Abstract
Bakgrunn
Slettede leverkreft 1 (DLC1) fungerer som en viktig RhoGTPase aktiverer protein (RhoGAP) protein som avslutter aktiv RhoA signalering i kreft hos mennesker. Økende bevis har vist at den tumorundertrykkende aktivitet av DLC1 avhenger ikke bare av RhoGAP aktivitet, men også er avhengig av riktig fokal adhesjon lokalisering gjennom dets interaksjon med tensin familieproteiner. Nylig er det rapporter som viser at DLC1 kan også bli funnet i kjernen; Men eksistensen og den relative svulst undertrykkende aktivitet av atom DLC1 har aldri vært tydelig adressert.
Metodikk og hovedfunnene
Vi gir her et nytt bevis på at DLC1 protein, som hovedsakelig assosiert med brennvoksn og lokalisert i cytosol, dynamisk skytteltrafikk mellom cytoplasma og cellekjernen. Behandling av celler med kjernefysisk eksport blocker, Leptomycin B (LMB), beholdt DLC1 i kjernen. For å forstå den kjernefysiske oppføring av DLC1 identifiserte vi aminosyrer 600-700 av DLC1 som en roman region som er viktig for landets atom lokalisering. Svulsten undertrykkende aktivitet av atom DLC1 ble direkte vurdert ved å ansette en kjernefysiske lokalisering signal (NLS) fusion variant av DLC1 (NLS-DLC1) med fortrinnsrett kjernefysiske lokalisering. I SMMC-7721 HCC celler, uttrykk for NLS-DLC1 klarte å undertrykke kolonidannelse og aktin stresset fiberdannelse
in vitro
. Den avskaffet svulst undertrykkende aktivitet av atom DLC1 ble demonstrert for første gang
in vivo
av subkutant sprøyte p53
– /- RasV12 hepatoblasts med stabil NLS-DLC1 uttrykk i nakne mus. De injiserte hepatoblasts med NLS-DLC1 uttrykk effektivt dannes svulster sammenlignet med ikke-kjernefysiske målrettet DLC1.
Konklusjon /Betydning
Vår studie identifisert en ny region ansvarlig for atom oppføring av DLC1 og demonstrert den funksjonelle forskjellen på DLC1 i ulike cellulære avdelinger både
in vitro Hotell og
in vivo
Citation. Chan LK, Ko FCF, Sze KM-F, Ng IO -L, Yam JWP (2011) Nuclear-målrettet Slettet i Liver Cancer 1 (DLC1) er mindre effektiv i å anstrenge Dens Tumor undertrykkende aktivitet Begge
in vitro Hotell og
in Vivo
. PLoS ONE 6 (9): e25547. doi: 10,1371 /journal.pone.0025547
Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA
mottatt: 07.06.2011; Godkjent: 06.09.2011; Publisert: 26.09.2011
Copyright: © 2011 Chan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Hong Kong Stipend Council (HKU7798 /07m), Hong Kong Stipend Rådet Collaborative Research Fund (HKU 1 /06C og HKU 7 /CRG /09) og Outstanding Young Forsker Award (til JWP Yam). I.O.L. Ng er Loke Yew professor i patologi. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
slettede i leverkreft 1 (DLC1) ble først klonet ved subtraktiv hybridisering som et gen fragment som ofte ble slettet i menneskelig leverkreft (HCC) [1]. Samle bevis i det siste tiåret har støttet at DLC1 er underexpressed i ulike typer kreft hos mennesker foruten HCC [2], [3], [4], [5], [6], [7]. Restaurering av DLC1 ved ektopisk uttrykk i celler med lav eller ingen endogen uttrykk for DLC1 forsinker celleproliferasjon, induserer apoptose, bremser ned celle bevegelse og går i oppløsning aktin cytoskeletal struktur
in vitro product: [8], [9], [10 ]. Omvendt, fremmer DLC1 knockdown tumorigenesis av en Myc drevet
in vivo
mus hepatocarcinogenesis modell med en p53 null bakgrunn [11]. Naturen av hyppige patologisk underexpression av DLC1 og robust eksperimentelle tumorundertrykkende aktivitet både sterkt støtte DLC1 fungerer som en
bona fide
tumor suppressor.
