Abstract
Stamcelle pluripotency, angiogenese og epitelial-mesenchymale overgang (EMT) har vist seg å være betydelig oppregulert i bukspyttkjertelen ductal adenokarsinom (PDAC) og mange andre aggressive kreftformer. Den feilregulering av disse prosessene antas å spille viktige roller i startfasen, progresjon, og metastase, og er medvirkende til PDAC være den fjerde største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i USA. Svulsten suppressor miRNA
MIR-145
nedregulerer kritiske pluripotency faktorer og onkogener og resultater i trykt metastatisk potensial i PDAC. I tillegg regulerer
MIR-200
familien flere angiogene faktorer som har vært knyttet til metastaser i mange solide tumorer. Vi har tidligere vist at nedregulering av DCLK1 kan oppregulere kritiske mirnas både
in vitro Hotell og
in vivo
kreft modeller og resultater i nedregulering av c-MYC, KRAS, NOTCH1 og EMT-relatert transkripsjon faktorer. En fersk rapport har også vist at Dclk1 kan skille mellom normale og kreft stamceller i
Apc
min /+
mus og at ablasjon av Dclk1
+ celler resulterte i regresjon av intestinal polypper uten å påvirke homeostase. Her viser vi at knockdown av DCLK1 bruker poly (laktid-ko-glykolid) -encapsulated-DCLK1-siRNA resultater i AsPC1 tumorvekst arrest. Undersøkelse av xenografttumorer avslørt, (a) økt
MIR-145
som resulterer i redusert pluripotency vedlikehold faktorer OCT4, SOX2, Nanog, KLF4 samt KRAS og RREB1; (B) økte brev
7a
som resulterer i redusert pluripotency faktor LIN28B; og (c) økt
MIR-200
som resulterer i redusert VEGFR1, VEGFR2 og EMT-relatert transkripsjon faktorer ZEB1, ZEB2, brev og SLUG. Spesifisitet av DCLK1 post-transcriptional regulering av nedstrøms målene for
MIR-145
,
Mir-200
og brev
7a
ble oppnådd ved hjelp av en luciferase-baserte reporter analysen . Vi konkluderer med at DCLK1 spiller en betydelig mester regulerende rolle i bukspyttkjertelen tumorigenesis gjennom regulering av flere tumor suppressor mirnas og deres nedstrøms pro-tumorigene veier. Denne romanen begrepet målgruppe DCLK1 alene har flere fordeler i forhold til målgruppe enkelt sti eller miRNA-basert terapi for PDAC
Citation. Sureban SM, May R, Qu D, Weygant N, Chandrakesan P, Ali N et al . (2013) DCLK1 Regulerer pluripotency og angiogene faktorer
via
mikroRNA-avhengige mekanismer i kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 8 (9): e73940. doi: 10,1371 /journal.pone.0073940
Redaktør: Chunming Liu, University of Kentucky, USA
mottatt: 22 april 2013; Godkjent: 23 juli 2013; Publisert: 09.09.2013
Copyright: © 2013 Sureban et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health og National Cancer Institute tilskudd: CA-137482 (CWH); Oklahoma Senter for Advancement of Science and Technology, og Oklahoma Senter for Adult Stem Cell Research (CWH). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. CWH er en medstifter av COARE Bioteknologi Inc., og dette endrer ikke forfatterne «tilslutning til alle PLoS ONE politikk og deling av data og materialer.
