Abstract
Strålebehandling er en viktig behandlingsmetode for kreft i munnhulen. Men utviklingen av radioresistance er et stort hinder i effekten av strålebehandling i orale kreftpasienter. Identifisere prediktorer for radioresistance er en utfordrende oppgave, og har møtt med liten suksess. Hensikten med denne studien var å undersøke differensial spektrale profiler av de etablerte radioresistant underlinjer og foreldre muntlig kreft cellelinjer ved Raman-spektroskopi. Vi har etablert radioresistant underlinjer nemlig 50Gy-UPCI: SCC029B og 70 Gy-UPCI: SCC029B fra sin foreldre UPCI: SCC029B cellelinje, ved hjelp av klinisk tillatelig 2Gy fraksjonert ioniserende stråling (FIR). Den utviklede radioresistant karakteren ble validert av klonogene celle overlevelse analyse og kjente radioresistance relaterte protein markører som Mcl-en, Bcl-2, Cox-2 og Survivin. Endret cellulær morfologi med signifikant økning (p 0,001) i antall filopodia i radioresistant celler med hensyn til parentale celler ble observert. Raman spektra av foreldre UPCI: SCC029B, 50Gy-UPCI: SCC029B og 70 Gy-UPCI: SCC029B celler ble anskaffet og spektrale egenskaper indikere mulige forskjeller i biomolekyler som proteiner, lipider og nukleinsyrer. Prinsipal komponent analyse (PCA) gitt tre klynger som tilsvarer radioresistant 50Gy, 70 Gy-UPCI: SCC029B underlinjer og foreldre UPCI: SCC029B cellelinje med mindre overlapping, som foreslår endret molekyl profil kjøpt av radioresistant cellene på grunn av flere doser av stråling. Funnene i denne studien støtter potensialet i Raman-spektroskopi i prediksjon av radioresistance og muligens bidra til bedre prognose av kreft i munnhulen
Citation. Yasser M, Shaikh R, Chilakapati MK, Teni T (2014) Raman Spektroskopiske Study av Radioresistant oral cancer underlinjer Fastsatt av Fraksjonert ioniserende stråling. PLoS ONE 9 (5): e97777. doi: 10,1371 /journal.pone.0097777
Redaktør: Gabriele Multhoff, Technische Universitaet Muenchen, Tyskland
mottatt: 07.02.2014; Godkjent: 23 april 2014; Publisert: May 19, 2014
Copyright: © 2014 Yasser et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Den Raman spektrometer benyttet i studien ble anskaffet fra DBT prosjekt BT /PRI11282 /mED /32/83/2008, med tittelen «Utvikling av in vivo laser Raman-spektroskopi metoder for diagnostisering av oral forstadier til kreft,» Institutt for bioteknologi, Government of India. Mohd Yasser er finansiert av et fellesskap fra Universitetet Grants Commission (UGC) – India. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Oral kreft er den sjette vanligste kreftformen i verden [1]. I India, omfattende tobakksbruk i ulike former gjør det den ledende typen kreft hos menn og tredje vanligste kreftformen hos kvinner [2], [3]. Også forekomsten av oral buccalslimhinnen krefttypen er høy i det indiske subkontinentet [4]. De behandlingsmetoder for kreft i munnhulen er basert på ulike faktorer, blant annet stadium av sykdommen, tilgang til den muntlige området, alder og fysisk status for pasienten. Selv om kirurgi er valg av behandling i tidlig fase; strålebehandling har en viktig plass enten alene eller som et hjelpestoff sammen med kjemoterapi [5], [6]. Standard strålebehandling protokollen innebærer daglig eksponering av 2Gy brøkdel dose for noen uker, der pasientene får en kumulativ dose på 50Gy til 70 Gy under strålebehandling kurs [7], [8], [9]. Fraksjonert strålebehandling dreper raskt dele tumor cellepopulasjonen med nedsatt effekter på omkringliggende normalt vev. Derfor er denne metode gir tid for normale celler å re-populere og gjenvinne mens minsktumorceller som har aktivert abnormt signaltransduksjonsveier [10], [11]. Men gjentar seg noen ganger svulst med en ervervet radioresistant fenotype poserer som en hindring mot effekten av strålebehandling. For å gjøre radioterapi mer effektivt; er det viktig å utforske radioresistant fenotypen i kreftceller. Forening av flere proteiner, slik som p53 [12], Cox-2 [13], Ras [14], pakt [15], MDM2 [16], Clusterin [17], Survivin [18], Bcl-2 [19] og MCL-1 [20] med radioresistance er rapportert tidligere. Men så langt er det ingen tilgjengelige verktøy som kan forutsi strålebehandling respons i orale kreftpasienter fører mot bedre behandling.
