresjon av transmembranproteiner via elbil i alle biologiske fluider, men dette er nærmere vist i det følgende.
For å tilveiebringe en konsistent og pålitelig kilde til elbiler for senere analyser til direkte probe sine stimulerende roller, ble elbiler renset fra flere forskjellige pattedyrkreftcellelinjer. EMMPRIN ble undersøkt for å bestemme hvorvidt denne transmembranprotein kan brukes som en generell markør av el-biler for alle disse cellelinjer er analoge til elbil renset fra biologiske væsker som ovenfor. To brystkreftcellelinjer, MCF-7 og MDA-MB-231, ble brukt og elbiler renset fra disse cellelinjene betegnes som EV
MCF-7 og EV
MDA, henholdsvis. I tillegg er både en monocyttisk leukemicellelinje U937, og en bukspyttkjertelkreft cellelinje, L3.6pL, ble anvendt med EV avledet fra disse cellelinjene betegnet som EV
U937 og EV
L3.6pL, respektivt. Supernatanter fra celler dyrket i passende media supplert med antibiotika og 3% EV gratis FBS ble samlet hver 48. time.
Av de tidligere brukte metoder som benyttes for å rense utskilte elbiler, valgte vi å bruke størrelse utelukkelse kromatografi [27] . Spesielt ble Superose 6 størrelse-utelukkelses-kromatografi anvendes for å selektere for de store molekylvektfraksjoner, fig. 1A (rød boks). EMMPRIN ble påvist i EV fraksjon fra alle cellelinjene som ble testet her, fig. 1B, noe som indikerer at EMMPRIN sekresjon er et utbredt forekommende prosess.
A) utelukkelse Størrelse kromatografi elueringsprofilen til rensing av kondisjonert medium for å isolere elektriske biler. Den røde boksen tilsvarer elueringstoppen for de rensede elbiler. B) EMMPRIN utskilles via elbil i alle cellelinjene som ble testet, som vist ved Western blot probet for EMMPRIN i vesikkel fraksjoner renset ved anvendelse av størrelseseksklusjonskromatografi. C) nanopartikkel Spore analyse oppdager elbiler i den rensede prøven og validerer vår størrelse utelukkelse metode for å rense elbiler fra kondisjonert media. D) Elektronmikroskopi ble brukt til å visualisere de utskilte elbiler. Dataene som vises, er for EV
MDA.
Dermed våre studier her tyder på at ekstracellulært, full lengde EMMPRIN sekresjon via elbiler er et allment fenomen i stedet for en celletype bestemt prosess og EMMPRIN kan være brukes som en generell markør for tilstedeværelse av elbiler.
bekreftelse og validering av Purified elbiler som bruker nanopartikler Tracking Analysis, elektronmikroskopi og massespektrometri
Vi brukte flere metoder som vanligvis benyttes for EV deteksjon og visualisering for ytterligere å bekrefte vår EV rensemetode utenfor vår bekreftet tilstedeværelsen av EMMPRIN som en generell EV markør (fig. 1A, B). Spesielt ble nanopartikkel sporing analyse (NTA) som brukes for bestemmelse av størrelsesfordelingen av el-biler i prøvene. Basert på størrelsesfordelingen av de EV påvist ved anvendelse av NTA (fig. 1 C), kan det konkluderes med at cellelinjene som ble brukt i denne studien utskiller en heterogen populasjon av el-biler som varierer i størrelse 20-300 nm. Størrelsesområdet indikerer at disse vesikler utgjør mindre elbiler, kjent som exosomes (10-100 nm), og større elbiler kjent som mikrovesikler (100-1000 nm). Legg merke til at ytterligere sukrosegradient fraksjonering og påfølgende Western blot-analyse er identifisert EMMPRIN i begge populasjoner EV (data ikke vist), noe som indikerer at EMMPRIN er en generell markør for begge typer EV. Elektronmikroskopi (EM) ble anvendt for å visualisere EV utskilt fra forskjellige cellelinjer som vist for renset EV
MDA (Fig. 1D). EM data viste også heterogenitet i vesikkel størrelse som ble bestemt med NTA. Massespektrometrianalyse også ga identifikasjon av flere andre EV markører så som CD63, CD81 og Annexin V, som vist i tabell 1, for derved ytterligere å validere den rensemetode som brukes her. Dermed gitt størrelsesfordeling oppdages med NTA og EM og identifisering av EV spesifikke proteiner, konkluderer vi med at vår rensing metoden gir en blanding av exosomes og mikrovesikler.