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) er den fjerde største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i USA årlig med en 5 % 5-års overlevelse. Til tross for mer enn 10 år med FDA-godkjente terapiregimer og merket forbedringer i medisinsk og kirurgisk behandling, har ingen signifikant innvirkning på PDAC pasient overlevelse observert [1]. Nylig ble en undergruppe av celler med kreftstamcelle (CSC) egenskaper er blitt identifisert i PDAC [2] som er i stand til ubegrenset selvfornyelse og gi opphav til mer-differensiert og mer aggressive avkom, som ofte er resistente mot konvensjonelle kjemoterapi og strålebehandling [2,3]. Manglende evne til å utrydde disse cscs er antatt å være en grunn for svulst tilbakefall, metastaser og død etter innledende respons på behandling [4]. En annen viktig hindring i å bekjempe solide tumorkreftformer generelt er den heterogene celletyper innenfor svulsten mikromiljøet [5] og høyt desmoplastic tumor nisje [6]. Denne heterogeniteten er ytterligere komplisert ved epitelial til mesenchymale overgang (EMT), en prosess som spiller en nøkkelrolle i kreft invasjon og metastase [7,8]. Mange av EMT-induserende transkripsjonsfaktorer som SNAI1 (brev), SNAI2 (SLUG), ZEB1, ZEB2, TWIST1, FOXC2 og Goosecoid har vært forbundet med tumorinvasjon og metastase [9]. Nylig har en rekke rapporter identifisert mikroRNA (miRNA)
MIR-200
familien som grunnleggende markører og regulatorer av EMT [10-12]. mirnas er små, 19-22 nucleotide lange, ikke-kodende RNA som hemmer genekspresjon på posttranskripsjonelt nivå [13]. En sterk kobling mellom miRNA feilregulering og menneskelig kreft er etablert [14]. Følgelig mirnas har vist seg å fungere enten som onkogener (f.eks
MIR-155
,
MIR-17-5p Hotell og
MIR-21
) [15,16] eller tumor dempere (f.eks
MIR-34
,
MIR-15a
,
MIR-16-1 Hotell og brev
7
) [17 -20]. Imidlertid er den nøyaktige regulatoriske funksjoner som forskyve balansen mot en kreft fenotype med hensyn til tumor suppressor versus onkogen miRNA uttrykk dårlig forstått.
pluripotency er evnen av en celle til å differensiere til en hvilken som helst celletype og er et unikt karakteristisk for embryonale stamceller (ESCs). Pluripotency transkripsjonsfaktorer slik som OCT4, SOX2, Nanog og KLF4 danne regulatoriske nettverk og påvirker et bredt spekter av nedstrømsgener. Overekspresjon av disse faktorene kan dedifferentiate humane og musesomatiske celler i induserte pluripotente stamceller (iPSCs) [21]. Omprogrammering faktorer OCT4, SOX2, Nanog, KLF4, c-MYC, og LIN28 er også blitt foreslått å være onkogener, og kan være involvert i utviklingen av en rekke krefttyper [21-26]. Flere rapporter har vist at disse transkripsjonsfaktorene er regulert, i det minste delvis, ved mirnas [21,27,28].
MIR-145
spesifikt inhiberer de nevnte pluripotency faktorene ved å binde den 3 «ikke-translatert region (UTR) av mRNA, noe som fører til hemming av ESCs, selvfornyelse, og induksjon av differensiering. Videre tap av
MIR-145
svekker differensiering og løfter OCT4, SOX2, og KLF4 [21]. I tillegg har det blitt demonstrert at
MIR-145
arrangøren er bundet og undertrykt av OCT4 i ESCs. Dette indikerer (a) det eksisterer en direkte kobling mellom kjerne omprogrammering faktorer og
MIR-145
, og (b) tilstedeværelsen av en dobbel-negativ feedback loop som involverer OCT4, SOX2, KLF4, og
MIR-145 product: [21]. I kreft,
MIR-145
er nedregulert og har vist seg å ha tumorsupressorproteinene egenskaper. Tapet av
MIR-145 plakater (
MIR-143/145
cluster) er observert i KRAS muterte bukspyttkjertel kreft, og terapeutisk restaurering av disse miRNAs opphever tumorigenesis [29,30]. Videre Ras-responsive element binding protein 1 (RREB1) undertrykker
MIR-143 Twitter /
MIR-145
promoter aktivitet, noe som indikerer at undertrykkelse er en tidlig hendelse i bukspyttkjertelkreft initiering og progresjon [ ,,,0],29]. I tillegg KRAS og RREB1 er mål for
MIR-143/145
, demonstrerer en feed-forward mekanisme som forsterker RAS signale-mediert PDAC tumorprogresjon [29]. Det har nylig blitt demonstrert at ektopisk uttrykk for
MIR-143/145
resultater i trykt metastaser og økt vedheft av kreft i bukspyttkjertelen celler [30]. Disse dataene er tatt sammen tyder på at
MIR-145
er en mester regulator av iPSCs faktorer i ESCs og cscs og kan spille en viktig rolle i hemming av kreft i bukspyttkjertelen initiering, progresjon og EMT.
Vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) signalisering spiller en viktig rolle i tumorangiogenese. VEGF familiemedlemmer formidle den kritiske signal ved å binde seg til to tyrosin kinase reseptorer, VEGFR1 og VEGFR2. VEGFR1 er nødvendig for endotelial celleoverlevelse; mens, er VEGFR2 kreves for reseptor-mediert angiogen og vaskulær permeabilitet aktivitet [31-33]. Nylig er det blitt demonstrert at disse angiogene faktorer (VEGFR1 og 2) er involvert i tumormetastase av renale og tykktarm carcinoma-celler [34]. VEGF-signalering er kjent for å fremme tumorvaskulaturen og endotelcelleproliferasjon i PDAC. Studier med løselig VEGFR1 og VEGFR2 (hemming av VEGFR-mediert signalering i en dominant-negativ måte) eller VEGFR tyrosinkinasehemmere resulterte i hemming av tumor angiogenese, vekst og metastasering i PDAC musemodeller [35-38].
DCLK1 (tidligere kjent som DCAMKL-1) er en antatt intestinal og bukspyttkjertelen stamcelle markør og er oppregulert i stroma og epitel PDAC. Det har også nylig blitt beskrevet som en markør av den forholdsvis udefinert tuft /børste celle i bukspyttkjertelen og tarmen [39,40]. Den regulerer negativt flere tumor suppressor mirnas og spiller trolig en nøkkelrolle i initiering og progresjon av solide svulster kreft [11,41]. I tillegg regulerer det flere viktige onkogener (c-MYC, KRAS og NOTCH1) og EMT. Videre overekspresjon av pluripotency faktorer i leverkreftceller resulterte i økt ekspresjon av DCLK1 [42]. Nylig Nakanishi et al. [43], har brukt en elegant Dclk1-Cre mus modell for å demonstrere at Dclk1 markerer tarm tumor stamceller. Ablasjon av Dclk1 uttrykker celler i
Apc
min /+
mus resulterte i regresjon av polypper uten skade på normal intestinal epitel. I denne rapporten, etter knockdown av DCLK1 bruker nanopartikkel-innkapslet siRNA (NPsiDCLK1) i tumor xenopodet mus, observerte vi en betydelig økning i: (A)
MIR-143/145
klynge, noe som resulterte i nedregulering av nøkkel pluripotency markører (OCT4, SOX2, KLF4 og Nanog); (B) Bokstaven
7a
, noe som resulterte i redusert pluripotency faktor LIN28B; og (C)
MIR-200a, b Hotell og
c
, noe som resulterte i nedregulering av EMT og angiogene faktorer. Administrering av NPsiDCLK1 førte ikke åpenbar toksisitet i mus. Disse dataene er tatt sammen foreslå en sentral regulerende rolle DCLK1 i bukspyttkjertelen tumorigenesis.
Materialer og Metoder
Små forstyrrer RNA
DCLK1 siRNA (siDCLK1) sekvens målgruppe kodingen regionen DCLK1 (tiltredelse nr NM_004734) (GGGAGUGAGAACAAUCUACtt) og egge sirnas (si-SCR) som ikke samsvarer noen av de menneskelige gener ble oppnådd (Ambion Inc, Austin, TX).
Syntese og karakterisering av DCLK1 siRNA NPs
Poly (laktid-ko-glykolid) syre (PLGA nanopartikler NPS) ble syntetisert ved anvendelse av en dobbel emulsjon fordampning av løsningsmiddel teknikk som beskrevet tidligere [11,44]. I korthet, siRNA (DCLK1 eller kryptert) ble kondensert på den kationiske polymer poly (etylenimin) (PEI) for å danne et siRNA-PEI-komplekset. Dette komplekset ble tilsatt til PLGA i kloroform og virvles og overføres til 2% polyvinylalkohol. Denne emulsjonen ble sonikert og tillatt å fordampe natten over. Størrelsen, polydispersitet indeks, og Zeta-potensiale målinger av syntetiserte siRNA NPs ble bestemt ved hjelp av diffraksjon lysspredning (DLS) benytter Zeta PALS (Brookhaven Instruments, Holts, New York).