Biomedisinsk anvendelse av optiske spektroskopiske teknikker som fluorescens, Fourier overføring infrarød (FTIR), diffus refleksjon og Raman-spektroskopi (RS) for klassifisering av forskjellige patologiske tilstander og diagnose av kreft har allerede blitt rapportert [21] – [24]. Blant disse teknikkene, har RS lagt fordeler som det er etiketten gratis, følsomme for biokjemiske variasjoner, som gjelder for
in vitro Hotell og
in vivo
forhold har minimum forstyrrelser fra vannet og gir molekylære fingeravtrykk [ ,,,0],25] – [27]. Våre tidligere studier har vist effekt av RS i klassifisere sunt, premaligne og maligne lesjoner av oral submucosa [28] – [29]; klassifisering av normale og unormale ekspandert celler [30] og i prediksjon av tumorrespons mot samtidig kjemoterapi eller strålebehandling i livmorhalskreft [31]. Vi har vist at potensialet av RS til å identifisere begynnelsen av omformings endringer i munnkinnslimhinnen [32], dens gjennomførbarhet ved påvisning av astma og å bestemme behandlingsrespons gjennom serum i astmapasienter [33], i klassifisere normal og oral cancer serum [34] og i identifisering av multiresistens fenotype i human leukemi [35] og uterussarkom cellelinjer [36].
(A) klonogene celleoverlevelse kurve. UPCI: SCC029B foreldre celler, 50Gy-UPCI: SCC029B mellom radioresistant celler og 70 Gy-UPCI: SCC029B endelige radioresistant celler. Data blir representert som prosent overlevelse av celler med en gjennomsnittlig (± SD) av tre uavhengige eksperimenter. Enveis ANOVA statistisk analyse ble utført på overlevende fraksjoner ved de gitte dosene, p 0,01 0,001. (B) Uttrykk for radioresistance markører i radioresistant muntlige underlinjer. Western blotting for Cox-2, Bcl-2, Mcl-en og Survivin proteiner; β-Actin brukes som lasting kontroll. Densitometry analyse av vestlige blotter fra tre separate forsøk er vist nedenfor, barer representerer gjennomsnitt ± standardavvik * Representerer protein uttrykk i forhold til foreldrenes cellelinje, mens # representerer protein uttrykk forhold mellom 50Gy-UPCI: SCC029B og 70 Gy-UPCI. SCC029B underlinjer (p 0,05)
RS studier knyttet til stråling indusert biokjemiske forandringer i prostata, lunge og brystkreft cellelinjer bestrålt med stråledoser mellom 15 og 50Gy rapporteres [37], [38]. Disse studiene ble utført ved enkeltdoser av stråling som tok sikte på å undersøke
in vitro
stråling respons på menneskelige kreftcellelinjer. På den annen side, gjennomførte vi denne studien, drar nytte av kontinuerlig lav dose fraksjonert bestråling rutinemessig brukes som standard strålebehandling protokollen i klinikker for oral cancer behandling. Vårt mål var å utvikle
in vitro
radioresistance karakter i cellelinjen over en periode og deretter utforske gjennomførbarheten av Raman spektroskopi for å kategorisere ervervet trekk fra sine foreldre ubehandlede celler. Vi har etablert radioresistant oral cancer underlinjer av munnslimhinnen opprinnelse ved klinisk gjennomfør 2Gy fraksjonert stråledose. Etter etablering av underlinjer, ble deres radioresistant karakter vurderes av klonogene celle overlevelse analyse og Raman spektrale profiler ble innhentet av retten. Så langt vi kjenner til, er vi først til å rapportere nytten av RS i oppkjøpte radioresistant oral cancer underlinjer etablert fra foreldremunnhulekreft cellelinje ved klinisk administreres fraksjonert ioniserende stråling.
