Abstract
Colchicine, et naturlig produkt av
Colchicum autumnae
dag brukes for gikt behandling, er en tubulin målretting forbindelse som hemmer microtubule dannelse ved å målrette raskt dele celler. Dette tubulin målretting eiendom har ført forskere å undersøke potensialet for kolkisin og analoger som mulig kreftbehandlingen. En stor studie utført på en analog allocolchicine, ZD 6126, ble stanset i fase 2 kliniske studier på grunn av alvorlig hjerte- og toksisitet forbundet med behandling. Denne studien omfatter utvikling og testing av nye allocolchicine analoger som holder giftfri anti-kreft egenskaper. Foreløpig har vi syntetisert og evaluert de anti-kreft aktiviteter to analoger; N-acetyl-O-methylcolchinol (NSC 51046 eller NCME), som er strukturelt lik ZD 6126, og (
S
) -3,8,9,10-tetramethoxyallocolchicine (grønn 1), som er en nytt derivat av allocolchicine som er isomer i A-ringen. NSC 51046 ble funnet å være ikke-selektiv med hensyn det indusert apoptose i begge BxPC-3 og PANC-1 bukspyttkjertelen kreftceller og i normale humane fibroblaster. Interessant, fant vi ut at grønn en var i stand til beskjedent indusere pro-død autofagi i disse kreft i bukspyttkjertelen celler og E6-1 leukemi celler, men ikke i normale humane fibroblaster. I motsetning til kolkisin og NSC 51046, betyr Grønn en ikke ut til å påvirke tubulin polymerisasjon som indikerer at den har en annen molekylære mål. Grønne 1 også forårsaket økt reaktive oksygenforbindelser (ROS) produksjon i mitokondriene isolert fra kreft i bukspyttkjertelen celler. Videre
in vivo
studier viste at grønn 1 ble godt tolerert hos mus. Våre funn tyder på at en liten endring i strukturen av kolkisin har tydeligvis endret virkningsmekanisme og fører til forbedret selektivitet. Dette kan føre til bedre selektive behandlinger i kreftbehandling
Citation. Larocque K, Ovadje P, Djurdjevic S, Mehdi M, Grønn J, Pandey S (2014) Novel analog Colchicine Induserer Selektiv Pro-døden Autophagy og nekrose i humane kreftceller. PLoS ONE 9 (1): e87064. doi: 10,1371 /journal.pone.0087064
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 22 august 2013; Godkjent: 19 desember 2013; Publisert: 23 januar 2014
Copyright: © 2014 Larocque et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. The Windsor og Essex County Cancer Center Foundation Seeds4Hope Grant og NSERC Discovery Grant programmet. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Dr. Siyaram Pandey er en PLoS ONE redaksjonsmedlem. Men dette betyr ikke endre forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
I Canada er det anslått at 187, vil 600 mennesker bli diagnostisert med kreft og 75, 500 mennesker vil dø av kreft i 2013 [1]. Av det store antall forskjellige typer kreft, er kreft i bukspyttkjertelen en av de mest dødelige, som det er svært aggressive, motstandsdyktig mot behandling, utvikler seg raskt og har en mangel på klare symptomer; Derfor, er det forbundet med dårlig prognose og sent stadium diagnose [2], [3]. Aktuelle behandlinger for kreft i bukspyttkjertelen omfatter kirurgi, stråling, og flere chemotherapies, inkludert 5-fluorouracil og gemcitabin [4]. Dessverre er effekten av disse behandlingsalternativene ikke langvarig, og de er forbundet med alvorlige bivirkninger, på grunn av ikke-selektive målretting av ikke-kreftceller [5]. Mens mye fremgang har blitt gjort i mange krefttyper, bukspyttkjertelkreft tilfeller og dødsfall er fortsatt på vei oppover [6]. Det er av stor betydning at en selektiv, tryggere og ikke-giftig alternativ til nåværende behandlingsalternativer er utviklet for dem som lider med kreft i bukspyttkjertelen. Leukemi er en annen dødelig form for kreft som oppstår når blod stamceller i benmargen utvikle seg til unormale celler. Det er anslått å bli diagnostisert i 5800 kanadiere i 2013 og drepte 2600. Selv om behandling alternativer er tilgjengelige, er det fortsatt behov for å utvikle en mer effektiv og tryggere alternativ.