Xenotransplantat tumormodell
NOD /SCID-mus ble kjøpt fra Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine) og holder til i patogenfrie forhold. De ble tatt hånd om i henhold til retningslinjer fastsatt av American Association for Akkreditering av Laboratory Animal Care og US Public Health Service oppdrag Corps « «Policy on Human Care og bruk av forsøksdyr.» Alle studier ble godkjent og overvåket av universitetet of Oklahoma Health Sciences Center Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC). ASPC-1 celler (1 x 10
7) ble injisert subkutant i flankene av 4- til 6-wk gamle mus (n = 3). tumorer ble målt ved anvendelse av et skyvelære, og volumet ble kalkulert som (lengde x bredde
2) × 0,5. tumorene ble følbar 30 dager etter injeksjon av cellene. NPS ble rekonstituert i sterilt normalt saltvann og injisert direkte inn i tumorer. Hver dyr som bærer tumor ble injisert på dagene 30, 33, 36, 39, og 42 med en av de følgende preparater -50 ul (5 pM) av siRNA-NP fremstillingen [NP alene (kontroll), NP-siScrambled (NPsiSCR), eller NPsiDCLK1]. Alle mus ble drept på dag 45.
Immunohistochemistry, Western blot, real-time revers transkripsjon-PCR, miRNA analyse, Invasion analysen og luciferasereportergenet analysen
Disse analysene var utført som beskrevet tidligere [11,41]. Detaljerte beskrivelser er gitt i tilleggs delen av materialer og metoder (Tekst S1).
Resultater
RNA Slå av DCLK1 hemmer kreft i bukspyttkjertelen xenograft vekst
ASPC-en human bukspyttkjertel kreftceller ble injisert subkutant inn i flankene av NOD /SCID-mus og tumorene ble tillatt å utvikle seg i 30 dager. NP innkapslet sirnas (NPsiDCLK1 og NPsiSCR) ble injisert intratumorally. Nanopartikkel innkapsling ble utført for å overvinne de teoretiske begrensninger i siRNA basert levering [45]. Effekten av denne tilnærmingen har blitt testet tidligere i kolorektal kreft xenotransplantater [11]. På dag 30, da tumorene var håndgripelig, ble behandlingene startes og fortsatte hver tredje dag i totalt fem injeksjoner. Svulster ble skåret ut på dag 45, og tumorvolumene er representert i figur 1. Administrasjon av NPsiDCLK1 resulterte i en signifikant (~ 85%) reduksjon (
p
0,01) i tumorvolum sammenlignet med enten kontroll (NPs stående) eller NPsiSCR-behandlede tumorer (figur 1A og 1B). mRNA analyse viste en betydelig nedregulering (
p
0,01) av DCLK1 mRNA i forhold til kontroll eller NPsiSCR behandlet tumorer (figur 1C). Disse dataene er tatt sammen vise at hemming av DCLK1 resultater i ASPC-en svulst xenograft vekst arrest.
A, ASPC-1 menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler ble subkutant injisert i flankene av NOD /SCID mus til å generere svulster. På dag 30, PLGA NP innkapslet sirnas (siDCLK1 og siSCR) ble injisert direkte inn i tumorer og etterfulgt av injeksjoner hver tredje dag. Etter 5 injeksjoner, ble svulster skåret på dag 45 og er representert over. Tumor volum ble målt hver 3. dag. B, representant fotografi av mus med svulster fra hver gruppe vises. C, Ekspresjonen av mRNA DCLK1 i tumorene kvantifisert ved sanntids RT-PCR. Verdiene er gitt som gjennomsnitt ± SEM, og
stjernetegn
betegne statistisk signifikante forskjeller (*
p
0,01). Sammenlignet med kontroll (NP alene)
Knockdown av DCLK1 resulterer i nedregulering av pluripotency faktorer i bukspyttkjertelen tumorxenotransplantater via MIR-145
Det har vist seg at OCT4, SOX2, c-MYC, LIN28, Nanog og KLF4 kreves for ESC selvfornyelse og pluripotency og er oppregulert i noen aggressive kreftformer og i cscs [23-26,28]. Overekspresjon av disse faktorene kan omprogrammere eller dedifferentiate menneske- og musesomatiske celler i iPSCs. Her observerte vi en signifikant (
p
0,01) downregulation ( 40%) i mRNA uttrykk av pluripotency markører Nanog og KLF4 (figur 2A og 2B) ved real-time RT-PCR etter knockdown av DCLK1. Tilsvar Nanog og KLF4 proteiner ble også downregulated analysert ved immunohistokjemisk analyse (figur 2C og 2D). I tillegg har vi også observert en betydelig (mer enn 40%). Nedregulering av OCT4 (figur 2E) og SOX2 (figur 2F) på mRNA-nivå etter knockdown av DCLK1 i ASPC-1 tumorxenografter
siRNA- mediert knockdown av DCLK1 resulterte i nedregulering av pluripotency faktorer: Nanog mRNA (A); KLF4 mRNA (B); Nanog protein (C); KLF4 protein (D); OCT4 mRNA (E) og SOX-2-mRNA (F). mRNA ble analysert ved hjelp av sanntids-RT-PCR og proteinet ved immunhistokjemiske analyser. For søylediagram i A, B, E og F, er verdier gitt som gjennomsnitt ± SEM, og
stjernetegn
betegne statistisk signifikante forskjeller (*
p
0,01) sammenlignet med kontroll (NP alene).