Materialer og metoder
etablering og karakterisering av Radioresistant cellelinjer
a) celle~~POS=TRUNC kultur~~POS=HEADCOMP og etablering av radioresistant underlinjer ved gammastrålebehandlingen
UPCI. SCC029B, human oral buccalslimhinnen carcinoma cellelinjen ble vennlig levert av Dr . Susanne M. Gollin, University of Pittsburgh, USA [39]. Celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM, Gibco) supplert med 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS, Sigma-Aldrich) og antibiotika (100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin). Celler ble opprettholdt ved 37 ° C i 5% CO
2 fuktig atmosfære.
(A) Celle morfologi analyse. Foreldre UPCI: SCC029B celler, radioresistant 50Gy-UPCI: SCC029B og 70 Gy-UPCI: SCC029B celler. Skala barer: 100 mikrometer. (B) Confocal bilder av trådformede-Actin farget med Alexa Fluor-488 phalloidin ble cellene mot farget med DAPI. Skala barer: 20 mikrometer. Pil viser filopodia som fine celleoverflate utvidelser. Analyse basert på 50 celler per befolkning med gjennomsnitt og standardavvik av tre uavhengige eksperimenter, plottet på under høyre side (p 0,01, 0,001)
For å generere radioresistant underlinjer, UPCI:. SCC029B celler (en × 10
6 celler) ble sådd i 100 mm kultur plater (BD-Biosciences) inneholder komplett media. Cellene ble dyrket i standard tilstand og ble bestrålt med 2Gy av ioniserende stråling ved hjelp av
6 ° Co-γ Linear Accelerator (Bhabhatron-2, ACTREC, Tata Memorial Centre) ved 60% konfluens. Umiddelbart etter bestråling kulturmediet ble fornyet og cellene ble plassert i inkubator før de nådde 90% konfluens. Cellene ble så trypsinert, telles og føres inn nye kulturplater. Cellene ble behandlet igjen med 2Gy av ioniserende stråling på omtrent 60% konfluens. Denne prosedyren ble gjentatt 25 ganger for generering av mellom 50Gy-UPCI: SCC029B radioresistant sublinje og ytterligere fortsettes opp til 35 ganger i løpet av en periode på 5 til 6 måneder før genereringen av slutt 70 Gy-UPCI:. SCC029B radioresistant sublinje
( A) Foreldre UPCI: SCC029B cellelinje (B) 50Gy-UPCI: SCC029B underlinjen (C) 70 Gy-UPCI:.. SCC029B underlinjen
b) klonogene celle overlevelse analyse
Kort , kjent antall både foreldrenes og radioresistant cellene UPCI: SCC029B ble sådd i 100 mm kulturplater og holdt i CO
2 inkubator over natten for tilslutning til platene. Neste dag ble cellene bestrålt med til og med doser fra 2Gy til 8Gy og inkubert ved 37 ° C for kolonidannelse. Etter 14 dager ble kolonier fiksert med absolutt etanol og farget med 0,1% krystallfiolett. Kolonier bestående av 50 eller flere celler ble regnet som klonogene overlevende. Den prosentvise pletteringseffektiviteten, D0 verdi (stråle dose hvor 37% populasjonen overlever) og overlevende fraksjon ved en gitt strålingsdose ble beregnet på basis av overlevelse av ikke-bestrålte celler som tidligere beskrevet [40]. Tre uavhengige eksperimenter ble utført, hver gang i duplikater med foreldre og radioresistant underlinjer og celleoverlevelseskurve ble plottet etter beregning overlevende brøkdel ved hver dose. Videre ble Enveis ANOVA statistisk analyse utført for å finne den signifikant forskjell i overlevelse i forskjellige doser av stråling
(A) 50Gy-UPCI: SCC029B underlinjen – foreldre UPCI. SCC029B cellelinje (B) 70Gy- UPCI: SCC029B underlinjen – foreldre UPCI: SCC029B cellelinje (C) 50Gy-UPCI: SCC029B underlinjen -70Gy-UPCI: SCC029B underlinjen
(A) Masse faktor 1, 2 og 3 (B. ) 3-D spredningsdiagram for foreldre UPCI: SCC029B cellelinje, radioresistant 50Gy-UPCI: SCC029B og 70 Gy-UPCI:.. SCC029B underlinjer