Av særlig betydning for overlevelsen av kreftceller er deres evne til å unngå programmert celledød (PCD). Nærmere bestemt, kreftceller er i stand til å omgå apoptose, PCD type I, som er involvert i homeostatiske regulering og utvikling. Apoptose virker å hindre skadede og muterte celler fra proliferating og samler [7]. Autophagy, PCD type II, som er en katabolsk prosess som involverer sammenbrudd av skadede cellulære komponenter og kan også gi energi under perioder med stress har også blitt implisert i overlevelse av kreftceller. Denne prosessen med å bryte ned skadede cellulære komponenter gir cellene med materialer som kan brukes til å generere energi til at belastningen er fjernet [8], [9]. På grunn av denne prosess, har autophagy vært ansett å være bare en pro-overlevelse mekanisme; Nylig har imidlertid forskere har funnet at vedvarende eksponering for stressfaktorer kan føre til langvarig autophagy og deretter, celledød [10], [11]. På grunn av dette dobbelt formål, er det et spørsmål om hvorvidt det er mer gunstig å hemme eller indusere autofagi for å forårsake kreft celledød, og forskere er for tiden utforsker begge veier. Til slutt, er nekrose en form for patologisk celledød som er forårsaket av eksponering for infeksjon, toksiner, eller traume [12], [13]. Nylig har det blitt funnet at nekrose, som apoptose, kan også programmeres og dens induksjon kan være en annen strategi i kreftterapi [14], [15]. Ved forskning på celledød induksjon, forskerne er i økende grad fokusert på å finne forbindelser og produkter, med kreft spesifikke mål, kan det føre til induksjon av celledød programmer i kreftceller selektivt, uten induksjon av celledød i ikke-kreftceller, og dermed omgåelsen noen av toksisitet forbundet med dagens kreftbehandling.
Colchicine er et naturlig stoff som kan isoleres fra enten
Colchicum autumnale plakater (eng safran) eller
Gloriosa superba product: ( herlighet lilje), som begge tilhører liljefamilien [16]. Kolchicin er ikke ukjent for den medisinske verden, som det har blitt benyttet i behandlingen av gikt, og har blitt undersøkt i mange andre tilstander, inkludert familiær middelhavsfeber [17], cirrhose [18] og Sweets syndrom [19]. Mer nylig har allocolchicines (derivater av kolkisin) og andre analoger er vist noen spennende effekter i kreftceller. Dette skyldes i stor grad allocolchicine evne til å stanse mitose ved inhibering av tubulin polymerisering til mikrotubuli [16], å hindre forplantingen av cellene gjennom cellesyklusen, og som fører til induksjon av apoptose. Denne hemming av mikrotubuli formasjon er spesielt nyttig i cancerterapi fordi kreft celler prolifererer raskt og ukontrollert. En allocolchicine derivat, ZD 6126 som er et pro-legemiddel av N-acetylcolchinol, hadde noen spennende resultater, som det var i stand til å forstyrre cytoskjelettet av tumor endotelceller og forårsake apoptose (Fig. 1) [20], [21]. ZD 6126 forårsaket tumorcelle nekrose i
in vivo
musemodeller av human lunge (Calu-6), kolorektal (LoVo og HT-29), prostata (PC-3), eggstokk (SKOV-3), og bryst (MDA-MB-231) svulster [22]. Dessverre ble denne forbindelsen stanset i fase 2 kliniske studier som følge av forbundet cardio-toksisitet hos mennesker [23]. Det er ikke overraskende at dette er derivater og andre derivater var giftig fordi tubulin og mikrotubuli er viktig for cellesyklus ikke bare i kreftceller, men også i ikke-kreftceller; Derfor er denne ikke-selektive target en av grunnene til at ikke-kreft-celler er mottagelige for apoptose fremkalt av tubulin målsøkende midler, som fører til de observerte bivirkninger [24].
