Abstract
Bakgrunn
mitokondrie-DNA (mtDNA) mutasjoner er rapportert i ulike svulster. Det er imidlertid ingen informasjon om timelige utviklingen av mtDNA mutasjoner /content endring og omfang i normal og unormal slimhinne kontinuerlig utsatt for tobakksrøyk i lungekreftpasienter.
Metodikk
Vi undersøkte mønsteret av mtDNA endring (mtDNA mutasjon og innholdsfortegnelse) i 25 luftveisslimhinne biopsier, tilsvarende svulster og normale lymfeknuter hentet fra tre pasienter med primær lungekreft. I tillegg, undersøkte vi mønsteret av mtDNA mutasjon i tilsvarende tumorer og normale lymfeknuter oppnådd fra åtte andre pasienter med primære lunge cancer. Hele 16,5 kb mitokondrielle genom ble sekvensert på Affymetrix Mitochip v2.0 sekvense plattformen i hver prøve. For å undersøke mtDNA innhold indeks, vi utførte real-time PCR-analyse.
hovedfunnene
De luftveisslimhinne biopsier hentet fra tre lungekreftpasienter var histopathologically negativ, men viste flere klonale mtDNA mutasjoner påvisbare i tilsvarende svulster. En av pasientene ble kjørt to ganger for fjerning av tumoren fra det høyre øvre og venstre nedre flik henholdsvis innenfor en periode på to år. Begge disse svulstene utstilt tjue identiske mtDNA mutasjoner. MtDNA innholdet økt signifikant (P 0,001) i lungekreft og alle histologisk negative slimhinnebiopsi unntatt én i forhold til kontroll lymfeknute
Konklusjon /Betydning:.
Våre resultater dokumentere omfanget av massive klonale flekker som utvikler seg i levetid røykere og til slutt gir opphav til klinisk signifikant kreft. Disse observasjonene belyse omfanget av sykdom i luftveiene av røykere sporbare gjennom mtDNA mutasjon. MtDNA mutasjon kan være et pålitelig verktøy for molekylær vurdering av respiratorisk epitel utsettes for kontinuerlig røyk samt sykdom deteksjon og overvåking. Funksjonell analyse av sykdomsfremkallende mtDNA mutasjoner kan være nyttig for å forstå sin rolle i lunge tumorigenesis
Citation. Dasgupta S, Yung RC, Westra WH, Rini DA, Brandes J, Sidransky D (2009) Etter MITOKONDRIELLE Footprints gjennom en lang slimhinnene Sti til lungekreft. PLoS ONE 4 (8): e6533. doi: 10,1371 /journal.pone.0006533
Redaktør: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, USA
mottatt: May 16, 2009; Godkjent: 06.07.2009; Publisert: 6. august 2009
Copyright: © 2009 Dasgupta et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av EDRN tilskuddet UO1CA084986. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
den menneskelige mitokondrie DNA (mtDNA) er en 16,5 kb dobbel strandet lukket sirkulært molekyl som koder for 12S og 16S rRNAs, 22 tRNAs og 13 proteiner viktig for den mitokondrielle luft kompleks [1] – [2]. De fleste menneskelige celler inneholder hundrevis av kopier av mitokondrie-DNA (mtDNA) og nesten alle disse mtDNA kopiene er identiske dvs. homoplasmic ved fødselen [1] – [2]. Mutasjonsraten i mtDNA er ca 10 ganger høyere enn atom genomisk DNA (nDNA) [1]. Hittil har klonale mtDNA mutasjoner blitt rapportert i ulike svulster [3]. Det er lite informasjon om den tidsmessige utviklingen av disse mutasjonene og omfang i normal og unormal slimhinne utsatt for tobakksrøyk.
Lungekreft dreper mer enn 1 million mennesker over hele verden med røyking er den viktigste risikofaktoren [4] . I USA var det over 215,020 tilfeller av lungekreft og en estimert død 161 840 i 2008 [4]. Til tross for betydelig forbedring i terapeutiske fremgangsmåter, inkludert kirurgi, platinabasert kjemoterapi og radioterapi alene eller i kombinasjon, er den samlede 5 års overlevelse bare 15% [4]. Åttifem prosent av lungekrefttilfellene oppstår i tobakksrøykere [4]. Videre berørte pasienter forblir betydelig risiko for utvikling av andre primærtumor i hele sin levetid. Dermed utvikling av egnede metoder for tidlig deteksjon, overvåking og løpende vurdering av luftveiene hos pasienter med primær lungekreft er av avgjørende betydning.