c) Western blotting
Celler ble lysert i pattedyrcellelyseringsbuffer inneholdende 1% protease inhibitor (Thermo Scientific, USA). Cellelysatet ble sentrifugert ved 13000 rpm i 10 minutter ved 4 ° C og supernatanten inneholdende totalt cellulært protein ble oppsamlet. Proteinkonsentrasjonen ble kvantifisert ved kolorimetrisk analyse [41]. Prøver inneholdende 40 ug totalt protein ble separert ved 12% SDS-PAGE og overført til en PVDF-membran (PALL laboratorium, USA). Membranene ble blokkert ved romtemperatur i 1 time med inkubering i TBS som inneholdt 0,1% Tween (TBST, pH 7,4) og 5% (w /v) lettmelk. Etter blokkering, ble membranene inkubert med kanin polyklonalt IgG humane anti-Mcl-1 (1:1000, SC-20679); BCL-2 (1:500, sc-492), Survivin (1:1000, sc-10811), geitepolyklonalt IgG anti-Cox-2 (1:500, sc-1747) og rengjøring polyklonale kanin IgG anti-B Actin (1:3000, sc-1616); (Santa Cruz Biotech., USA) over natten i blokkeringsbuffer. Etter vasking seks ganger i TBST, ble membranene inkubert med et HRP-konjugert anti-kanin-IgG-antistoff (1:2800) eller anti-geite-IgG-antistoff (1:2500, Santa Cruz Biotechnology) i blokkeringsbuffer i 1 time. Etter å ha vasket seks ganger i TBST og to ganger i TBS, binding primært antistoff ble visualisert ved forbedret chemiluminescence substrat system (GE Healthcare, USA). Den vestlige blotting ble utført på tre uavhengige cellelysatene av foreldre, 50Gy og 70 Gy celler. Den densitometry Analysen ble utført av Image J programvare (NIH, USA) mot β-Actin rengjøring protein uttrykk.
d) morfologiske evaluering og F-Actin farging.
Morfologiske forandringer observert under fraksjonert ioniserende stråling ble fotografert ved hjelp av invertert mikroskop (Axiovert-200M, Zeiss) kombinert med digitalkamera. Representative bilder av foreldre UPCI: SCC029B cellelinje, 50Gy-UPCI: SCC029B og 70 Gy-UPCI: SCC029B underlinjer ble behandlet ved hjelp Axiovision programvare (slipp 4.7, Carl Zeiss)
For trådformede Actin farging, celler ble dyrket. på Dekkglass, fiksert med paraformaldehyd (4%) i 15 minutter og permeabilisert i 0,7% Triton-X. En høy affinitet filamentøse Actin (F-aktin) probe Alexa Fluor-488 phalloidin (Life Technologies, USA) ble fortynnet 1:20 (i 1 x PBS) og inkubert med cellene på dekkglass i 30 minutter ved romtemperatur i mørke. Etter inkubering ble objektglassene vasket to ganger med 1 x PBS i 10 minutter. DAPI (1:20 fortynnet i 1X PBS) farging ble gjort for ca 1 minutt og Dekk ble deretter montert i anti-quenching monteringsmiddel (Vectashield, Vector labs, USA) på et rent glass slide og undersøkt med LSM 510 Meta Carl Zeiss confocal system (Carl Zeiss Micro Imaging GmbH, Tyskland). Hver av de foreldre, 50Gy og 70 Gy celler ble dyrket i duplikater på dekkglass og tilfeldige bilder for 50 celler ble kjøpt. På denne måten ble det farging utført tre ganger uavhengig og 50 celler ble analysert hver gang fra alle cellebefolkningstyper for filopodia telling.
Raman spek
a) for prøveopparbeidelse og spektral oppkjøpet.
Foreldre UPCI: SCC029B, 50Gy-UPCI: SCC029B og 70 Gy-UPCI: SCC029B celler ble dyrket i 100 mm kulturplater. Eksponensielt voksende celler (3 x 10
6-celler) fra 6 uavhengige kulturer av hver av de foreldre, 50Gy og 70 Gy-celler ble høstet og fosfatbuffersaltløsning (PBS) vaske ble gitt til cellepelletene før spektra opptak. Omtrent 7-spektra ble anskaffet fra hver celle pellet ved hjelp av fiberoptisk Raman mikrosondesystem som beskrevet tidligere [33]. Altså totalt ~ 40 spektra per gruppe ble ervervet for hver av foreldre, 50Gy og 70 Gy celler.