Svulsten undertrykkende aktivitet DLC1 er tett knyttet til sin iboende RhoGAP aktivitet, som nedregulerer Rho-medierte biologiske respons. DLC1 har blitt funnet å være RhoA-, B-, C- og CDC42-spesifikk [12], [13]. Fokal adhesjon lokalisering gjennom interaksjon med tensin familie protein er en av karakteristikkene av DLC1 og er funksjonelt forbundet med den tumorundertrykkende aktivitet. Dette ble støttet av bevis for at DLC1 mutant med intakt RhoGAP domene, men ikke klarte å være rettet mot brennvoksn utstilt redusert vekst undertrykkende aktivitet
in vitro product: [10], [14]. Siden midt adhesjonen rettet mot sidene i DLC1 overlapper med den tensin-protein-bindingssetet, er det blitt akseptert at DLC1 par med tensin og fungerer som tumorundertrykkende kompleks i terminer det sentrale klebe forbundet Rho-aktivitet [10], [14], [15 ].
En fersk studie har antydet nærvær av basiske rester rik motiv i DLC1 likner NLS [16]. Likeledes har det blitt foreslått at serin /treonin spesifikk proteinkinase fosforylerer D DLC1 for å skape en forankrings 14-3-3 område. kompleksdannelse med 14-3-3 sequesters DLC1 i cytoplasma og stopper sitt atom oppføring [17]. Men eksistensen og regulering av atom DLC1 ikke blitt grundig undersøkt. Viktigst, den relative tumorundertrykkende aktivitet av kjerne DLC1 har aldri vært direkte adressert. I denne studien har vi gitt omfattende bevis for at DLC1 protein stadig skyttelbussene mellom cytoplasma og kjernen. Vi har utført den første funksjonelle karakterisering av kjernefysisk målrettet DLC1 å undersøke dens grunnleggende og tumorundertrykkende aktivitet både
in vitro Hotell og
in vivo
. Ved å studere subcellulære lokalisering av ulike DLC1 mutanter, har vi identifisert en ny region i RhoGAP domene som er viktig og tilstrekkelig for kjernekraft import.
Resultater
DLC1 skytteltrafikk mellom cytoplasma og cellekjernen
uttrykk for Myc-merket DLC1 (Myc-DLC1) i SMMC-7721-celler viste sin eksistens i fokale sammenvoksninger, cytoplasma og cellekjernen (fig. 1a). Kvantitativ undersøkelse av DLC1 uttrykk i cellene viste sin dominerende cytoplasma lokalisering med punktat fokus vedheft mønster på celle periferien. For å utforske bevegelsen av DLC1 mellom cytoplasma og cellekjernen, ble Myc-DLC1 lokalisering i celler studert i celler behandlet med exportin blocker, LMB. Behandling med LMB resulterte i den kjernefysiske oppbevaring av Myc-DLC1 i SMMC-7721 og BEL7402 celler (Fig. 1B,
venstre panel
). Spesielt, fokal adhesjon lokalisert DLC1 ble fortsatt observert, impliserer bare den ikke-fokal adhesjon lokalisert DLC1 ble transportert og holdt tilbake i kjernen. Cellular fraksjone ytterligere bekreftet tilstedeværelsen av DLC1 i den kjernefysiske brøkdel av cellelysat (Fig. 1B,
høyre panel
). Lignende observasjoner ble oppnådd med GFP-merket DLC1 (GFP-DLC1) (data ikke vist). Den dynamiske bevegelse av DLC1 ble observert under tilbaketrekning av LMB ved forskjellige tidspunkter (fig. 1C). Re-mønster av cytoplasma og fokal heft ble forekommet i løpet av 24 timer. Vi har utvidet vår etterforskning ved å undersøke lokalisering av endogene DLC1 i ulike cellelinjer. Subcellulære fraksjonering av Hep3B, HLE og SK-Hep1-celler, fulgt av immunoblotting ved å bruke DLC1-spesifikt antistoff støtter nærværet av DLC1 i kjernen (fig. 1D). Immunfluorescens for endogen DLC1 i SK-Hep1 celler viste lignende subcellulære lokalisering i cytoplasma og cellekjernen (Fig. 1E). Konsekvent, ble endogen DLC1 i Hep3B beholdt i kjernen etter LMB behandling (Fig. 1F). For å støtte ideen om at DLC1 skyttel mellom cytoplasma og cellekjernen under fysiologiske tilstand, vi utført immunhistokjemi mot DLC1 på en human ikke-neoplastisk leveren (Fig. 1G). Positive DLC1 farging ble påvist både i cytoplasma og cellekjernen, noe som ytterligere støtter som DLC1 er til stede i kjernen.