I denne studien har vi undersøkt mønsteret av mtDNA endring (mutasjon og DNA innhold) i luftveisslimhinne biopsier hentet fra følge opp pasienter med primær lungekreft. Tilsvarende svulster og normale lymfeknuter ble også undersøkt fra disse pasientene. Alle biopsier dukket mistenkelig og unormal etter auto-fluorescens bronkoskopi, men de var histologisk negative. Men kartet av mtDNA endringer i disse biopsier var slående, og gitt en unik innsikt i omfanget av mitokondriell dysfunksjon og økt risiko for malignitet hos pasienter som fortsetter å røyke.
Resultater
Mønster mtDNA mutasjon i pasienter
Figur 1 viser mønsteret av mtDNA mutasjoner i pasient 1. Denne pasienten ble operert to ganger i løpet av en periode på to år på begge lungene. Den første svulsten (T1) ble kirurgisk fjernet i 2002 fra det høyre øvre flik, etterfulgt av fjerning av den andre tumor (T2) i 2004 fra den venstre nedre flik. Fem luftveisslimhinne biopsier ble tatt fra hoved carina (M1), høyre nedre (M2 og M3) og venstre øvre lobe (M4 og M5) som omgir den primære svulsten områder på begge lungene som avbildet. De slimhinne biopsier ble tatt under oppfølging av denne pasient etter kirurgisk fjerning av andre svulst fra venstre nedre lobe. Alle fem slimhinnebiopsi var histopathologically uten bevis av dysplasi, og likevel et spekter av 3-11 mtDNA mutasjoner (Fig. 1). Totalt 16 mtDNA mutasjoner ble detektert i slimhinnene i denne pasient. Den første biopsi fra hoved carina utstilt 3 mtDNA mutasjoner (M1, Fig. 1a). Den andre biopsi utstilt 5 mutasjoner inkludert 2 overlappende mutasjoner med M1 (
A2249C
,
A8341C
, matchet fargen, Fig. 1A-B). Den tredje biopsi viste 7 mtDNA mutasjoner, inkludert 3 overlappende mutasjoner med M2 (
A3742C
,
G8836C Hotell og
T15982G
, matchet fargen, Fig. 1B-C). Den fjerde biopsi næret 7 mtDNA mutasjoner, inkludert overlappende mutasjoner med M3 (
A3742C
,
T3756C
,
G6035C
,
G8836C Hotell og
T15402A
, matchet fargen, fig. 1A-D), M2 (
A3742C
,
A8341C Hotell og
G8836C
, matchet fargen, fig. 2B og D) og M1 (
A8341C
, matchet fargen, fig. 1A-D). Den biopsi tatt ved siden av svulst i venstre nedre flik utstilt 11 mtDNA mutasjoner inkludert overlappende mutasjoner med M1 (
A2249C
,
T2516C Hotell og
A8341C
), M2 (
A2249C
,
A8341C
,
G8836C Hotell og
T15982C
), M3 (
C4014A
,
G8836C Hotell og
T15982G
) og M4 (
A8341C Hotell og
G8836C
) biopsier (fig. 1A-E, matchet farge). Begge invasive svulster (T1 og T2) viste 20 identiske mtDNA mutasjoner, inkludert alle de 16 mutasjoner påvist i de omkringliggende fem normal slimhinne (Fig. 1E-F) (Odds ratio 6,9 × 10
10:01). Tretten av disse 20 (65%) mutasjoner var i kodende regioner (COI, COII, ATP6, ND1, ND4 og CYTB) og 7 (35%) oppsto i ikke-kodende regioner (12SrRNA, 16SrRNA, tRNA-lysin, D-løkke ) (fig. 1, F, bunn rektangel). De ytterligere 4 mutasjoner som detekteres i tumorene var representert i fig. 1E (Bottom rektangel, svart, understreket). To (
G8836C Hotell og
A8341C
) til tre mtDNA mutasjoner (
A2249C
,
A3742C Hotell og
T15982G
) var til stede i 4/5 og 3/5 mucosa henholdsvis og i begge tumorer (fig. 1). Representative histologiske mikrofotografier av slimhinnen og tumor er vist i fig. 1A og 1F. Ulike fargekoder tilsvare en bestemt mutert mtDNA mønster som viser klonal spredning av mtDNA mutasjon hele slimhinner og til slutt gitt opphav til de genetisk relaterte svulster (Omkranset).