Her rapporterer vi anticancer aktivitet av syntetiske derivater av allocolchicine; N-acetyl-O-methylcolchinol (NSC 51046 eller NCME), som er strukturelt lik ZD 6126, og (
S
) -3,8,9,10-tetramethoxyallocolchicine (grønn 1), som er en nytt derivat av allocolchicine som er isomer i A-ringen (fig. 1). I denne studien, rapporterer vi differensialmekanismer to allocolchicine derivater overfor leukemi og kreft i bukspyttkjertelen celler forårsaket av små modifiseringer av deres kjemiske struktur. NSC 51046 klart indusert ikke-selektiv apoptose i kreft i bukspyttkjertelen celler (PANC-1 og BxPC-3) og ikke-kreft foster fibroblaster (NFF), mens Grønn en forårsaket pro-død autofagi og nekrose selektivt i kreft i bukspyttkjertelen celler (PANC-1 ) og akutt T-celle leukemi (E6-1 eller Jurkat), samtidig som de har liten effekt på ikke-kreft humane fibroblaster (NHF). Videre, i motsetning kolkisin, ZD 6126 og NSC 51046, Grønn 1 ser ikke ut til å målrette tubulin og har en annen molekylære mål. Det er meget interessant at en liten endring i strukturen av allocolchicine har endret virkningsmekanismen og føre til forbedret selektivitet kreft. Disse funnene kan føre til utvikling av bedre og mer selektive kjemoterapeutika for kreftbehandling.
Materialer og Metoder
Cell Culture
Den menneskelige kreftcellelinjer som ble brukt i denne studien var bukspyttkjertelen epiteloid karsinom (PANC-1;. Cat No. CRL-1469), bukspyttkjertelen adenokarsinom (BxPC-3;. Cat No. CRL-1687) og akutt T-celle leukemi, klone E6-1 (Jurkat; TIB-152 ), som alle ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Den normale cellelinjer brukt i denne studien var normale humane fibroblaster (NHF;. Cat No. AG09309) og normale foster fibroblaster (NFF;. Cat No. AG0443), som begge ble kjøpt fra Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ . PANC-1-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco BRL, Mississauga, ON, Canada) og 10 mg /ml gentamicin ( Gibco BRL, Mississauga, ON, Canada). BxPC-3 og Jurkat-celler ble dyrket i RPMI-1640 medium (Sigma-Aldrich, ON, Canada) supplert med 10% FBS (Gibco BRL, Mississauga, ON, Canada) og 10 mg /ml gentamicin (Gibco BRL, Mississauga, ON, Canada). NHF og NFF celler ble dyrket i Minimal Essential Medium Earls balanserte salter (MEM /EBSS), (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) supplert med 15% FBS ikke-essensielle aminosyrer (Gibco BRL, Mississauga, ON, Canada) og 10 mg /ml gentamicin (Gibco BRL, Mississauga, ON, Canada). Alle cellelinjer ble dyrket og vedlikeholdes på en Forma Scientific CO
2 inkubator utstyrt med et HEPA filter (Forma Scientific Inc, Marietta, Ohio) ved 37 ° C, 95% luftfuktighet og 5% CO
2
Cell Treatment
Allocolchicine derivater, N-acetyl-O-methylcolchinol (NSC 51046) og (
S
) -3,8,9,10-tetramethoxyallocolchicine (Grønn 1) ble anvendt som nøkkelforbindelser for denne studien [25]. Cellene ble behandlet med økende konsentrasjoner og varigheter for NSC 51046 og Grønn 1, rekonstituert i dimetylsulfoksyd (Me
2SO). Før behandling ble lager konsentrert forbindelser ytterligere fortynnet i fosfat-bufret saltvann (PBS). I tillegg til allocolchicine derivater, ble colchicin (Sigma-Aldrich, ON, Canada) som brukes for å sammenligne effektene av allocolchicine derivater til de allerede kjente mekanistiske effekt av colchicines. Paclitaxel (Sigma-Aldrich, ON, Canada) og Paraquat (PQ), (Sigma-Aldrich, ON, Canada) ble brukt som positive kontroller i ulike eksperimenter.
Vurdering av effekt av grønn 1 og NSC 51 046
WST-1-analysen.