(A) SMMC-7721-celler ble transient transfektert med Myc-tagged DLC1. DLC1 ble visualisert med anti-myc antistoff, etterfulgt av FITC-konjugert sekundært antistoff. Nucleus ble kontra med DAPI. Subcellulære lokalisering mønster av DLC1 av 241 DLC1 transfekterte celler ble talt opp og kategorisert i gruppe A til E som angitt. (B) SMMC-7721 og BEL7402 celler ble transient transfektert med Myc-merket DLC1 og utsatt for LMB behandling etterfulgt av immunfluorescens farging med anti-myc antistoff (
venstre panel
). De transfekterte celler ble fraksjonert i cytoplasma og kjernefysiske deler etterfulgt av immunoblotting mot Myc for eksogene DLC1, tubulin (cytoplasma markør), LaminB og c-jun (atom markør) (
høyre panel
). (C) SMMC-7721-celler ble transient transfektert med Myc-tagged DLC1, etterfulgt av LMB behandling i 6 timer. Etter LMB behandling (som ble betegnet som t = 0), ble cellene dyrket med friskt medium og ble fiksert på det angitte tidspunkt. Eksogent DLC1 ble visualisert ved hjelp av anti-myc antistoff. (D) Hep3B, HLE celler og SK-Hep1 celler ble fraksjonert i cytoplasma og kjernefysiske deler etterfulgt av immunoblotting bruker antistoffer mot endogen DLC1, tubulin, LaminB og c-juni (E) Endogen DLC1 i SK-Hep1-celler ble visualisert ved hjelp av polyklonalt anti-DLC1 antistoff, etterfulgt av FITC-konjugert sekundært antistoff. Å tjene som en negativ kontroll, ble SMMC-7721 celler uten DLC1 uttrykk farget med polycloncal anti-DLC1 antistoff. Den DLC1 antistoff bare kunne oppdage signalet i SMMC-7721 celler med eksogent DLC1 overekspresjon men ikke de ikke-transfekterte celler. (F) Hep3B celler ble behandlet med LMB i 6 timer. Endogen DLC1 ble deretter visualisert ved hjelp av polyklonalt anti-DLC1 antistoff, etterfulgt av FITC-konjugert sekundært antistoff. (G) En del av menneskets ikke-neoplastisk leveren ble immunostained for DLC1 (Brown). Kjernene ble kontra av hematoksylin (blå). Celler som viser positiv atom DLC1 farging ble vist med heltrukne-ledet piler. Cellekjernen som viser negativ DLC1 farging ble indikert av de tomme-ledet piler. Skala:. 10 mikrometer
DLC1 600-700 rester samarbeidet med NLS i reguleringen av DLC1 atom oppføring
Proteiner av høy molekylstørrelsen besitter kjernefysiske transport signaler for aktiv transport over kjernefysisk konvolutt med hjelp av kjernefysiske transport kompleks. Det er foreslått at en monopartite NLS (423-431) [17] og bipartite NLS (415-431) [16] er til stede i DLC1 som letter den kjernefysiske oppføring av DLC1. For å konkret adresse lokalisering av DLC1 uten de foreslåtte NLS ved LMB behandling, bygget vi DLC1Δ415-431 mutant spesifikt mangler den foreslåtte NLS (fig. S1 A og S1B). Uttrykk av DLC1Δ415-431 i SMMC-7721 celler viste samme subcellulære lokalisering som villtype DLC1. Overraskende, DLC1Δ415-431 var fortsatt følsomme for LMB behandling og ble beholdt i kjernen så effektivt som villtype DLC1 (fig. S1C). Det har også blitt rapportert at fosforylering ved serin-431 (S431) av DLC1 av proteinkinase D (PKD) [17] letter binding mellom DLC1 og 14-3-3-proteiner, og dermed hindre nukleær oppføring av DLC1. Men vi fant ut at DLC1 S431 fosfor-defekt mutant, S431A viste tilsvarende grad av kjernefysisk oppbevaring etter LMB behandling (Fig. S1D). Til sammen kan vi ikke gi tilstrekkelig bevis for å støtte funksjonaliteten til den foreslåtte NLS samt rollen S431 fosforylering i regulering av kjernefysiske transport av DLC1.