DCLK1 post-transcriptionally regulerer MIR-145 i bukspyttkjertelkreft
MIR-145
har vist seg å undertrykke OCT4, SOX2, og KLF4, for derved å undertrykke pluripotency og styring av differensiering [21].
MIR-145
er nedregulert i ulike kreftformer og har vist seg å ha tumor suppressor og metastase hemmende egenskaper [29,30]. Tidligere rapporter [11,28,41] og de data som presenteres ovenfor indikerer at DCLK1 regulerer negativt tumor suppressor mirnas som brev
7a
,
MIR-144 Hotell og
MIR-200A
. Tilsvarende her observerte vi en signifikant induksjon (1,5 ganger) i
pri-MIR-143/145
klynge miRNA (figur 3A) og
pri-MIR-145
miRNA (figur 3B) etter knockdown av DCLK1 i ASPC-1 tumorxenotransplantater. Videre utførte vi en luciferasereportergenet analysen til kvantitativt måle effekten av DCLK1 knockdown på
MIR-145
miRNA. ASPC-1-celler ble transfektert med et plasmid inneholdende ildflue luciferase-genet med et komplementært
MIR-145
bindingssete ved 3′-UTR. Etter transfeksjon ble cellene behandlet med NPS alene, NPsiSCR eller NPsiDCLK1 og ble utsatt for luciferase aktivitetsmåling. En reduksjon i luciferase-aktivitet ble observert i celler behandlet med NPsiDCLK1 sammenlignet med kontrollen eller NPsiSCR (figur 3C). Disse dataene antyder at knockdown av DCLK1 resultater i nedregulering av
MIR-145
miRNA nedstrøms mål i kreft i bukspyttkjertelen celler. Det har tidligere vist at en feedback loop mekanisme eksisterer mellom
MIR-143/145 Hotell og KRAS og RREB1. RREB1 er kjent for å undertrykke transkripsjon av
MIR-143/145
ved å binde seg til sin promoter regionen. I tillegg KRAS og RREB1 er nedstrøms mål for
MIR-143/145 product: [29]. Knockdown av DCLK1 resulterte i økt uttrykk av
MIR-143/145
klynge og nedregulering av sin nedstrøms mål KRAS (figur 3D). Videre fant vi at uttrykket av RREB1 var signifikant nedregulert etter administrasjon av siRNA mot DCLK1 (Figur 3E). Med disse dataene, spekulerer vi at DCLK1 spiller en rolle i post-transcriptional regulering av
MIR-143/145
klynge og dermed nedregulerer KRAS og RREB1 i bukspyttkjertelen tumorxenotransplantater.
Etter knockdown av DCLK1 i ASPC-1 tumorxenotransplantater, en betydelig oppregulering av
MIR-143/145
klynge (A) og
MIR-145
miRNA (B) ved real-time RT-PCR. C En reduksjon i luciferase aktivitet (luciferase enheter) etter transfeksjon med plasmid-koding luciferase inneholder
MIR-145
bindingsstedet ble observert etter knockdown av DCLK1 i ASPC-1 menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler. Knockdown av DCLK1 også resulterte i nedregulering av KRAS (D) og RREB1 (E) mRNA, nedstrøms mål av
MIR-143/145
miRNA klynge, analysert ved hjelp av real-time RT-PCR. Verdiene er gitt som gjennomsnitt ± SEM, og
stjernetegn
betegne statistisk signifikante forskjeller (*
p
0,01). Sammenlignet med kontroll (NP alene)
Samlet er disse dataene til sammen viser et potensial regulerende rolle for DCLK1 i uttrykket av IPSC faktorer i bukspyttkjertel kreft via
MIR-145
miRNA.