elbiler blir raskt internalisert i mottakercellene
EV modulering av mottakercellefunksjonen er blitt foreslått å være i det minste delvis avhengig av deres opprinnelige opptak og overføring av last (se gjennomgang av Lopez-Verrilli [28]). I samsvar med en slik foreslått mekanisme, fant vi at de rensede elbiler blir internalisert i løpet av minutter etter monocytic leukemi THP-1 celler (fig. 2) og monocyttiske leukemi U937 celler (Fig. S4) og bekrefter dermed den biologiske aktiviteten til våre rene elbiler. Spesielt visualisert vi internalisering av Texas Red farget elbiler som tydelig puncti inn celler farget med en EMMPRIN-FITC antistoff som er tillatt for visualisering av cellemembranen (fig. 2, til høyre). Derfor, i disse eksperimentene benyttet vi det faktum at EMMPRIN innledningsvis sterkt uttrykt på mottakercelleoverflaten som en markør for den cellulære membran. Enkeltbilder fra gjennom celle volum Z-stabler ble samlet for å bekrefte at elbiler er faktisk internalisert i stedet for bare lokalisert på celleoverflaten. Vi har også kvantifisert prosentandelen av celler som internaliseres av el-biler ved å telle hyppigheten av EV-positive celler. Data i gjennomsnitt fra tre uavhengige målinger viser at vesikkel internalisering forekommer i 76% av cellene. Dermed er vesikkel intern ikke en sjelden forekomst, men en hyppig hendelse. Disse dataene viser også lokalisering av Texas Red farget elbiler på cellemembranen, noe som indikerer at elbiler er sannsynlig innlemmet eller knytter til cellemembranen samt å være internalisert.
fluorescens mikroskopi bilder av THP-1 celler behandlet med Texas rød farget elbiler. Venstre panel – THP-1 celle farget med EMMPRIN FITC og DAPI. Den røde signal er det auto-fluorescens-signal i cellen. Midtre panel – THP-1 celle behandlet med Texas Rødt flekken alene. Signalet observerte er den samme som i det venstre bildet og svarer til Texas rød bakgrunn og celle auto-fluorescens-signal. Høyre panel – THP-1 celler behandlet med Texas Red farget elbiler og visualiseres etter en 5-minutters inkubasjonstid. Cellemembranen er farget med EMMPRIN-FITC antistoff, er elbiler vises i rødt og DAPI farget kjerne er vist i blått. Referanse baren er 10 mikrometer.
elbiler Stimulere utsondring av flere kreft-assosiert Factors
Første aktivitetsanalyser.
Vi først vist flere mottakercellelinjer for å fastslå som, hvis noen, dyrkede celler var lydhør overfor våre renset EV
MCF og EV
MDA. Nærmere bestemt, MMP-9 og IL-6 sekresjon (fig. S2 og fig. S3, respektivt) ble overvåket ved stimulering med EV
MCF-7 og EV
MDA ved hjelp av enzymbundet immunosorbent assay (ELISA), siden begge av disse proteinene blir oppregulert i flere kreftformer sammen med de EMMPRIN markør av el-biler [29], [30]. Generelt, viser våre data på at det er foretrukket selektivitet i celletypen utløsning av en respons på stimulering EV. For eksempel, U937 monocytiske cellene var mer responsive i sekresjon både IL-6 og MMP-9 ved stimulering med EV i forhold til epitelceller. Vi gjorde observerer en økning i IL-6-sekresjon i både HFF og MBA-MB-231-celler ved stimulering med EV
MDA ble imidlertid ingen sekresjon av IL-6 eller MMP-9 stimulert med EV
MCF- 7. Dermed, siden U937 celler fremkalte den mest bemerkelsesverdige respons ved stimulering med begge typer elbiler som brukes i disse innledende ELISA-analyser, fokuserte vi på monocyttiske celler, THP-1 og U937, i senere aktivitetsanalyser.
Purified elbiler stimulere utskillelsen av EMMPRIN tyder på en positiv feedback loop.
Siden tidligere studier har vist at EMMPRIN er involvert i en positiv feedback loop i enkelte cellelinjer [31], vi neste ønsket å vurdere effekten av elbiler på EMMPRIN celleoverflate-ekspresjon og sekresjon i monocytter. THP-1-celler ble stimulert med 10 mikrogram av totalt protein for hver type vesikkel, dvs. EV
MCF-7 og EV
MDA, og inkubert ved 37 ° C i 24 timer. Som vist på fig.
