Abstract
Vi sammenlignet veksten av humane lungekreftceller i en
ex vivo
tre-dimensjonale (3D) lungemodell og 2D-kultur for å bestemme hvilke bedre kreftvekst etterligner lunge hos pasienter. A549 celler ble dyrket i et
ex vivo
3D lunge-modellen og i 2D kultur i 15 dager. Vi målte størrelse og dannelsen av tumorknuter og telles cellene etter 15 dager. Vi har også farget vevet /cellene for Ki-67, og caspase-3. Vi målte matriks-metalloproteinase (MMP) nivåer i det kondisjonerte medium og i blodplasma fra pasienter med adenokarsinom av lungen. Organiserte tumornoduler med intakt vaskulære rommet dannet i
ex vivo
3D lunge-modellen, men ikke i 2D kultur. Spredning og apoptose var større i
ex vivo
3D lunge-modellen i forhold til 2D kultur. Etter 15 dager var det signifikant flere celler i 2D kultur enn 3D-modellen. MMP-1, MMP-9, og MMP-10 produksjon var betydelig større i
ex vivo
3D lunge modell. Det var ingen produksjon av MMP-9 i 2D kulturen. Pasientprøvene inneholdt MMP-1, MMP-2, MMP-9 og MMP-10. De menneskelige lungekreft celler dyrket på
ex vivo
3D-modell skjema perfusable knuter som vokser over tid. Det er også produsert MMP som ikke ble produsert i 2D kultur, men sett i humane lungekreftpasienter.
ex vivo
3D lunge-modellen kan nærmere etterligne biologien til menneskelig utvikling lungekreft enn 2D kultur
Citation. Mishra DK, Sakamoto JH, Thrall MJ, Baird BN, Blackmon SH Ferrari M, et al. (2012) Menneskelige lungekreft celler dyrket i en
Ex Vivo
3D Lung Modell Produser matriksmetalloproteinaser ikke produsert i 2D Culture. PLoS ONE 7 (9): e45308. doi: 10,1371 /journal.pone.0045308
Redaktør: Effie C. Tsilibary, Nasjonalt senter for Scientific Research Demokritos, Hellas
mottatt: 8. mai 2012; Godkjent: 20 august 2012; Publisert: 17.09.2012
Copyright: © Mishra et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser:. forfatterne har lest journalen politikk og har følgende konflikter. MPK har sendt inn en patentsøknad for ex vivo 3D lunge modell. Patentet har tittelen «neoplastiske celler dyrket på decellularized BioMatrix.» Den dekker etablering av decellularized matrise og voksende neoplastiske celler på decellularized matrise i en bioreaktor. Den dekker også den potensielle anvendelsen av modellen. Det er ingen selskap forhold til patentet og forfatterne har ikke mottatt noen inntekter fra patent. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Lungekreft er den vanligste årsaken til kreftrelaterte dødsfall i USA [ ,,,0],1]. Til dags dato er det ingen effektiv behandling for pasienter med lungekreft, og den samlede fem års overlevelse har ikke økt betydelig siden 1975, 13% i 1975, og bare 16% i 2005 [1]. Den mangel på fremgang i å finne effektive behandlinger for lungekreft kan skyldes delvis mangel på en nøyaktig modell som etterligner de biologiske prosesser som forekommer hos pasienter med lungekreft. To-dimensjonale (2D) petriskål cellekulturer har gitt god innsikt i evnen til kreftceller til å vokse, men de gir ikke informasjon om det komplekse samspillet mellom kreftceller og deres omgivelser. Dyremodeller gir definitive tester for bestemte prosesser, men det er ofte en manglende korrelasjon mellom forventede og observerte resultater, noe som kan skyldes de modellene seg selv [2]. Videre trenger menneskelig tumorvekst og respons på medikamentell behandling i dyremodeller ikke alltid korrelerer med resultatene av menneskelige forsøk [3] – [5]. Videre dyremodeller ta flere uker for å tilveiebringe data om biologiske prosesser. Som et resultat,
in vitro
3D-modeller har blitt utviklet gjennom årene som et forsøk på å fylle gapet mellom tradisjonelle 2D kulturer og dyreforsøk.