Pasienten ble operert to ganger på 2002 og 2004 med fjerning av svulster fra det høyre øvre (T1) og venstre nedre flik (T2) respektivt. Fem bronchoscopically unormale luftveisslimhinne biopsier ble oppnådd etter andre kirurgi (T2) i denne pasient fra hoved carina (M1), høyre øvre lobe (M2 og M3) og venstre nedre lobe (M3 og M4) som omgir både svulster som avbildet (panel A -E). De mukosale biopsier viste et område på 3-11 mtDNA mutasjoner som representert i forskjellig farge (panel A-E). Identiske mutasjoner er vist i samme farge i forskjellige biopsier og svulsten. En annen fargekode ble også anvendt for hver mucosa for å indikere den klonale progresjon av lesjonene på begge lungene med akkumulerte mtDNA mutasjoner. Representant histologisk mikrofotografi av slimhinnen og svulsten har vært vist i panel A og F. Både svulster T1 og T2 utstilt tjue identiske mtDNA mutasjoner (E-F, Bottom rektangel) inkludert alle de 16 mutasjonene utstilt ved de fem slimhinne biopsier (Matchet farge). De ekstra 4 mtDNA mutasjoner påvist i svulstene er representert understreket i svart farge i bunnen rektangel (Panel E-F). To mtDNA mutasjoner (
G8836C Hotell og
A8341C
) var til stede i 4/5 og 3 andre mutasjoner (
A2249C
,
A3742C Hotell og
T15982G
) var til stede i 3/5 slimhinne biopsier. Svulster er omkranset å indikere deres utvikling fra de klonale slimhinne patcher. T1: Tumor fra høyre øvre lobe; T2: Tumor fra venstre nedre lobe; M:. Slimhinner
Pasienten ble operert på 2005 for kirurgisk fjerning av svulst fra høyre øvre lobe. Fem bronchoscopically unormale luftveisslimhinne biopsier ble hentet fra hoved carina (M1), høyre nedre lapp (M2 og M3) og høyre øvre lobe (M3 og M4) som omgir svulster som avbildet (panel A-E). De mukosale biopsier viste et område på 2-5 mtDNA mutasjoner som representert i forskjellig farge (panel A-E). Identiske mutasjoner er vist i samme farge i forskjellige biopsier og svulsten. En annen fargekode ble også anvendt for hver mucosa for å indikere den klonale progresjon av lesjonene med akkumulerte mtDNA mutasjoner. Representant histologisk mikrofotografi av svulsten og normal slimhinne er vist i panel A og D. kreft utstilt 9 mtDNA mutasjoner (representert i bunnen rektangel) inkludert alle de 8 mutasjoner utstilt ved de fem slimhinne biopsier (Matchet farge). En ekstra mtDNA mutasjon (
T7001C
) oppdaget i svulsten er understreket i sort i bunnen rektangelet. Tumor ble omringet å vise sin utvikling fra de klonale slimhinne patcher. M:. Slimhinner
I pasient 2 ble fem slimhinne biopsier hentet fra hoved carina (M1), høyre nedre lapp (M2 og M3) og høyre øvre lobe (M3 og M4) som omgir den primære svulst på høyre lunge som vist i figur 2. Alle de 5 lesjonene var histopathologically normal som sett i en pasient, men et spekter av 2-8 mtDNA mutasjoner. Den første lesjon utstilt 2 mutasjoner der som den andre utstilt tre med en identisk mutasjon delt med M1 (
A10995C
, Fig. 2A-B, matchet fargen). Den tredje lesjon (M3) utviste 3 mtDNA mutasjoner med en overlappende mutasjon med M2 (
A14917C
) og M1 (
G8836C
) (Fig. 2A-C, matchet fargen). I den fjerde lesjon (M4), ble 3 mutasjoner påvises med en overlappende mutasjon (
G8836C
) med M3 og M1 (Fig. 2A-D, matchet fargen). Den femte mucosal lesjon (M5) viste 5 mutasjoner inkludert overlappende mutasjoner av M4 (