Vi spurte om, bortsett fra atom rettet mot motivet foreslo av de andre, er ekstra regionen i DLC1 involvert i kjernefysiske lokalisering av DLC1. For å løse dette, vi klonet og uttrykt GFP-DLC1 delesjonsmutanter og undersøkt deres lokalisering etter LMB behandling i HeLa-celler (fig. 2A). Vi fant at DLC1 Δ292-646 intern delesjonsmutant viste en signifikant reduksjon av nukleære lokaliserings på LMB behandling (Fig. 2B og 2C). På den annen side ble atom retensjon av DLC1 1-807 C-terminal delesjonsmutant ikke påvirket sammenlignet med villtype DLC1 på LMB behandling. Interessant, 1-807 mutant som inneholdt den foreslåtte samlings vedheft målretting region (region 200-500) [18] ble ikke effektivt målrettet mot brennvoksninger og diffust uttrykt i cytoplasma.
(A) viser skjematisk strukturen av villtype DLC1 (DLC1 WT) og dets delesjonsmutanter (Δ292-646 og 1-807). (B) HeLa-celler ble transient transfektert med GFP-merket DLC1 ekspresjonskonstruksjoner som angitt i (A), etterfulgt av behandling LMB. Focal voksn ble kontra med anti-vinculin antistoff. Den subcellulære lokalisering av DLC1 ble registrert ved å telle minst 100 transfekterte celler per prøve. (C) av søylediagram som oppsummerer den subcellulære lokalisering av DLC1 og dens mutanter i (B) med eller uten den LMB behandling. Resultatene representerer et duplikat av to uavhengige eksperimenter. Prosentene av brennvidde heft positiv DLC1 i enkelte gruppe ble også fremhevet.
Det er foreslått at den N-terminale regionen DLC1 regulerer negativt sitt atom oppføring [16]. En rekke potensielle atom eksport signal (NES) er kartlagt på 62-71, 764-773 og 792-801 rester av DLC1 av
i silico
søk (Fig. S2A). Betydningen av disse signalsekvenser for å regulere det cytoplasmatiske lokaliseringen ble så vurdert ved immunofluorescens. Funksjonaliteten til NES på 764-773 og 792-801 rester ble ekskludert av det cytoplasmatiske uttrykk for 1-291 og 1-400 mutanter (Fig. S2B). Siden 609-stop og 648-839 mutanter vises forbedret kjernefysiske lokalisering, ble rollen til NES på 62-71 rester videre analysert ved å opprette en DLC1 Δ62-71 mutant. Dette DLC1 mutant viste karakteristiske fokal adhesjon lokalisering i likhet med vill-type, uten å vise noen økning i kjerneansamling (fig. S2B). For å klargjøre fravær av kjernefysisk oppbevaring var ikke på grunn av den sterke fokus vedheft forening, DLC1 1-807Δ62-71, en mutant ikke klarte å lokalisere på brennvoksninger ble uttrykt. Men denne mutant ble også funnet å være hovedsakelig er lokalisert i cytoplasma. Til sammen fant vi at fjerning av de forut NES på N-terminalen av DLC1 ikke påvirke nucleocytoplasmic distribusjon.
Etter å synliggjøre atom rettet mot regionen til sentrum regionen DLC1, vi utførte den første detaljerte lokalisering analyse av et panel av GFP-DLC1 mutanter (fig. 3A). Interessant, fant vi at uttrykket av 350-807 mutant viste en dominerende kjernefysiske lokalisering. Ligner fremtredende kjernefysiske lokalisering ble sett i Myc-DLC1 291-807 (data ikke vist). Undersøkelse av 600-807 mutant viste lignende nukleære lokaliserings, mens 700-807 mutant lokalisert både i cytoplasma og cellekjernen i HeLa-celler (fig. 3B og 3C). Økt nukleær lokalisering av 600-807 mutant ble også understøttet av den sterkeste DLC1 uttrykk i den nukleære fraksjonen oppnådd i det biokjemiske fraksjone analysen sammenlignet med de andre DLC1 mutanter (Fig. 3D). Til sammen fant vi at DLC1 regionen 600-700 i RhoGAP domenet ble også involvert i atom oppføring av DLC1.