Det er for tiden to hovedtyper av
in vitro
3D-modeller. Den første typen tar på
in vivo
vev av interesse og explants og kulturer dem
in vitro
, som gir informasjon om den kortsiktige veksten av vev [6], [7]. Den andre typen vokser tumorceller i et 3D kunstig matrise stillaset. Dette
in vitro
3D-modell ved hjelp av Matrigel har vist seg å være overlegen i forhold til 2D kulturen ved hjelp av en petriskål for å studere tumorvekst [8] – [10]. De fysiologiske forandringer i kreftcellene dyrkes på Matrigel er vesentlig forskjellige fra de av de tumorer dyrket i kultur 2D. Det er begrensninger, men til dagens
in vitro
3D-modeller. Selv om de gir et substrat for svulstene å vokse på, er underlaget et kunstig produkt som ikke oppdages av disse cellene i en naturlig setting. Dessuten, disse
in vitro
3D-modeller mangler tilstedeværelse av blodkar, noe som hindrer deres evne til å etterligne
in vivo
miljø og opprettholde dynamisk celle atferd [5].
her har vi preget en
ex vivo
3D lungemodell som har vist seg å produsere voksende perfusable lunge knuter [11]. I motsetning til
in vitro
3D-modeller, vår
ex vivo
3D lunge modellen bruker en naturlig matrise, som opprettholder sin homologi mellom artene [12], og decellularized matrix danner en barriere mellom endothelial og epiteliale områder [13]. Dermed menneskelige lungekreft cellelinjer er i stand til å danne tette knuter i dette
ex vivo
modell med intakt blodkar [11], som overvinner begrensningene med
in vitro
3D-modeller. Videre lar
ex vivo
3D lunge-modell cellene til å vokse over tid, noe som kan vise til en dynamisk tilstand som ikke er sett i
in vitro
3D-modeller. Vi sammenlignet med veksten av humane lungekreftceller i denne
ex vivo
3D-modell med at i et 2D-kultur under de samme dyrkningsbetingelser i 15 dager. Vi fant betydelige forskjeller i dannelsen av kreftknuter, total celle tall, spredning priser, celle dødelighet og matriksmetalloproteinase (MMP) produksjon. Videre de menneskelige lungekreft celler dyrket i
ex vivo
3D lunge modell produsert MMP som er funnet i humane prøver, mens cellene fra 2D kultur ikke.
Resultater
cellevekst og Nodule Formation
i
ex vivo
3D lunge-modell, 96,3 ± 3,9% av A549 celler festet til den decellularized lunge matrise etter 3 passerer og inkubasjon i 2 timer. De A549 lungekreft celler dyrket på decellularized lunge matriser fra 4 uker gamle (3D -4 Wk) og 6 uker gamle (3D -6 Wk) rotter dannet tumornoduler som vokste over 15-dagers periode. Gjennom hele 15-dagers periode, kunne vi perfuse 3D-modellen med media på 6 cc per minutt. Fordelingen av knuter på matrisen var tilfeldig, men tidspunktet for deres utvikling var hovedsakelig ensartet, med få knuter danner etter dag 6 for lunge-matriser fra 4-ukers-gamle rotter og dag 2 for lunge matricies fra 6-ukers-gamle rotter. Betydelig større noduler ble påvist på A549 lungekreftceller dyrkes på decellularized lunge-matrisene fra den 6-ukers-gamle rotter sammenlignet med dem fra de fire-ukers-gamle rotter (p = 0.03, fig. 1a). Imidlertid knuter på decellularized rotte-matrisene fra den fire-ukers-gamle rotter ble tettere (Fig. 1b) enn knuter på decellularized rotte-matrisene fra den 6-ukers-gamle rotter (Fig. 1d). Vi beregnet tettheten av knuter dyrket på decellularized lunge matriser fra de fire ukers gamle rotter og 6-ukers-gamle rotter ved å dividere antall av cellene på dag 15 dividert med det totale klumpstørrelsen på dag 15. Tettheten nodulene dyrket på decellularized lungen matrisen fra de fire-ukers-gamle rotter (3,24 ± 0,24 millioner celler /cm