A3984C Hotell og
G8836C
), M3 (
A6831C
,
G8836C
og
A14917C
), M2 (A14917C) og M1 (
G8836C
) (fig. 2A-E, matchet fargen). Den primære svulst resected fra høyre øvre flik av denne pasient utstilt 9 mtDNA mutasjoner, inkludert alle de 8 mutasjoner påvist i de omkringliggende 5 tilsynelatende normal slimhinne prøver. Alle disse mutasjonene (9/9) var i mitokondrie kodende områder (ND1, COI, ATP6, ND4, ND5 og CYTB) av mtDNA (Fig. 2E, bunn rektangel). Den ekstra mutasjon (
T7001C
) oppdaget i svulsten er vist i Figur 2E (Nederst til høyre rektangel, svart, understreket). En mtDNA mutasjon (
G8836C
) var til stede i 4/5 og en annen mutasjon (A14917C) var til stede i 3/5 slimhinne vevsprøver (Fig. 2). Begge disse mutasjoner ble også påvist i tilsvarende tumor (fig. 2E). Representative histologiske mikrofotografier av slimhinnen og svulsten er vist i fig. 2A og E). Forskjellige fargekoder tilsvarer en bestemt mutert mtDNA mønster som viser klonal spredning av mtDNA-mutasjonen i hele mucosa, og til slutt gitt opphav til genetisk relaterte tumor (Encircled). Fire mtDNA mutasjoner (
G8836C
,
T3756C
,
A3984C Hotell og
A7251C
) var identiske blant pasienter 1 og 2 (Fig. 1-2) .
Pasient 3 var en ikke-røyker med en bronchoalveolar carcinoma og utstilt bare to mtDNA mutasjoner i tumor (tabell 1). Ingen mutasjoner ble detektert i normal slimhinne. En margin med metaplasi fra denne pasienten heller ikke viser noen mtDNA mutasjon (tabell 1). Disse resultatene tyder på en fundamental forskjell i feltet cancerization og omfanget av klonal patcher blant en ikke-røyker svulst. Vi sekvensert 8 andre pasienter for mtDNA mutasjon og funnet en rekke 1-9 mutasjoner i primære tumorer sammenlignet med kontrollen, hvorav de fleste var fra de kodende regioner av mtDNA (tabell 2). Annet enn somatiske mtDNA mutasjoner, vi også oppdaget noen kjønnsceller mtDNA sekvensvarianter i svulstene og tilsvarende slimhinne biopsier av alle pasientene (Tabell 3).
Endring av mtDNA innhold i lungekreftpasienter
Vi utførte kvantitativ real-time PCR for å bestemme mtDNA innhold i pasientens slimhinner, tilsvarende svulster, og ikke-neoplastiske lymfeknuter. Med bare en eneste unntaket i en biopsi (Pasient 1, M1) mtDNA innhold var signifikant høyere (P 0,001), lungekreft og alle de histologisk normale slimhinne biopsier sammenlignet med kontrollen lymfeknute (Fig. 3). Dette var også til stede i slimhinnen og metaplastiske margin identifisert i pasient 3, den ikke-røyker (fig. 4). MtDNA-innholdet ble øket uten en tilsvarende mtDNA mutasjon (fig. 4). Dermed er økt mtDNA innhold en funksjon i omfattende slimhinne felt fra både røykere og ikke-røykere lungekreftpasienter.
mtDNA innhold ble målt ved multiplex real-time PCR ved hjelp av kjernekraft kodet β-aktin og mitokondrier kodet COI genet . Et forhold på Coi /β p-aktin tilsvarer ganger forskjell sammenlignet med kontrollen. MtDNA-innhold økt betraktelig (P 0,001) i de mucosale biopsier og tilsvarende tumorer sammenliknet med normal kontroll i begge pasienter som angitt. N: Normal lymfeknute; M: Slimhinner; T: Tumor. * P-verdi. 0,05 sammenlignet med normal lymph node
mtDNA-innhold økt betraktelig (P 0,05) i slimhinnene (M), ved normal (NT) og i den metaplastiske margin (MT) sammenlignet med normal lymfeknute brukt som kontroll.