Som nevnt ovenfor, Raman system anvendes for studium består av en diodelaser (Process Instruments) i 785 nm bølgelengde som eksitasjon kilde og en høy virkningsgrad (HE-785, Horiba-Jobin-Yvon, Frankrike) spektrograf kombinert med en CCD (Synapse, Horiba-Jobin-Yvon, Frankrike) som deteksjon element. Optisk filtrering av uønsket støy blant annet Rayleigh-signaler er oppnådd gjennom «Superhead «hjelpe-komponent i systemet. Super hode kombinert med en 40 x mikroskopisk objektiv (Nikon, NA 0,65) ble anvendt for å levere laser lys, samt for å samle Raman signaler. Spektrograf har ingen bevegelige deler med faste 950 gr /mm rist og spektral oppløsning som per produsentens spesifikasjoner er ~ 4 cm
1. Anslått laserpunktstørrelse på cellepellet prøven var 5-10 um. Spectra ble integrert i 6 sekunder og midlet over 3 ansamlinger. Typisk laser makt på prøven var 40 + 0,05 mW.
b) Spectral pre-prosessering og analyse av data.
Raman-spektrene ble pre-behandlet ved å korrigere belastet par enhet (CCD) respons etter en National Institute of Standards and Technology (NIST) sertifisert standard referansemateriale 2241 (SRM 2241) etterfulgt av subtraksjon av bakgrunnssignaler fra optiske elementer og CaF
2 vindu. For å fjerne forstyrrelser av langsom bevegelse bakgrunn, første derivater av spektra – ble (Savitzky Golay metode) som brukes for dataanalyse [42], [43]. Deretter spektra ble interpolert i 900-1800 cm
-1 rekkevidde og vektor normalisert. Analyse av pre-behandlet spektra ble utført ved hjelp av PCA (prinsipal komponent analyse) algoritmer implementert i MATLAB (Mathwork Inc.) basert intern programvare [44]. PCA er uten tilsyn data oversikt verktøy som brukes til å se på forskjeller og likheter mellom spektrene. Denne metoden avslører utliggere, grupper og trender i dataene. Den beskriver data variansen ved å identifisere et nytt sett av ortogonale funksjoner, disse er kjent som masse faktor eller hovedkomponenter (PC) (p 0,05). Hovedkomponentene er lineære kombinasjoner av originale datavariabler. Som denne studien er en utforskende studie derfor vi har utført PCA analysemetode og også brukt denne metoden i våre tidligere
in vitro
studier på cellelinjer [35], [36].
Midlere og differanse spektra ble beregnet for forskjellige cellepopulasjoner og ble anvendt for spektral sammenligning. De midlere spektrene ble beregnet fra den bakgrunn subtrahert spektra før derivatisering ved å ta gjennomsnittet Y-aksen variasjoner og holde på X-aksen konstant for hver klasse. Den baseline korreksjon ble utført ved å montere en 5
th ordens funksjon. Disse baseline korrigert spektra ble brukt for spektrale sammenligninger på tvers av alle grupper. Forskjellen spektra ble generert ved å trekke gjennomsnitts spektra av radioresistant celler (50Gy-UPCI: SCC029B 70 Gy-UPCI: SCC029B) med foreldre celler (UPCI: SCC029B) samt ved å trekke spektra av 50Gy-UPCI: SCC029B fra 70 Gy-UPCI .: SCC029B celler
Statistical Analysis
data ble statistisk analysert ved enveis ANOVA og t-test, ved hjelp av Graph Pad Prism 5-programvaren (versjon 5.01). En p-verdi mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Den statistiske analysen brukes til Raman spektra behandling er beskrevet under de respektive avsnitt.