2) var signifikant høyere enn tettheten av nodulene dyrket på decellularized lunge matrisen fra 6-uke- gamle rotter (1,12 ± 0,20 millioner celler /cm
2, p = 0,02). Jo høyere tetthet var også tydelig på H E flekk av stillaset. H . E med tumorceller som vokser rundt den uten å hindre den
(a) tumorknuter økte i størrelse over tid. Betydelig større noduler som dannes i decellularized lunge matrisen fra 6-ukers-gamle rotter (3D – 6 Wk, n = 2) sammenlignet med 4 uker gamle rotter (3D – 4 Wk, n = 2, p = 0,03). De tumorknuter var tettere i de fire-ukers-gamle rotter (b) enn i den 6-ukers-gamle rotter (d). H E analyse av celleblokk laget av 2D kultur viste ingen organisasjon (fig, 2a), mens det var celle-celle og celle-matrise organisasjon i
ex vivo
3D lunge-modell, med intakte blodkar (fig. 2b). I
ex vivo
3D lunge-modell, antall A549 celler dyrket på de to forskjellige størrelser stillasene etter 15 dager var ikke signifikant forskjellig: 32 ± 3 millioner celler fra fire uker gamle rotter sammenlignet med 27 ± 5 millioner celler fra 6-ukers-gamle rotter (p = 0.45, fig. 2c). Men den gjennomsnittlige antallet celler etter 15 dager i 2D kultur (471 ± 70 millioner) var ca 16 ganger høyere enn gjennomsnittlig antall celler fra
ex vivo
3D-modell (29 ± 3 millioner; p = 0,0007, figur 2c)
representant Hematoxylin og eosin (H .. E) farging av celler fra (a) 2D kultur og (b)
ex vivo
3D lunge-modell . H E av
ex vivo
3D lunge Modellen viser celle-celle og celle-matrise interaksjoner. (C) Det var signifikant flere celler i 2D kultur (471 ± 70 millioner, n = 3) enn i
ex vivo
3D lunge-modellen (29 ± 3 millioner, n = 4, p = 0,0007) . Det totale antall av celler i 4 uker gamle (32 ± 3 millioner, n = 2) og 6-ukers-gamle (27 ± 5 millioner, n = 2) rotte matrisene var ikke forskjellig (p = 0,45). Feil stolpe representerer standard feil av gjennomsnittet.
spredning og celledød
A549 celler dyrket i 2D kultur (Fig. 3a) og
ex vivo
3D lunge-modellen (fig. 3b) farget positivt for Ki-67. Prosentandelen av celler med Ki-67 flekker var mye høyere i
ex vivo
3D-modell (23,8 ± 2,9%) enn i 2D kultur (6,7 ± 0,9%, p 0,0001). Det var svært få celler i 2D kultur (Fig. 4a) som farget positivt for Caspase-3, mens det var mange celler i
ex vivo
3D modell som farget positivt for Caspase-3 (Fig. 4b ). En signifikant høyere andel av cellene i
ex vivo
3D-modell (5,5 ± 0,8%) farget positivt for Caspase-3 sammenlignet med 2D kultur (0,1 ± 0,1%, p. 0,0001, figur 4c).
representant Ki-67 farging av A549 celler dyrket i (a) 2D kultur og (b)
ex vivo
3D lunge modell. (C) Det var betydelig mer Ki-67 flekker i
ex vivo
3D lunge-modell (23,8 ± 2,9%, n = 4) sammenlignet med 2D kultur (6,7 ± 0,9%, n = 3, p 0,0001). Feil stolpe representerer standard feil av gjennomsnittet.
Representant Caspase-3 farging av A549 celler dyrket i (a) 2D kultur og (b)
ex vivo
3D lunge modell. (C) Det var signifikant mer Caspase-3 farging i
ex vivo
3D-modell (5,5 ± 0,8%, n = 4) sammenlignet med 2D-kultur (0,1 ± 0,1%, n = 3, p 0,0001). Feil stolpe representerer standard feil av gjennomsnittet.
MMP mRNA nivå i de modellene
Det var signifikant høyere uttrykk av MMP-1 (p = 0003) og MMP-2 (p = 0,01) i A540-celler dyrket på 3D–4 Wk forhold til 3D -6 Wk i mRNA erholdt fra dag 15 (figur 5a 0,0001) og 3D -6 Wk (p = 0,0002) ble observert i forhold til mRNA-nivå i 2D. Dette ble også sett med MMP-9 og MMP-10 ekspresjon (Fig 5c således, kan cellene i næringsrike områder nærmere blodkar ha større spredning enn i områder med mindre perfusjon. Evnen til
ex vivo
3D lunge modell for å etterligne denne tilstanden gjør det til en bedre modell av
in vivo
miljø enn 2D kultur.