(A) Skjematisk diagram som viser strukturen av et panel av DLC1 fragmenter avsluttet ved aminosyre 807 og en serie av DLC1 interne delesjonsmutanter for å kartlegge de viktigste atom målretting området. Strukturene av hvete DLC1 og Δ292-646 ble også oppført for sammenligning. (B) HeLa-celler ble transient transfektert med GFP-merket DLC1 ekspresjonskonstruksjoner indikert. Focal voksn ble kontra med anti-vinculin antistoff. Den subcellulære lokalisering av DLC1 ble registrert ved å telle minst 100 transfekterte celler per prøve. (C) Søylediagrammets oppsummerer prosentandelen av celler med cytoplasmisk og nukleære lokaliserings av DLC1 og dens mutanter i (B). Resultatene representerer et duplikat av to uavhengige eksperimenter. (D) HeLa-celler ble transient transfektert med de indikerte GFP-merket DLC1 ekspresjonskonstruksjoner fulgt av subcellulære fraksjonering. Den fraksjon cytoplasmatiske og kjernefysiske lysatene ble utsatt for immunblotting med antistoffer mot GFP, tubulin (cytoplasma markør) og c-jun (kjernefysisk markør). (E) HeLa-celler ble transient transfektert med de indikerte GFP-merket DLC1 ekspresjonskonstruksjoner, etterfulgt av behandling LMB. (E) Søylediagrammets oppsummerer prosentandelen av celler med cytoplasmisk og nukleære lokaliserings av DLC1 og dens mutanter i (D). Resultatene representerer et duplikat av to uavhengige eksperimenter. Skala:. 10 mikrometer
For ytterligere å bekrefte betydningen av denne romanen regionen, slettet vi region 601-689 i DLC1 og vurdert sin lokalisering. Interessant, fant vi en markert reduksjon i kjernefysiske lokalisering av DLC1Δ601-689 mutant etter LMB behandling (Fig. 3E og 3F). Som demonstrert av Δ415-431Δ601-689 mutant der tidligere rapportert NLS og vår kartlagt området ble slettet, sletting av 415-431 ikke ytterligere redusert atom oppbevaring mye etter LMB behandling. Våre resultater antydet at de tildelte romanen nettstedet spiller en betydelig rolle i målretting DLC1 inn i kjernen.
Nuclear DLC1 mistet sin hemmende aktivitet i å undertrykke kolonidannelse og aktin stresset fiberdannelse
in vitro
til dags dato er det ingen studie direkte funksjonell sammenheng mellom kjernefysiske lokalisering og den biologiske funksjonen til DLC1. For å måle funksjonsevne atom DLC1
in vitro
, vi laget og bekreftet uttrykk for en kjernefysisk målrettet DLC1 (NLS-DLC1) (Fig. 4A og 4B). Ved immunfluorescens, fikk vi bekreftet at NLS-DLC1 ble hovedsakelig er lokalisert i kjernen i SMMC-7721 celler. En NLS-drevet DLC1 RhoGAP mutant, NLS-K714E kan også være rettet mot kjernen så effektivt som villtype DLC1 (fig. 4C). Vi deretter undersøkt integriteten til aktin spennings fibre i SMMC-7721 celler forbigående transfekterte av disse mutanter. I motsetning til demontering av aktin spennings fibrene i DLC1 transfekterte cellene, kunne NLS-DLC1 bare delvis undertrykker den aktin-spenning fiberdannelse (Fig. 4D). Som en negativ kontroll ble cellene transfektert med DLC1 K714E viste intakte actin spennings fibre. Lignende mønster ble observert i celler som uttrykker NLS-K714E ytterligere støtte som vår kjernefysiske targeting system ikke utøve uspesifikk effekt på aktin stresset fiber formasjon. RhoGAP aktivitet av DLC1 har vist seg å være tett forbundet med sin vekst undertrykkende aktivitet. Vi utførte kolonidannelse analyse for å vurdere
in vitro
vekst undertrykkende aktivitet av NLS-DLC1 i både SMMC-7721 og HeLa-celler (data ikke vist). I samsvar med virkning på spenning fiberdannelse, NLS-DLC1 viste i stor grad redusert vekstundertrykkende aktivitet sammenlignet med DLC1 (fig. 4E) Tar sammen, har vi funnet at atom DLC1 mistet evnen til å undertrykke cellevekst.