Diskusjon
a) Utvikling og validering av Radioresistant underlinjer
De strålebehandling protokoller for kreft i munnhulen
Resultater og behandling består av en total 50Gy til 70 Gy stråledose vide lav dose fraksjonert stråling av 2Gy. Derfor to radioresistant underlinjer dvs. 50Gy-UPCI: SCC029B og 70 Gy-UPCI: ble SCC029B etablert av totalt 25 og 35 fraksjoner av 2Gy henholdsvis over en periode på 5-6 måneder. Den radioresistant karakter av underlinjer ble demonstrert ved klonogene celleoverlevelsesanalyse. Vi har observert betydelig økning i celleoverlevelse for begge de radioresistant underlinjer i forhold til dets parentale cellelinje av klonogene assay [Fig-1 (A)]. D0 doser for foreldre, 50Gy og 70 Gy underlinjen ble beregnet og funnet å være henholdsvis 4.5Gy, 5.1Gy og 5.6Gy. En økning i D0 verdi for radioresistant underlinjer fra sin foreldrecellelinje viser sine ervervet radioresistance karakter. Vi har også bestemt status for kjente radioresistant og anti-apoptotiske proteinmarkører som Bcl-2 (B-celle lymfom-2), Mcl-1 (myeloid celle leukemi-1), Survivin Cox-2 (syklooksygenase-2) ved western blotting. Som illustrert i Fig-1 (B) en økning i nivåene av disse proteiner ble observert i radioresistant underlinjer (unntatt Mcl-1 i 50Gy-UPCI: SCC029B) sammenlignet med foreldrecellelinje. MCL-1-nivåer i den mellomliggende 50Gy-UPCI: SCC029B sublinje var selv om sammenlignbare (densitometri analyse, fig-1B, lavere) som i opphavelige cellelinje og ble funnet å være mer signifikant oppregulert i radioresistant 70 Gy: UPCI-SCC029B sublinje . Det er bemerkelsesverdig at Mcl-en har kort halveringstid på grunn av sin raske omsetningen gjennom ubiquitinering [45], og selv om Mcl-en cellestabilitet mot ulike stressfaktorer har blitt studert, men lite er kjent om dens reguleringsmekanisme på grunn av strålebehandling. Vår resultat muligens innebærer at reaksjonsveier inkludert Bcl-2, Survivin og Cox-2 kan bidra til økt overlevelse for radioresistant cellene ved tidlige stadier av ervervet radioresistance utvikling mens Mcl-en kan ha en rolle i senere trinn. Dessuten, som nevnt i klonogene celleoverlevelse assay den 50Gy-UPCI: SCC029B celler anskaffet radioresistance karakter og høyere nivåer av andre radioresistance relaterte proteiner i forhold til de parentale celler. Derfor er utvikling av radioresistance er et komplekst fenomen som ikke kan være forbundet med en enkelt markør eller protein inne i cellen. Den betydelige økningen i uttrykket av disse markørene bekrefter med tidligere rapporter, inkludert de fra vårt laboratorium på deres tilknytning til radioresistance i muntlig plateepitelkarsinom [13], [18] – [20], [46] -. [47]
b) Morfologisk Karakterisering av radioresistant underlinjer
Vi har observert endret morfologi radioresistant underlinjer i forhold til sin foreldrecellelinje. De 50Gy-UPCI: SCC029B celler oppviste spindelformet morfologi, mens 70 Gy-UPCI: SCC029B celler ble funnet å være mer langstrakt og uregelmessig i form [Fig-2 (A)]. Gevinsten av disse morfologiske funksjoner i radioresistant underlinjer kan hint mot sin forvandlet karakteristikk knyttet til migrasjon og invasjon. Videre, for å få et innblikk i sin aktin reorganisering; vi har utført trådformede Actin (F-Actin) flekker i foreldre, 50Gy og 70 Gy UPCI: SCC029B celler. F-aktin-farging viste signifikant økning [Fig-2 (B)] i antall filopodia i 50Gy (p 0,01) og 70 Gy-UPCI: SCC029B (p 0,001) celler i forhold til sperre UPCI: SCC029B celler. De morfologiske endringer utstilt ved radioresistant celler kan være en ekstra fenotype ervervet grunn av kontinuerlig fraksjonert strålebehandling.