Diskusjoner
mitokondrie-DNA mutasjoner er hyppig i ulike tumortyper [3], og oppdaget i preneoplastiske lesjoner og dermed indikerer deres forekomst på tidlige stadier av flertrinns tumorprogresjon [5]. Påvisning av mtDNA mutasjon er enklere og mer pålitelig i forhold til kjerne-DNA på grunn av deres høye kopiantall i kreftceller [6] – [7]. Derfor gransker mtDNA mutasjoner i et lite antall celler på ulike stadier av tumorprogresjon er mulig. For å kunne bruke mtDNA mutasjon som en objektiv verktøy for deteksjon av klonale cellepopulasjoner, er sekvensering av hele mitokondrie genome nødvendig og må gjøres sammen med en passende ikke-neoplastisk kontroll på grunn av den sterkt polymorfe natur av mtDNA [7]. I denne studien, forsterkning av betydelig mengde mtDNA fra svært små slimhinne biopsier, svulst og tilhørende normalt vev mulig for oss å skanne hele mitokondrielle genomet. Dette ble lett oppnådd på Affymetrix høy gjennomstrømning Mitochip v2.0 sekvense plattformen tidligere vist seg å være et pålitelig verktøy for detektering av mtDNA-mutasjonen [5], [8]. Denne siste versjonen av Mitochip (I forhold til Mitochip v1.0) ikke bare har en høy sensitivitet for påvisning mutasjon som spenner over hele mitokondrielle genomet, men også i stand til å bestemme heteroplasmic mtDNA-mutasjonen [8] – [9]. Den observerte mutasjonen kan også bekreftes ved konvensjonell sekvensering. Imidlertid kan Mitochip v2.0 ikke oppdager liten innsetting /sletting som det er først og fremst utviklet for å oppdage mtDNA mutasjon. Mutasjonene som detekteres i denne undersøkelsen var somatiske eller spire linje i naturen og bekreftet som ikke på grunn av noen haplotypic variasjon [5], [8] – [9]. Således er alle de novo mutasjonene detektert og rapportert i denne studien assosiert med tumoren fenotype.
i pasient 1, ble det observert små oppfølging biopsier tatt fra områder av luftveis slimhinnen som fremkom, unormal henhold autofluorescens-bronchoscopy. Selv om alle biopsier var histopathologically negative og uten dysplastiske forandringer, viste de flere mtDNA mutasjoner noen som ble delt over store spor av luftveisepitelet. Disse resultatene demonstrerer den klonale spredningen av flere mtDNA mutasjoner i luft mucosa. Klonal spredning av p53 mutasjoner og mikro endringer (LOH og MA) ved multiple foki i normal vises bronkialepitelet er blitt rapportert tidligere [10] – [12]. I denne studien, dramatisk utvidelse av muterte bronkial epitel kloner var sporbar gjennom mtDNA mutasjon med stor presisjon og på en objektiv måte ved å sekvensere hele mitokondrielle genomet i hver prøve.
Det er sannsynlig at biopsier inneholdt heterogene lapper av celler med klonal endringer ervervet ved tilfeldig mitokondrie genetisk drift [7]. Som i pasient 1, det meste av klonene delt et antall identiske mtDNA mutasjoner sammen med flere mutasjoner er nødvendig for klonal ekspansjon (fig. 5). De sprekeste kloner mer fordelaktige mtDNA /nDNA mutasjoner kommet gjennom slimhinnen og til slutt ga opphav til to tilsynelatende uavhengige primære svulster som likevel helt sikkert knyttet sammen av identiske mtDNA mutasjoner [7], [13]. Påvisning av alle slimhinnene mtDNA mutasjoner i både svulster resected innenfor et spenn på 2 år støtter sterkt deres klonal opprinnelse. Videre har vi også vist at de to separate svulster fra motsatt lungene utstilt flere identisk mtDNA mutasjoner; oddsen for denne forekomsten av sjansen er forsvinnende lave. Den første svulsten sannsynligvis utviklet seg fra en av de mer dominerende kloner spredt på høyre lunge etter at anskaffe de nødvendige mtDNA /nDNA endringer er tilstrekkelige til å fremme tumorgenese. Den andre svulst trolig utviklet på samme måte på venstre lunge, men kjøpte nDNA mutasjonsVisninger flere måneder senere, eller på annen måte det kan muligens være en lungemetastaser. Dataene fra pasient 2 støtter også omfattende klonal spredning av mtDNA mutasjoner og påfølgende svulst utvikling etter anskaffe tilstrekkelig mtDNA og /eller nDNA endringer. En høyoppløselig genom bred analyse av disse biopsier og tilsvarende svulster avslørte klonal endring av en rekke sentrale nDNA kodede gener hos disse pasientene (upublisert observasjon) ytterligere støtter denne oppfatningen. Men på grunn av utilgjengelighet, vi kunne ikke undersøke mønsteret av mtDNA endring spektrum i et relativt stort antall pasienter.