( A) Skjematisk diagram som viser strukturen av kjerne målrettede DLC1 (NLS-DLC1) anvendt for forbigående ekspresjon eksperiment. DNA-sekvensen som koder for NLS monopartite som består av fem grunnleggende aminosyrer KKKRK ble innsatt foran den åpne leseramme av Myc-tagged DLC1. Oversettelse av manipulert uttrykket konstruere kodet Myc-merket NLS-DLC1. (B) HEK293T lysatene med uttrykt Myc-merket DLC1 eller NLS-DLC1 ble immunoblottet med anti-myc antistoffet. (C) SMMC-7721-celler ble transient transfektert med de indikerte villtype DLC1 eller RhoGAP mutant (K714E) konstruksjoner. Den Myc-merket protein ble visualisert ved hjelp av anti-myc antistoff, etterfulgt av FITC-konjugert sekundært antistoff. Den subcellulære lokalisering av DLC1 ble registrert ved å telle minst 100 transfekterte celler per hver prøve. Søylediagram viser prosentandelen av celler med atom DLC1 farging. Resultatene representerer et duplikat av to uavhengige eksperimenter. (D) SMMC-7721-celler ble transient transfektert med de indikerte Myc-merket DLC1 konstruksjoner og aktin spennings fibrene ble farget med TRITC-konjugert phalloidin en time etter at serumet induksjon. Stjernen (*) markerer DLC1-transfekterte celler. (E) stolpediagram som viser den relative kolonidannelse effektivitet av SMMC-7721-celler ble transfektert med de indikerte DLC1 konstruksjonene og pEGFP-C1 vektor som bærer neomycin resistent gen i forholdet 10:01. De transfekterte celler ble selektert med G418 i 2 uker. Koloniene som ble dannet ble visualisert ved krystallfiolett farging og kvantifisert. Gjennomsnittlig forskjell mellom den angitte gruppen ble funnet å være statistisk signifikant (***
P
0.005, uparet
t
-test). Skala: 10 mikrometer
Nuclear DLC1 ikke undertrykke
in vivo
tumorigenicity
For å vurdere svulsten undertrykkende aktivitet av atom DLC1
in vivo
utførte vi stabil retrovirale uttrykk for kjernefysisk målrettet Myc-merket mus DLC1 i en p53 null mus hepatoblasts med konstituerende RasV12 aktivering [11]. DLC1 var rettet til kjernen ved å sette inn en tandem gjentagelse av tre monopartite NLSs (NLS3) foran startkodonet av mus DLC1 i den retrovirale ekspresjonskonstruksjon (Fig. 5A). Etter seleksjon med puromycin ble de resistente kloner ekspanderes og over 95% resistente kloner ble funnet å være GFP positiv, noe som bekrefter den høye retroviral transduksjon effektivitet (fig. 5B). Vi har også bekreftet den vellykkede kjernefysiske målretting av mus DLC1 ved immunfluorescens farging for NLS3-DLC1 fusjonsprotein. Vi fant at over 90% av NLS3-DLC1 transduserte celler viste nukleær farging sammenlignet med cytoplasmatisk farge i DLC1 transduserte celler. Bakgrunnsfarging med anti-myc antistoffet var knapt synlig i vektor-celler (fig. 5B). Vi ytterligere bekreftet uttrykket nivå DLC1 proteiner ved immunoblotting (Fig. 5C). For ytterligere å bekrefte at eiendommen av nucleocytoplasmic skyt ble konservert i vår DLC1 overekspresjon hepatoblast modell, behandlet vi DLC1 uttrykke celler med LMB, etterfulgt av immunfluorescens. Vi fant at behandling med LMB kunne konsekvent beholde DLC1 i kjernen (Fig. 5D). Denne observasjonen støttes videre at nucleocytoplasmic skyt hotellet ble bevart i de menneskelige og mus DLC1 ortologer.
in vivo
tumorigenicity av disse stabile kloner ble undersøkt ved subkutan injeksjon i nakne mus. Konsekvent, oppviste DLC1 undertrykkelse effekt på tumordannelse, mens atom DLC1 viste en signifikant reduksjon i å undertrykke tumorgenisitet
in vivo plakater (fig. 5E og 5F).