I tillegg
ex vivo
3D lunge-modellen kan etterligne
in vivo
miljøet bedre enn
in vitro
3D-modeller (som vokser lungekreftceller på Matrigel) fordi det beholder en vaskulær plass, har den naturlige arkitekturen av en perfusable organ, og viktigst, er sammensetningen av matriksen opprettholdes mellom artene [12]. Denne to funksjonene er det viktigste aspektet av
ex vivo
3D modell. Det intakte vaskulære rom er resultat av den voksende tumorceller i acellulær matrisen. Som acellulær matrise skapes gjennom decellularization prosess, hvor basalmembranen er bevart, og opprettholder integriteten til det vaskulære rom og epitelial plass. Den decellularization prosessen fjerner endotelceller fra det vaskulære rom og epiteliale og mesenkymale celler fra epithelial plass. Tumorcellene er plassert i det epiteliale rom gjennom luftrøret, og mediet blir pumpet gjennom det vaskulære rom. Som svulsten vokser og danner knuter, det bevarer den vaskulære rommet. Dersom svulsten ødelegger det vaskulære rom så mediet ikke ville være i stand til å pumpe inn i stillaset på 6 ml pr min. Gjennom 15-dager, har vi ikke noen problemer perfusert svulsten nodule. Dermed skaper modellen perfusable svulst nodule. Det er ingen annen modell som kan levere næringsstoffer og fjerne utskilte faktorer som denne modellen. Dessuten, i motsetning til
in vitro
3D-modeller som baserer seg på en kunstig grunnmasse, sammensetningen av matrisen som brukes i
ex vivo
3D-lunge-modellen er den sammensetning som er mest sannsynlig sett av lungekreft celler i
in vivo
miljø. Som cellesignalisering og virkemåten er avhengig av sammensetningen og stivheten av den ekstracellulære matriks [9], [16], [17], oppførselen av tumorceller kan bli mer nøyaktig representert ved
ex vivo
3D-lunge modell.
i tillegg til å danne perfusable tumornoduler, de A549 celler dyrket i
ex vivo
3D lunge-modell produsert MMP-9 som er produsert av lungekreftceller hos pasienter. MMP er en familie av sink-avhengige endopeptidaser som spiller en nøkkelrolle i tumorcelle invasjon, migrasjon, og metastasering av nedverdigende den ekstracellulære matriks (ECM) og basalmembraner [18]. ECM er et komplekst nettverk av makromolekyler så som kollagen, proteoglykaner, laminin, fibronektin, og mange andre glykoproteiner. MRNA av MMP’er ble også detektert på tumorcellene som vokser på
ex vivo
3D-modell på dag 15. Dessuten er MMP-1, MMP-2, MMP-9 og MMP-10 ble funnet i media av
ex vivo
3D lunge-modellen samt i serum fra blodprøver tatt fra den overlegne vena cava og lungevenene av lobectomy lungekreft prøver. Lunge vene er den første store fartøy som oppdages av utskilt protein fra lungekreft, som vil holde den høyeste konsentrasjonen av proteiner utskilt av kreft. Dessuten inneholder den superior vena cava blod som reiser til lunge-arterien som går til lungen med tumoren. Således bør MMP som sannsynligvis produseres av tumoren har høyest konsentrasjon i lungevenen og laveste konsentrasjon i den øvre vena cava. Blant de fire MMP studert, fant vi at MMP-9 er den eneste protein som møtte disse kriteriene. MMP-9 ble funnet i media av
ex vivo
3D lunge-modellen, mens det ikke ble funnet i 2D kultur. Vår studie bekrefter tidligere funn om at A549 cellene ikke vil produsere MMP-9 i et 2D-kultur [19]. MMP-9 spiller en viktig rolle i nedbrytningen av type IV kollagen, som er en større strukturell protein for ECM og basalmembraner. Høyt serumnivå av MMP-9 nivåer er blitt vist å korrelere med dårlig overlevelse hos pasienter med lungekreft [20], [21]. Tilstedeværelsen av MMP-9 i
ex vivo
3D lunge-modellen tyder på at det etterligner
in vivo
forholdene bedre enn 2D kultur.
Styrken i studien viser hvordan humane lungekreftceller opptrer i 2D sammenlignet med
ex vivo
3D-modell ved å bruke det samme antall celler, og ved å bruke den samme kulturmedier. En svakhet ved denne studien er at vi ikke var i stand til å sammenligne
ex vivo
3D-modell til
in vitro
3D-modeller. Vi var ikke i stand til kultur 25 millioner celler på en matrigel å gi en sammenligning på grunn av tekniske begrensninger
in vitro
3D-modeller. Men vi var i stand til å vise funksjonene i
ex vivo
3D-modell som ikke ble sett i
in vitro
3D-modeller som vekst av kreftknuter og bevaring av det vaskulære rommet.
Totalt menneskelige lungekreft celler dyrket i
ex vivo
3D lunge-modellen hadde egenskaper som etterligner kreft vekst lunge og metastaser hos pasienter, mens celler dyrket i 2D kultur ikke. De menneskelige lungekreft celler dyrket i
ex vivo
3D lunge modell dannet perfusable tumornoduler, med utskilte proteiner som er viktige for tumorvekst og metastasering. Derfor
ex vivo
3D lunge modellen kan være en bedre modell som å studere kreft vekst lunge og metastaser enn 2D kultur og, muligens, andre
in vitro
3D-modeller.