For å måle celleviabilitet, WST-1 fargestoff ([2- (4-Iodophenol) -3- (4-nitrofenyl) -5- (2,4 disulfofenyl) -2
H
tetrazolium, Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) ble brukt. Dette fargestoff er redusert til formazan i nærvær av metabolske enzymer, som er en indikasjon på aktiv metabolsk aktivitet i levedyktige celler. Mengden av formazanet kan måles ved absorbans ved 450 nm. Samme antall celler ble sådd i 96-brønners plater (PANC-1:4,000 celler /brønn; NHFs: 4000 celler /brønn), med et totalvolum på 100 ul. Etter festing, ble cellene behandlet med økende konsentrasjoner av Green eller en NSC 51046. På det ønskede tidspunkt, ble det WST-1 fargestoff tilsatt til hver brønn og inkubert i 4 timer ved 37 ° C. Ved hjelp av en Wallac Victor
3 ™ 1420 Multilabel Counter (PerkinElmer, Woodbridge, ON, Canada), absorbans verdier ble målt ved 450 nm. Absorbansverdiene for de behandlede celler ble uttrykt som en prosentandel av absorbansverdiene for kontrollen.
Trypan blå eksklusjon assay.
å kvantifisere prosentandel av døde celler, trypanblått celle ugjennomtrengelig fargestoff ble inkubert med behandlede celler [26]. En 01:01 blanding av cellesuspensjon og trypan blått fargestoff (Sigma-Aldrich, ON, Canada) ble pipettert inn i et hemacytometer (Scientific Hausser, Horsham, PA), og antallet celler (døde celler farget blått og levedyktige celler forble uten flekker) ble manuelt kvantifisert. Antallet av døde celler ble uttrykt som en prosentandel av det totale antall celler. Resultatene ble analysert ved bruk av GraphPad Prism 6,0 og rapportert som gjennomsnitt ± SD av to uavhengige eksperimenter.
Hoechst Farging
For å visualisere atom morfologi og induksjon av apoptose, Hoechst 33342 fargestoff (Molecular sonder, Eugene, OR, USA) ble brukt til å farge kjerner. Etter behandling med enten en grønn eller NSC 51046, ble celler inkubert med 10 pM av Hoechst 33342 fargestoff i 10 minutter ved 37 ° C. Bilder ble innhentet ved hjelp av en Leica DM IRB invertert fluorescens mikroskop (Wetzlar, Tyskland) ved 400x forstørrelse.
Annexin V bindingsanalyse
For å finne ut om NSC 51046 og kolkisin ble indusere apoptose, en Annexin V-bindingsanalysen ble anvendt. Etter behandling, ble PANC-1-celler samlet opp, vasket i PBS og resuspendert i 50 pl Annexin V bindingsbuffer (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl
2, pH 7,4). Cellene ble deretter inkubert med Annexin V AlexaFluor-488 konjugat (01:20) (Invitrogen, Canada), 10 uM Hoechst 33342 fargestoff (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) og 1 ug /ml propidiumjodid (Sigma-Aldrich, ON , Canada) i 15 minutter ved 37 ° C. Bilder ble tatt på 400x forstørrelse ved bruk av Leica DMI6000 fluorescerende mikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland)
MDC analysen
For å oppdage autofagi, monodansylcadaverine (MDC,. Sigma-Aldrich, ON, Canada ) var brukt. MDC er innlemmet i autophagic vakuoler, som produserer en punktformet flekk som er observerbar gjennom fluorescens mikroskopi. Celler ble dyrket på dekkglass og, etter inkubasjon over natten, ble behandlet med varierende doser av Green 1. Etter behandling, ble celler inkubert med en endelig konsentrasjon på 0,1 mM MDC (fortynnet i PBS) i 35 minutter ved 37 ° C. For ytterligere bekreftelse av tap av cellemembranintegritet og induksjon av celledød, ble cellene mot-farget med cellemembranen ugjennomtrengelig nukleær flekk, propidiumjodid ved 1 mikrogram /ml (Sigma-Aldrich, ON, Canada) for å bekrefte induksjon av celledød. Bildene ble oppnådd ved hjelp av en Leica DM IRB invertert fluorescens mikroskop (Wetzlar, Tyskland) ved 400x forstørrelse.