c) Raman spektroskopi av Parental og Radioresistant underlinjer
Gjennomsnittlig normalisert spektra for foreldre UPCI : SCC029B cellelinje, radioresistant 50Gy og 70 Gy-UPCI: SCC029B underlinjer ble beregnet og vist i figur-3. Midlere spektrum har vært brukt som et representativt spektrum for de respektive cellelinjer i spektralanalyse. Som, illustrert i figur-3, ble den spektrale egenskaper dominert av bånd rundt 1008 (fenylalanin), 1270 (amid III), 1450 (δ CH
2) og 1660 (amid I) cm
-1 og kanskje føres til cellulære proteiner. Mens band på 1310 (CH
3 /CH
2) vridning eller bøying måter lipid), 1340 (ring struktur av adenin) og 1378 cm
-1 (ring pustemoduser nukleinsyre) foreslår tilstedeværelsen av cellulær nukleinsyre og lipider. De gjennomsnittlige spektra for 50Gy-UPCI: SCC029B celler [Fig-3 (B)] viste skifte rundt 1310, 1450 og 1660 cm
1; mens en fremtredende topp ble observert ved 1550 cm
-1 (tryptofan). Tilsvarende i gjennomsnittlig spektra av radioresistant 70 Gy-UPCI: SCC029B celler [Fig-3 (C)] intensitetsrelaterte variasjoner på 1270, 1310, 1340 og 1660 cm
-1 mens et skifte på 1450 cm
-1 var observert. Således kan det observeres at generelle forskjeller i form av endringer i Raman-bånd og intensitetsvariasjoner ble observert i gjennomsnitt spektra av både 50Gy og 70 Gy grupper
For å kunne hente ut spektrale forskjeller mellom gruppene.; forskjellen spektra ble beregnet fra gjennomsnitts spektra. Forskjellen spektra gi en mer klar illustrasjon for forskjellene mellom gruppene. Som vist i fig-4, ble forskjellen spektra beregnet for 50Gy-UPCI: SCC029B og 70 Gy-UPCI: SCC029B celler ved å trekke dem fra foreldre UPCI: SCC029B celler [Fig-4 (A, B)], og mellom de to radioresistant cellene [fig-4 (C)]. Forskjellen spektrum (50Gy – foreldre) viste positive topper på 1008, 1340, 1378, 1450, 1550, 1664 cm
-1 og negative topper på 1240 og 1310 cm
1; foreslå endringer i proteiner og nukleinsyrer, muligens på grunn av endrede cellesignalering kaskader forårsaket ved bestråling [48]. Den merkbare endringer i 1550 cm
-1 i 50Gy celler er indikativ for fritt tilgjengelig tryptofan muligens som et resultat av proteinfolding /uriktig folding av aktiverte anstand på grunn av stråling stress. Tilsvarende, i forskjell spektrum (70 Gy – foreldre) positive topper ble observert ved 1340 og 1378 cm
-1 som er assosiert med DNA, mens negativ topp ble observert ved 1240, 1450 og 1650 cm
-1 forbundet med protein endring
Som vist av klonogene analyse, både 50Gy-UPCI. SCC029B og 70 Gy-UPCI: SCC029B cellene har kjøpt radioresistant karakter i forhold til foreldre celler. Også 70 Gy cellene er relativt mer radioresistant enn 50Gy celler og viser tydelig forskjell spektra, som kan skyldes ulike egenskaper kjøpt opp av dem. Videre (50Gy-70 Gy) forskjell spekteret viser positive topper på 1008, 1450, 1550 og 1664 cm
-1 alle relatert til proteiner mens DNA relatert negativ peak ble observert ved 1378 cm
1. Tilstedeværelsen av fremtredende positive tryptofan peak (1550cm
-1) i 50Gy radioresistant underlinjen hint mot beriket tryptofan grupper som kan ha anti-oksidativ eiendom på grunn av indolic gruppe som fungerer som hydrogen radikal donor [49]. Siden, ioniserende stråling kan indusere (ROS) produksjon reaktive oksygenforbindelser som kan føre til endogent angrep på deoksyribosyl-ryggraden i DNA [50], [51]. For å motvirke effekten av ROS, celler har flere antioksidanter faktorer som kan skattekart ROS og beskytter mot stråling [52]. Den distinkte tryptofan rester topp i 50Gy radioresistant celler kan relatere til slike faktorer som er rike på disse rest typer som beskytter cellen mot oksidativt stress. Oppregulering av disse faktorer har også blitt rapportert i forbindelse med radioresistance [53] – [55]. Videre kan den registrerte spektrum gjennomsnittelig og representative spektrum av den gitte cellelinje som gjenspeiler en samlet informasjon av cellen status; fordi i en cellepellet, møter sonderings strålen en stabel av celler og spredning kan forventes fra forskjellige organeller som kjernen, mitokondrier og andre cellulære rom.