(A) Skjematisk diagram som illustrerer den retrovirale vektorer som brukes til å drive stabil uttrykk for Myc-merket mus DLC1 og den atom målrettet mus DLC1 (NLS3-DLC1). (B) Hepatoblasts infisert med vektor, ble DLC1 eller NLS3-DLC1 retrovirus fast og uttrykk for Myc-merket protein ble visualisert ved anti-myc antistoffet fulgt av Texas Red-konjugert sekundært antistoff. (C) Lysates av infiserte hepatoblasts med vektor, DLC1 eller NLS3-DLC1 retrovirus ble utsatt for immunblotting ved hjelp av antistoffer mot Myc, DLC1 og GFP. β-actin ble servert som lasting kontroll. (D) Hepatoblasts infisert med DLC1 retrovirus ble utsatt for LMB behandling. Cellene ble deretter fiksert og lokalisering av Myc-tagged DLC1 ble visualisert ved hjelp av anti-myc antistoff, etterfulgt av Texas Red-konjugert sekundært antistoff. Søylediagram viser prosentandelen av celler med atom DLC1 farging. Resultatene representerer et duplikat av to uavhengige eksperimenter. (E) Den tumorigenicity av de angitte retroviral transduced hepatoblasts ble vurdert ved subkutan hårløse mus injeksjon. 1 x 10
5 hepatoblasts ble injisert subkutant på dag 0 og volumet av tumorstørrelsen ble overvåket daglig fra dag 4. Alle mus ble avlivet på dag 14. På dag 14 ble musene avlivet og tumorene ble dissekert. (F) De dissekerte tumorene ble veid og deres masser ble registrert. Skala:. 10 mikrometer
Det har blitt rapportert at ektopisk uttrykk for DLC1 i DLC1 negative celler kan indusere apoptose [19]. For å teste om NLS3-DLC1 utstilt differensial biologisk aktivitet i indusere apoptose, vi etablert og analysert HEK293T celler som stabilt uttrykker atom DLC1 av flowcytometri for subG1 cellepopulasjon (Fig. S3b). For å unngå enhver mulig klonal effekt, ble to kloner fra hver gruppe valgt for analysen. Vi fant at DLC1 uttrykkende celler viste en økt subG1 topp når sammenlignet med vektoren og de NLS3-DLC1 uttrykkende celler. DLC1 uttrykke celler viste også en redusert G1 men økt befolkning (Fig. S3b). Plausibel forklaring på dette kan være at DLC1 uttrykker cellene kan bruke lengre tid i S-fasen når de kommer inn i cellesyklus. Disse observasjonene igjen vist at NLS3-DLC1 var mindre robust i indusere apoptose og demping cellecyklusprogresjonen sammenlignet med villtype DLC1.
Diskusjoner
I silico
sekvensanalyse har avdekket en rekke potensielt basisk aminosyre rik todelte NLSs i DLC1 [16]. Tilstedeværelsen av disse motivene bedt oss å spørre om DLC1 eksisterer som en kjernefysisk protein. I denne studien viste vi at DLC1 var et protein kontinuerlig skytteltrafikk mellom cytoplasma og cellekjernen i forskjellige cellelinjer. Denne observasjonen gir en balansert forklaring på nærvær av atom DLC1 og støtter sin iboende cytoplasmisk lokalisering som vist ved forskjellige studier [10], [18], [20], [21], [22]. Det er bemerkelsesverdig at ved behandlingen med LMB, fokal adhesjon lokalisert DLC1 var fremdeles synlig. Denne observasjon antydet at kun ikke-spesifikk, cytoplasmatisk DLC1 ble beholdt i kjernen etter behandlingen. Focal vedheft lokalisert DLC1 var relativt statisk i naturen. Denne observasjonen er kompatibel med den partielle nukleær farging observert for DLC1 fokal adhesjon lokalisering defekt mutant, Y442F i en celle lunge modell [10]. Selv om positiv atom flekker kan bli funnet i normal ikke-neoplastisk lever i immunhistokjemisk farging, ville det være interessant å observere om det er en identifiserbar forskjell på atom DLC1 flekker mellom normal leveren vev og DLC1-positive HCCs (eller andre krefttyper).