Cellular Lysatfremstilling
Etter behandling med 5 mikrometer Grønne ett for ulike tidsperioder, ble cellene oppsamlet, vasket i PBS og inkubert i 0,1% NP40-buffer (20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA) i 25 minutter på is (virvling hvert 5. minutt i 15 sekunder). Prøven blir så sentrifugert ved 3000 rpm i 5 minutter ved 4 ° C. Supernatanten (inneholdende den lyserte cellemateriale) blir lagret ved -20 ° C inntil bruk.
Western Blot
proteinprøver ble separert ved hjelp av SDS-PAGE. Elektroforese proteiner ble så overført til en nitrocellulosemembran og blokkert med 5% vekt /volum melk TBST (Tris-bufret saltvann med Tween-20) -løsning. Membranene ble deretter probet med primære antistoffer i 2% vekt /volum melk TBST over natten ved 4 ° C i mikrotubul-assosiert protein1 lettkjede 3 (LC3) hevet i kanin (1:500) (Novus Biologicals, Cat. No. NB100- 2220, Littleton, CO, USA); β-Actin oppvokst i mus (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Cat No. sc-81178, CA, USA.); Beclin-en oppvokst i kanin (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., kat. Nr sc-11427, CA, USA). Etter inkubasjon ble membranene vasket i TBST og inkubert et anti-mus (1:2000) eller et anti-kanin (1:2000) pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff (Abcam, Cat No. ab6728 Eosin (H E) Farging
Mus organer ble fiksert i 10% formaldehyd, hvoretter de ble cryosectioned til 10 mikrometer seksjoner og plassert på en Superfrost /Plus objektglass (Fisherbrand, Fisher Scientific). Deler av organer ble farget i henhold til en standardisert H E-protokollen [27].
Statistical Analysis
Resultatene er uttrykt som en gjennomsnittlig (SD). Statistisk analyse ble utført ved hjelp av en to-veis ANOVA test med GraphPad Prism 6.0-programvare.
Resultater
Effekt av Allocolchicine Derivater på levedyktigheten til kreftceller
For hensikten med denne studien, levedyktigheten av kreft i bukspyttkjertelen celler (PANC-1) ble målt etter behandling med grønn en eller NSC 51046, ved hjelp av WST-1 celle-levedyktighet assay. Etter en 4-timers inkubering med WST-1 fargestoff, ble absorbansen avlest ved 450 nm. Parallelt ble det ikke-kreft normale humane fibroblaster (NHFs) anvendes som normal celle motstykke i denne studien å bestemme selektiviteten av forbindelsene til kreftceller. Våre resultater viser at både NSC 51046 og Grønn en var i stand til å redusere levedyktigheten til PANC-1 celler. Det ble imidlertid observert at en grønn var selektiv for kreftceller, som levedyktigheten til PANC-1-celler ble i liten grad reduseres samtidig som levedyktigheten til NHFs forble upåvirket. På den annen side, behandling med NSC 51046 førte til reduksjon av levedyktighet i både kreft og ikke-kreftceller (Fig. 2A). Videre redusert Grønn en behandling proliferasjon av humane T-celleleukemiceller og nedsatt cellemembranintegritet, som gjenspeiles av økningen i trypanblått-positive celler observert etter behandling (fig. 2B). Sammen er disse resultatene tyder på at grønn en er selektiv mot kreftceller.
(A) kreft i bukspyttkjertelen celler (PANC-1) og normale humane fibroblaster (NHFs) ble behandlet med økende konsentrasjoner av Grønn 1 og NSC 51046 og etter behandling ved de angitte tidspunkter ble cellene inkubert med WST-1 celle-levedyktighet fargestoff i 4 timer. Absorbans ble avlest ved 450 nm, og resultatene ble uttrykt som en prosent av kontrollen. Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SD fra quadruplicates; (I) PANC-en behandles med NSC 51046 (Samspill mellom hver konsentrasjon: **** p 0,0001, kontroll versus kolonnefaktoren: **** p 0,0001); (Ii) NHF behandlet med NSC 51046 (Samspill mellom hver konsentrasjon: **** p 0,0001, kontroll versus kolonnefaktoren: **** p 0,0001); (Iii) PANC-en behandles med Grønn 1 (Samspill mellom hver konsentrasjon: p = 0,9955; kontroll versus kolonnefaktoren: **** p 0,0001); (Iv) NHF behandles med grønn 1 (Interaksjon mellom hver konsentrasjon: p = 0,3642; Styre versus kolonne faktor: * p = 0,0370) (B) Ved å følge behandling av humane akutt T-celle-leukemi-celler (Jurkat) med grønn 1, en trypanblått unntatt analysen ble utført. Celler ble farget med trypanblått cellemembranen ugjennomtrengelig fargestoff og antallet av trypanblått-positive celler ble oppnådd ved bruk av et hemocytometer. Resultatene er uttrykt som prosent av trypanblått-positive celler, noe som indikerer døde celler med ikke-intakte cellemembraner. Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SD fra to uavhengige forsøk.