d) Multivariate Analysis
Som nevnt ovenfor , PCA ble brukt til å utforske mulighetene for klassifisering blant radioresistant 50Gy og 70 Gy underlinjer fra foreldrenes cellelinje. PCA er ofte brukt metode for datakomprimering og visualisering for å observere mønsteret i dataene. Det er en matematisk analyse av hvilke funksjoner i hele datasettet med tusenvis av punktene er løst inn noen signifikante egenvektorene som kan uttrykke hele datasettet med sin score for hvert spektrum. Dette kan gi avgjørende ledetråder om biokjemiske variasjoner mellom ulike grupper, i vårt tilfelle ulike klasser av makromolekyler. Videre kan profiler av hovedkomponentene også er kjent som faktor ladninger tilveiebringe viktige spor på biokjemiske variasjoner mellom forskjellige klasser. Lasting av faktorene 1, 2 og 3 som fører til avgrensning mellom gruppene er vist i figur 5 (A). Konform spektral variasjon som foreslått av forskjell spektra; laste tomter viser også forskjeller i DNA-innhold, aminosyrer og protein profiler av foreldre og radioresistant grupper. For visuell diskriminering, anslår vi hver av spekteret i den nydannede koordinere plass av utvalgte PCer. De første tre betydelige diskriminerende PC ble valgt for tredimensjonal visualisering av dataene. Tre klynger som tilhører foreldre UPCI: SCC029B celler og radioresistant 50Gy- UPCI: SCC029B, 70 Gy-UPCI: SCC029B celler ble observert [Fig-5 (B)]. Mens 50Gy-UPCI: SCC029B celler dannet en egen klynge men liten overlapping mellom klynger av 70 Gy-UPCI: SCC029B og foreldre celler ble observert. Dette mønster gruppering kan skyldes generell forskjellige biokjemiske profil som resultat av celletypene. Tar i betraktning at PCA vil avdekke en samlet endring inkludert de ulike cellulære profiler, indikerer det at radioresistant cellene har kjøpt en endret molekyl profil forskjellig fra sine foreldre celler med subtile variasjoner.
Konklusjon
I dette arbeidet har vi etablert radioresistant underlinjer fra foreldre oral buccalslimhinnen cellelinje ved hjelp av klinisk tillatelig fraksjonert stråledose. Den kjøpte resistente karakter ble bestemt ved standard klonogene celleoverlevelse assay. Den 50Gy-UPCI: SCC029B og 70 Gy-UPCI: SCC029B etablert radioresistant underlinjer ble funnet å være mer radioresistant i forhold til sin foreldre UPCI: SCC029B cellelinje. De underlinjer ble også preget av å vurdere uttrykk for radioresistance relatert protein markører som Mcl-en, Bcl-2, Cox-2 og Survivin som støtter deres ervervet radioresistant fenotype. Endrede morfologiske funksjoner ble observert i disse langsiktige bestrålte celler som var forskjellig fra foreldrecellene, inkludert betydelig økning i filopodia tall i 50Gy-UPCI: SCC029B celler og 70 Gy-UPCI: SCC029B radioresistant celler. Videre ble Raman-spektroskopi utført på følgende radioresistant celler og parentale celler for å studere deres differensial spektrale profilen. Denne studien er første i sitt slag om nytten av RS i karakterisering av ervervede radioresistant underlinjer. Den observerte differensial spektra mellom foreldre og begge radioresistant cellene majorly grunn av endringer i DNA, lipid- og proteinprofilen av celler. Endringer i DNA innhold av disse cellene kan være på grunn av tallrike genetiske fornærmelser forekommende gjennom flere fraksjoner av stråling av FIR og endring av lipider kan være hovedsakelig på grunn av endret morfologien av disse cellene, som vist ovenfor. Den multivariate analyser ved hjelp av PCA avdekket at radioresistant 50Gy-UPCI: SCC029B og 70 Gy-UPCI: SCC029B celler kan kategoriseres fra sine foreldre UPCI: SCC029B celler. Til sammen resultatene av vårt arbeid er ganske lovende og antyder muligheten for RS som en potensiell ikke-invasiv verktøy for orale kreftpasienter i å forutsi stråling respons gjennom spektrale markører. Det kan forbedre pasientens overlevelse i kraft av optisk diagnostikk å kategorisere dem i radiosensitive og resistente typer;