DCLK1 regulerer la-7a og dens nedstrøms mål LIN28B i bukspyttkjertelkreft
i bukspyttkjertel og kolorektal kreft celler, har vi tidligere vist at DCLK1 negativt regulerer miRNA brev
7a
. siRNA-mediert knockdown av DCLK1 resulterte i nedregulering av brev
7a
nedstrøms mål c-myc og KRAS. I bukspyttkjertelen tumorxenotransplantater behandlet med NPsiDCLK1, observerte vi en signifikant oppregulering av brev
7a plakater (figur 4A) og påfølgende nedregulering av sin nedstrøms mål c-MYC (mRNA og protein) (figur S1). Rapportene tyder på at LIN28B, en pluripotency vedlikeholdsfaktor regulerer miRNA brev
7
og i sin tur brev
7
regulerer LIN28B (på grunn av tilstedeværelsen av bindingssetet i 3 «UTR av LIN28B) , noe som antyder en dobbel negativ feedback loop mellom LIN28 og brev
7 product: [46,47]. Her ønsket vi å se om NPsiDCLK1 regulerer nedstrøms mål for brev
7a
miRNA. ASPC-1-celler ble transfektert med plasmid som koder for ildflue luciferase-genet under kontroll av 3′-UTR inneholdende bindingssetet for brev
7
. Etter transfeksjon ble cellene behandlet med NPsiDCLK1 og utsatt for luciferase måling. Etter knockdown av DCLK1, observerte vi en betydelig nedregulering av
la-7
-avhengig luciferase aktivitet (figur 4B) indikerer at NPsiDCLK1 regulerer nedstrøms mål for brev
7
i kreft i bukspyttkjertelen celler. Basert på real-time RT-PCR analyse av svulster behandlet med NPsiDCLK1, observerte vi en betydelig nedregulering av LIN28B mRNA i forhold til NPsiSCR eller kontrollbehandlede tumorer (Figur 4C). Disse dataene indikerer at DCLK1 regulerer LIN28B via
la-7
-avhengig mekanisme.
A, siRNA-mediert knockdown av DCLK1 i tumorxenotransplantater resulterer i økt uttrykk av
pri-brev 7a
miRNA. B, Etter knockdown av DCLK1, en nedgang på
MIR-let7a
avhengig luciferase aktivitet ble observert i ASPC-1 celler. C, LIN28B mRNA nedstrøms målet for brev
7a
ble nedregulert i tumorer behandlet med NPsiDCLK1. Verdier i stolpediagrammene er gitt som gjennomsnitt ± SEM, og stjernene betegner statistisk signifikante forskjeller (*
P
0,01). Sammenlignet med kontroll (NP alene)
DCLK1 regulerer MIR-200 familie gener og EMT i bukspyttkjertelkreft
EMT er et høyt konservert prosess, karakterisert ved det fenotypiske omdannelse av epitelceller til mesenchymale celler [7]. EMT er vesentlig forskjellige prosessen, inkludert organ morfogenese, sårheling, kreft metastase og vev-omforming i embryonal utvikling. Nyere studier har vist at
MIR-200a, b Hotell og
c product: (
MIR-200
) er kjent for å regulere EMT og angiogenese [48]. Tidligere studier har vist at DCLK1 er overuttrykt i menneskelige kreft i bukspyttkjertelen vev og co-lokaliserer med brev og SLUG. Etter knockdown av DCLK1, en betydelig nedregulering av ZEB1, ZEB2, brev og SLUG ble observert etter økt uttrykk av
pri-MIR-200a
i ASPC-1 kreftceller [11]. Tilsvarende i ASPC-1 tumorxenotransplantater, en to-fold induksjon av
pri-Mir
-200
en product: (
p
0,01) (figur 5A) ble observert . Videre ønsket vi å undersøke effekten av DCLK1 knockdown på uttrykk for
MIR-200B Hotell og
c
i ASPC-1 tumorxenotransplantater. I likhet med
MIR-200a
, observerte vi en signifikant oppregulering av
MIR-200b plakater (1,5 ganger) (figur 5A) og
MIR-200c plakater (2 ganger ) (figur 5A) etter knockdown av DCLK1. Deretter ønsket vi å undersøke om DCLK1 regulerer nedstrøms målene for
MIR-200
. Vi utførte en luciferase reporter analysen for
MIR-200
. ASPC-1 celler ble transfektert separat med plasmider som koder luciferase genet under regulering av miRNA bindingssteder (tre plasmider som hver inneholder bindingsseter for
MIR-200a, b
eller
c