Distinkte Modes av celledød Induksjon av Allocolchicine Derivater
For å undersøke hvilken rolle allocolchicine derivater på celledød induksjon i kreftceller , kjernen av cellene ble farget med 10 mikrometer Hoechst 33342 fargestoff i 10 minutter etter behandling med enten grønn en eller NSC 51046 for enten 48 eller 96 timer. I de resulterende bilder (fig. 3A), ble det observert at NSC 51046 behandlingen resulterte i kjerner som viste apoptotisk morfologi, inkludert celle blebbing, krymping og kondenserte kjerner for begge bukspyttkjertelkreft celletyper og de ikke-kreft normal foster fibroblaster (NFFs) , svarende til levedyktighet data. Men kreft og ikke-kreftceller behandlet med Grønn 1 viste ikke dette apoptotisk morfologi, noe som tyder på at grønn en ikke induserer apoptose i kreft i bukspyttkjertelen celler. Den apoptotiske induksjon av NSC 51046 ble bekreftet ved hjelp av en Annexin V bindingsanalysen. Annexin V binder seg til ekstern fosfatidylserin, som er en markør for tidlig apoptose [28]. I de resulterende bilder (fig. 3B), ble det funnet at behandling med begge doser av bly NSC 51046 til eksternalisering av fosfatidylserin, som vist ved den grønne fluorescerende farging. Videre ble det også observert at behandling med kolkisin indusert apoptotisk celledød som det førte til kjernefysiske fragmentering, eksternalisering av fosfatidylserin og celledød. Mangelen på apoptotisk morfologi og reduksjon i levedyktigheten til kreft i bukspyttkjertelen celler behandlet med en grønn førte oss til å undersøke andre former for celledød. Etter behandling ble cellene deretter inkubert med monodansylcadaverine (MDC) for å fastslå om det var autophagic induksjon. Vi observerte induksjon av autophagy på 48 timer i alle kreftceller testet, kan sammenlignes autophagic induksjon av vår positive kontrollen for pro-overlevelse autofagi, Tamoxifen [10] (Fig. 4A). Videre farging med propidiumjodid (PI) viste at, i motsetning Tamoxifen, Green 1 behandlede kreftcellene var positive for propidiumjodid og oppviste en pro-død form av autophagy (Fig. 4A). Denne aktiviteten av Grønn 1 var spesifikk for kreftceller, som NHFs behandlet med Grønn en ikke flekken positiv for nærvær av autophagic vakuoler med MDC eller nekrotisk celledød med PI, noe som bekrefter selektiviteten for Green 1 til kreftceller. For å bekrefte den induksjon av autophagy forårsaket av Grønn 1, Beclin-1-ekspresjonen og LC3-I til LC3-II omdannelse ble undersøkt ved western blot analyser i PANC-1-celler behandlet med 5,0 uM Grønn 1 for forskjellige tidsintervaller (fig. 4B). β-actin ble målt som en intern kontroll lasting. Tetthetsmåling ble utført, og prøvene som er behandlet i 3 og 6 timer ble sammenlignet med tidlig kontroll, mens prøven behandlet i 48 timer ble sammenlignet med den 48-timers kontroll. De resulterende grafene viser at grønn en behandling medført en økning i Beclin-1-nivåer på alle tidspunkter etter behandling. LC3-II var moderat øket 6 timer etter behandling med grønne 1.