Selv om nærværet av atom DLC1 tidligere er blitt diskutert, er det tumorundertrykkende aktivitet i kjernen er ikke fullstendig klar adressert. For direkte å undersøke tumorundertrykkende aktivitet av atom DLC1, vi forbigående eller stabilt uttrykt NLS-DLC1 i HCC cellelinjer, etterfulgt av en serie av funksjonell karakterisering. Vi brukte denne tilnærmingen i stedet for å studere DLC1 mutant mangler kartlagt kjernefysiske målretting signal (600-700 rester ble overlappet med RhoGAP domene) som vi spådde at fjerning dette signalet vil forstyrre dens iboende RhoGAP aktivitet og gjøre sammenligning med villtype DLC1 umulig . Også til langsiktig LMB behandling produsere kjernefysisk DLC1 er også ugunstig og den blokkerer globale atom protein eksport og utgjør stress til cellene [23]. Mens romanen funksjon av atom DLC1 gjenstår å bli utforsket, vi bekreftet at NLS-DLC1 var mindre effektiv i å undertrykke cellevekst, oppløsning RhoA-mediert aktin stresset fiber formasjon, og celledød
in vitro
. NLS-DLC1 var også mindre effektiv i å undertrykke tumorvekst i en mus xenograft modell. Vi spekulere atom mislocalization kan være en mulig mekanisme i abrogere DLC1 i menneskelig kreft med intakte DLC1 uttrykk.
Funksjonelt, våre funn er i strid med konklusjonen gjort av tidligere rapporter. Yuan et al. demonstrert kjernefysisk translokasjon av DLC1 kan indusere apoptose og lette tumor undertrykkende funksjon i en forbigående uttrykt DLC1 negative menneske ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) cellelinje modell [16]. Men vår stabile kjerne DLC1 uttrykk modell med muse hepatoblasts og menneskelig HEK293T celler verken mislyktes i å forbedre eller indusere apoptotisk sub-populasjon som indikert av flowcytometri analyse. Plausibel forklaring omfatter forbigående ekspresjon produserer et meget høyt nivå av DLC1 som kan forårsake toksisitet overfor cellene; mens vår stabile cellesystem kan ha gjennomgått noen form for tilpasning under stabile celleutvalget, som gjør at cellene skal spres med uttrykk for kjernefysisk DLC1. Også den celletype og cellelinje avhengige effekter i å bidra til den forskjell i DLC1 aktivitet til å indusere apoptose og vekststans må tas i betraktning [11], [16], [24]. På den annen side har Scholz et al vist at DLC1 S327AS431A mutant er i stand til kompleks med 14-3-3 i cytoplasma og er biologisk mer aktive enn villtype-DLC1. Dessverre, forfatterne fant at innføringen av negativt ladede rester på de nevnte områdene kan ikke etterligne konstitutivt aktiv 14-3-3 binding konformasjon. Mangelen på en gunstig mutant hindrer vurdering på hvordan disse 14-3-3 bindings rester påvirker LMB følsomheten DLC1 [17]. Ved å anta at DLC1 S327AS431A er mindre sannsynlighet for å bli sekvestrert i cytoplasma, kan man forutsi at denne mutant kan bli transportert inn i kjernen oftere. Det er imidlertid for tiden ikke kjent hvorvidt den hyperaktivitet av denne mutant er et resultat av den økte atom inngang på kort sikt eller er på grunn av den konformasjonsendring som favoriserer DLC1 RhoGAP funksjon. Det er mulig at den økte kjernefysiske oppføring av et biologisk hyperaktiv DLC1 kan tjene som en negativ reguleringsmekanisme for å nedregulere hyperaktiv DLC1 i en lang sikt.
To uavhengige studier har forsøkt å kartlegge NLS i DLC1 [16] , [17]. Yuan et al foreslo DLC1 415-431 er den antatte NLS, mens Scholz et al antydet at DLC1 atom transport krever bare siste halvdel av det samme området som involverer restene 428 og 429. Men vi fant at DLC1 mutant mangler hele forslaget NLS kan fremdeles bli effektivt holdt tilbake i kjernen, noe som indikerer ekstra strukturell sekvens i DLC1 kan være involvert i denne nukleær transport. For å løse dette, utførte vi detaljert subcellulære lokalisering undersøkelse av GFP-DLC1 sletting mutanter. Vi fant ut at DLC1 Δ292-646 mutant var mindre LMB følsom. Konsekvent, fant vi at uttrykket av fragmenter som representerer bare sentrum regionen DLC1 viste kjernefysiske lokalisering. Observasjonen innebærer at endringer i begge ender av DLC1 kan utsette elementer som er driv nukleære lokaliserings av DLC1. Fra disse dataene, vi videre foreslå og bekrefter at regionen 600-700 i RhoGAP domenet er viktig i regi kjernefysiske lokalisering av DLC1.