) på sitt 3 «UTR. Etter transfeksjon, behandlet vi cellene med NP-siDCLK1. Cellelysatene ble utsatt for luciferase måling. Etter knockdown av DCLK1, var det en betydelig nedregulering av
MIR-200a
,
MIR-200B Hotell og
MIR-200c plakater (figur 5B) mediert luciferase aktivitet. Disse dataene indikerer at DCLK1 regulerer
MIR-200
og nedstrøms mål i PDAC. Vi har også observert en påfølgende reduksjon av
MIR-200
nedstrøms mål ZEB1 og ZEB2 (figur 5C), brev og SLUG (figur 5D) etter knockdown av DCLK1 i bukspyttkjertelen tumorxenotransplantater. Videre ASPC-1 celler ble behandlet med NPsiSCR eller NPsiDCLK1 og utsatt for invasjon analysen ved hjelp av BD Biosciences Matrigel invasjonen kamre (BD BioCoat
TM). Vi observerte signifikant inhibering av invasjon følge knockdown av DCLK1 (figur 5E og F). Disse dataene er tatt sammen tyder på at knockdown av DCLK1 hemmer EMT og invasjon ved å regulere
MIR-200
i menneskelige bukspyttkjertelen tumorxenotransplantater og kreftceller. I likhet med våre tidligere studier, etter knockdown av DCLK1, vi også observert hemming av NOTCH1 via
MIR-144 plakater (figur S2) i ASPC-1 tumorxenotransplantater.
A, siRNA-mediert knockdown av DCLK1 resultater i økt uttrykk av
pri-MIR-200a
,
pri-MIR-200B Hotell og
pri-MIR-200c
ved real-time RT-PCR . B, Etter knockdown av DCLK1, en nedgang på
MIR-200a
,
MIR-200B Hotell og
MIR-200c
avhengig luciferase aktivitet ble observert i ASPC-1 celler . Tumorxenotransplantater behandlet med NPsiDCLK1 vist en nedregulering av EMT transkripsjon faktorer ZEB1 og ZEB2 mRNA (C), redusert SNAIL og SLUG mRNA uttrykk (D). E, siRNA-mediert hemming av DCLK1 resultater i hemming av invasjonen i ASPC-1 celler. Hvite piler indikerer cellene invaderte gjennom Matrigel matrisen. F, Bar graf viser kvantifisering av invaderte celler etter hver behandling. Celler ble talt i 5 forskjellige felt for hver pakning. Verdier i stolpediagrammene er gitt som gjennomsnitt ± SEM, og stjernene betegner statistisk signifikante forskjeller (*
P
0,01). Sammenlignet med kontroll (NP alene)
DCLK1 regulerer angiogene faktorer i PDAC
Det er vist at
MIR-200
hemmer lunge adenokarsinom invasjon og metastasering ved å målrette VEGFR1. En antatt bindingssetet for
MIR-200
ble observert i 3 «UTR av VEGFR1, og det ble demonstrert at
MIR-200
negativt regulerer VEGFR1 [48]. I tillegg er en fersk undersøkelse viste at VEGFR1 og VEGFR2 har et bindingssete for
MIR-200B Hotell og basert på luciferase-baserte reporter analysen
MIR-200b
regulerer disse angiogene faktorer [49]. Disse dataene indikerer at VEGFR1 og VEGFR2 er nedstrøms mål for
MIR-200
. Her fant vi DCLK1 regulere
MIR-200
og nedstrøms mål. Vi ønsket å ytterligere undersøke effekten av DCLK1 knockdown på angiogene faktorer VEGFR1 og VEGFR2. Vi har observert en betydelig nedregulering av VEGFR1 mRNA (figur 6A), protein (figur 6B og C – venstre panel) i tumorer behandlet med NPsiDCLK1 sammenlignet med kontrolldyr og behandlede NPsiSCR-tumorer. Vi har også observert nedregulering av VEGFR2 mRNA (figur 6E) og protein (figur 6C – panel til høyre) i bukspyttkjertelen tumorxenotransplantater behandlet med NPsiDCLK1. I tillegg utførte vi luciferase-baserte reporter analyser for VEGFR1 og VEGFR2. ASPC-1-celler ble transfektert med luciferase-gen med VEGFR1 eller VEGFR2 3 «UTR, behandlet med NPsiDCLK1 og utsatt for luciferase aktivitetsmåling. Etter knockdown av DCLK1, observerte vi en betydelig nedregulering av VEGFR1 (figur 6D) og VEGFR2 (figur 6F) 3 «UTR mediert luciferase aktivitet. Disse dataene er tatt sammen tyder på at DCLK1 regulerer VEGFR1 og VEGFR2
via MIR-200
i PDAC.