Etter behandling med enten grønne 1 (A) pankreaskreft celler (BxPC-3 og PANC-1) og normale humane fibroblaster og foster ( NHFs og NFFs) ble inkubert med Hoechst 33342 fargestoff for å karakterisere atom morfologi og påvise induksjon av apoptose. Lyst farget, kondensert atomkjerner ledsaget av apoptotiske legemer er tegn på apoptose. (B) PANC-1-celler ble inkubert med Annexin V fargestoff for å bekrefte apoptotisk induksjon forårsaket av NSC 51046. Cellene ble motfarget med Hoechst 33342 fargestoff og propidiumjodid (PI) for å visualisere atom morfologi og celledød. Bilder vist er representative for to uavhengige eksperimenter på 48 timer etter behandling med NSC 51046 og kolkisin.
(A) kreft i bukspyttkjertelen celler, humane leukemiceller (Jurkat) og NHFs ble inkubert med Monodansylcadaverine (MDC) å farge autophagic vakuoler og propidiumjodid (PI) for celledød å avgjøre om autophagic induksjon førte til celledød. Bright, punktformet flekk er en indikasjon på autophagy, som sett i den positive kontroll (Tamoxifen behandlede celler). Bilder ble tatt ved 400x forstørrelse på et fluorescerende mikroskop. (B) Western blot analyser av Beclin-1-ekspresjonen og LC3 omdannelse ble utført på PANC-1-celler behandlet med 5,0 uM grønne 1 ved forskjellige tidspunkter. β-actin ble målt som en intern kontroll. Prøvene ble behandlet i 3 og 6 timer ble sammenlignet med tidlig kontroll, mens prøven behandlet i 48 timer ble sammenlignet med den 48-timers kontroll. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD fra to uavhengige forsøk for både vestlige blotter.
Intracellulær Targets fra Green 1
Colchicine og noen av dets derivater er kjent for å indusere apoptose i kreftceller ved inhibering av tubulin polymerisering, og som fører til DNA-skade, som virker som et signal for initiering av prosessen med apoptose [29]. Som vi observere ulike effekter av Grønn 1 og NSC 51046 i celledød induksjon, ønsket vi å undersøke nærmere potensielle intracellulære mål av Green 1, i forhold til NSC 51046 og kolkisin. Spesielt ble virkningene av kolkisin og dets derivater på tubulin polymerisering evaluert. Grønn 1, ble NSC 51046 eller kolkisin inkubert med tubulin renset fra svine hjernen. OD
340 ble målt hvert minutt i en time, og den resulterende kurve som er vist i figur 5A. Våre resultater tyder på at NSC 51046 induserte svak tubulin inhibering ved den lavere dose, som svarer til tidligere studier [31], [32]; imidlertid, observerte vi at en høyere dose av NSC 51046 forårsaket hurtig tubulin polymerisering, som var uventet. Som forventet, colchicin hemmet tubulin polymerisering. Behandling med Grønn en ved høyere doser resulterte i en svak økning i tubulin polymerisering, mens den nedre Grønn en dose holdt seg forholdsvis nær til kontrollprøven (fig. 5A). Dette bekrefter at en grønn og NSC 51046 har forskjellige biokjemiske mekanismer, som NSC 51046 mål tubulin polymerisering i langt større grad enn Grønn 1. Disse resultatene tyder på at en enkel forandring i strukturene av disse allocolchicine analoger har ført til meget forskjellige biologiske aktiviteter i normale og kreftceller.
(A) kolkisin derivater (Grønn 1 og NSC 51046) ble inkubert med svin tubulin for en time i en 96-brønns plate. Absorbans (OD
340 nm) ble oppnådd hvert minutt i løpet av en time inkubasjon. Colchicin ble anvendt for sammenligning med de derivater. (B) Isolert mitokondrier fra PANC-1-cellene ble behandlet med en grønn og ROS-produksjon ble målt ved anvendelse Amplex Red substrat i nærvær av pepperrot peroksidase (HRP). Resultatene ble sammenlignet med kontroll ubehandlede mitokondriene, colchicin behandlet mitokondrier og positiv kontroll, paraquat (PQ). Fluorescens-avlesninger ble tatt i 5 minutters intervaller i 4 timer ved Ex. 560 nm og Em.590 nm og uttrykt som relative fluorescensenheter (RFU).