Materialer og metoder
Vi har fått opplyst skriftlig samtykke fra pasientene til å bestemme secretome profiler i blodet. Forsøkene med pasienter ble godkjent av Institutional Review Board ved Methodist Hospital Research Institute (IRB (2) 0811-0142). Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med alle gjeldende lover, forskrifter, retningslinjer og retningslinjer for bruk av forsøksdyr i forskning. Protokollene for dyreforsøk ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Methodist Hospital Research Institute (AUP-0910-0018).
Pasientprøver
Pasienter som var under en lobektomi for lungekreft ga samtykke til å ha blod tatt fra den overlegne vena cava og lungevene av de resected prøven. Vi har også samlet pasienten demografisk informasjon og patologi resultater for prøven. Etter pasienten hadde en sentral linje sted, fjernet vi ca 10 ml fra den sentrale linjen ligger i den overlegne vena cava i en BD Vacutainer med K
2 EDTA (BD, Franklin Lakes, NJ, USA. Så, etter prøven var fjernet fra pasienten, ble lungevenen identifisert. Vi fjernet ca 10 ml blod fra venen og plassert den i en BD Vacutainer med K
2 EDTA (BD, Franklin Lakes, NJ, USA). prøven ble fortynnet med fosfat-bufret saltvann (PBS) ved 1:01, deretter ble prøven lagvis på 18 ml lymfocytt separasjonsmateriale og spunnet ved 2200
g
i en sentrifuge i 20 minutter MMP konsentrasjonen av plasma. laget ble bestemt ved bruk av en Luminex (Luminex, Austin, TX, USA) assay beskrevet nedenfor.
Cell Culture
Den menneskelige alveolar basal epitelial adenokarsinom cellelinje A549 ble innhentet fra American Type Culture Collection ( Manassas, VA, USA). cellene ble dyrket i 525 cm
2 cellekulturflasker (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) i komplett medie laget av RPMI 1640 medium (Hyclone, Sør Logan, UT, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (Lonza, Walkersville, MD, USA) og antibiotika (100 IU /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, og 0,25 ug /ml amfotericin; MP Biomedicals, Solon, OH, USA) ved 37 ° C i 5% CO
2. Når celler var 85% sammenflytende, ble de vasket med PBS og underkastet trypsinisering ved bruk av 0,25% trypsin (Cellgro, Manassas, VA, USA) for å samle cellene fra kolbene. Cellene ble vasket med media og til slutt suspendert i 30 til 50 ml komplett medie.
Ex vivo
3D Lung Modell
Vi skapte
ex vivo
3D-lunge-modell som tidligere beskrevet [11]. Vi brukte decellularized lunge matriser fra 4 uker gamle (n = 2) og 6 uker gamle (n = 2) rotter. De decellularized lunge matriser fra 4-ukers-gamle rotter var betydelig mindre enn de fra 6-ukers-gamle rotter. Vi har lagt 25 millioner A549 celler fortynnet i 50 ml komplett medie gjennom luftrøret av
ex vivo
3D lunge-modell (n = 4). Vi samlet media som passivt kom ut av modellen til en 500 ml beholder, føres den igjen gjennom luftrøret tre ganger og inkubert det ved 37 ° C i 2 timer for å tillate cellebinding. Deretter telles cellene i beholderen, og bestemmes prosentandelen av tumorceller sådd til
ex vivo
3D-lunge-modell. Vi har plassert en ytterligere 200 ml komplett medie i bioreaktor tidligere beskrevet [11] og lot mediene til å gå gjennom pumpen på 6 ml per minutt og deretter gjennom oksygenator og lungearterien av
ex vivo
3D-lunge-modell. Vi kjørte også en kontroll
ex vivo
3D lunge modell der vi endret 200 ml komplett medie i bioreaktor daglig uten å plassere noen celler i modellen. Vi har samlet media hver dag fra 500 ml beholder og spunnet ned det brukte media 400
g
i 5 minutter og reddet 10 ml av supernatanten for secretome analyse. Vi har erstattet den brukte mediet med friskt medium hver dag i 15 dager. Annenhver dag, vi undersøkte
ex vivo
3D lunge modell for tilstedeværelse av knuter. Vi beregnet areal per nodule og lagt opp alle de nodule områder for å få den totale klumpstørrelsen per modell. Etter 15 dager, omtrent 5% av
ex vivo
3D-lunge-modellen ble fjernet og fiksert i 10% formalin for hematoksylin og eosin (H cellene ble deretter regnet med TC10 automatisert celleteller (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
2D Kultur
Vi har lagt 25 millioner A549 celler i en 525-cm