A, siRNA-mediert knockdown av DCLK1 resulterer i redusert uttrykk av VEGFR1 mRNA i NPsiDCLK1 behandlet tumorxenotransplantater . En reduksjon i VEGFR1 protein ble observert i NPsiDCLK1 behandlede tumorer (B – Western blot, C – immunfluorescens – venstre panel, VEGFR1 rød). D, Etter knockdown av DCLK1, en nedgang i VEGFR1-3’UTR avhengig luciferase aktivitet ble observert i ASPC-1 celler. E, knockdown av DCLK1 resulterer i redusert uttrykk av VEGFR2 mRNA i NPsiDCLK1 behandlet tumorxenotransplantater. F, En reduksjon i VEGFR2-3’UTR-avhengig luciferaseaktivitet ble observert i ASPC-1-celler. NPsiDCLK1-mediert knockdown av DCLK1 resulterte i redusert uttrykk for VEGFR2 protein beregnes ved hjelp av immunfluorescens analyse (C – panel rett, VEGFR2 rød). Verdier i søylediagrammer i A, B, D og E, er gitt som gjennomsnitt ± SEM, og stjernene betegner statistisk signifikante forskjeller (*
P
0,01). Sammenlignet med kontroll (NP alene)
Diskusjoner
mirnas er raskt voksende som kritiske regulatorer av praktisk talt alle viktige cellulære prosesser. Feilregulering av miRNAs er ganske vanlig i mange menneske kreft inkludert PDAC. I mange svulster, er det enten overekspresjon av såkalte onkogene mirnas (f.eks
MIR-155
,
MIR-17-5p Hotell og
MIR-21
) [ ,,,0],15,16] eller nedregulering av tumorsupressorproteinene mirnas (f.eks
MIR-34
,
MIR-15a
,
MIR-16-1 Hotell og brev
7
) [17-20]. Bokstaven
7 Hotell og
MIR-200
familier er velkjent regulatorer av nøkkeldifferensierings programmer under utvikling. Tap av brev
7
i kreft resulterer i progresjon og dedifferentiation, og
MIR-200
familie har vist seg å være en viktig regulator av EMT. Videre har nyere studier knyttet brev
7
med stamcelle vedlikehold og EMT. Dermed er det fullt mulig at tumorprogresjon kan representere en prosess som resulterer i progressiv dedifferentiation (EMT) mot en celletype som har en stamcelle-lignende fenotype. Dessuten, synes prosessen å være strengt regulert av miRNA-avhengige mekanismer [10,11,27,30]. DCLK1 regulerer EMT i menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler
via
en
MIR-200a
avhengig mekanisme [11] og er også en regulator av brev
7a
i bukspyttkjertelen og tykktarmskreft celler, som støtter ideen om at disse mirnas er relevante og nye mål i flere solide svulster kreft [10,11,27,30,41]. DCLK1 er en antatt markør av tarm og bukspyttkjertel stamceller og er oppregulert i flere solide tumorer som gir ytterligere bevis for dens potensial sentral rolle i tumorigen prosessen. I denne rapporten har vi vist at i tillegg til å regulere flere tumor suppressor mirnas og nedstrøms onkogene mål, DCLK1 hemming resulterer i oppregulering av miRNAs som negativt regulerer flere sentrale pluripotency og pro-angiogene faktorer. Disse dataene støtter forestillingen om at DCLK1 er en sentral regulator av svulsten prosessen.
undertrykkelse av
MIR-143 Kjøpe og
MIR-145
, to co-transkribert mirnas ligger på menneskelig kromosom 5q, har blitt rapportert i bukspyttkjertelkreft. Samler data tyder på at de har tumor suppressor aktivitet [50,51]. Redusert
MIR-143/145
uttrykk er et felles trekk ved mange krefttyper, inkludert tykktarmskreft og PDAC [29,50,51]. Videre uttrykk for disse miRNAs hemmer spredning og aktiverer apoptose av kreftceller
in vitro Hotell og
in vivo product: [29].