Mulig klonal evolusjon av lungesvulster har blitt avbildet. Hver mucosal biopsi (innringet, M1-M5) delte noen identiske mtDNA mutasjoner (Matchet farge) sammen med flere mutasjoner i heterogene slimhinne feltet. De sprekeste kloner dukket opp i de primære tumorer (T1-T2) med mer selektive mtDNA mutasjoner (Totalt 20 mtDNA mutasjoner, 16 ble delt mellom M1-M5 som i figur 1).
Tilstedeværelsen av hyppig bakterie linje mtDNA sekvensvarianter ble foreslått som en indikator på en høy følsomhet genetisk bakgrunn som kan lette samtidig somatisk mutasjon i mtDNA og nDNA [14]. Påvisning av klonal kjønnsceller sekvensvarianter og samtidige somatiske mtDNA mutasjoner i svulster og slimhinnene i lungekreftpasienter støtter sterkt opp denne forestillingen.
Patogene mtDNA mutasjoner kan tyde på for deres funksjonelle bidrag i utviklingen av svulster. Blant de mtDNA mutasjoner observert hos disse pasientene, er koding G8836C (ATP6) mutasjon nylig rapportert hos pasienter med Leber arvelig optikusnevropati (LHON) -lignende syndrom og skjoldbrusk svulster [15] – [16]. Den arts bevaring av dette nucleotide er høy, og denne mutasjonen har blitt spådd å være sykdomsfremkallende [15]. Spesielt var dette mtDNA mutasjon påvises i 8/10 slimhinne biopsier og alle 3 svulster undersøkt fra både pasienter støtter en funksjonell bidrag i tumorigenesis. Imidlertid er ytterligere funksjonell analyse er nødvendig for å trekke en mer definitiv konklusjon. MtDNA mutasjon på samme nukleotid posisjon blant forskjellige lunge- og nyrekreftpasienter ble rapportert tidligere [16]. I lys av en sykdomsfremkallende /medvirkende mtDNA mutasjon, en bestemt mtDNA mutasjon syntes å ha blitt valgt i ulike krefttyper. Vi har gjort lignende observasjon i denne studien, og dermed forekomst av patogene G8836C og andre identisk mtDNA mutasjoner observert mellom forskjellige lungekreftpasienter er lite sannsynlig å være grunn til å prøve forurensning. Spesielt, G8836C patogene mtDNA mutasjon påvises i LHON og skjoldbruskkjertelkreft [15] – [16] og ofte i vår studie indikerer for en funksjonell rolle i lungekreft progresjon
De fleste av disse mutasjonene ble funnet i kodingen. regioner av mtDNA som eventuelt kunne føre til en forstyrrelse i luft komplekse og resultere i en økning av reaktive oksygen arter (ROS). Nyere studier har vist at mtDNA mutasjoner fører til en økning i ROS og fremme tumorcellevekst, proliferasjon og metastase [17] – [20]. En studie har vist en økning i mtDNA kopiantall i lungefibroblaster som en tidlig begivenhet i respons til oksidativt stress [21]. Nylig ble en økning i mtDNA innhold identifisert med aldring og røyking assosiert lunge-vev og primær hode og hals plateepitelkarsinom [22] – [23]. Histologisk negative slimhinnebiopsi samt svulster av både pasienter viste signifikant forhøyet nivå av mtDNA innhold. Dermed ser det ut til at med utviklingen av homoplasmic mtDNA mutasjon og klonal spredning, øker også mtDNA innhold. Av notatet, noen mutasjoner (inkludert
G8836C
) var identiske i både pasienter som var vanlige røykere, tyder på effekten av felles mål fra tobakk karsinogener på mtDNA. Den høye frekvensen av mtDNA mutasjoner blant røykerne antyder også en nøkkelrolle for tidlig mitokondrielle genetiske endringer i utviklingen av deres svulster.
I denne studien, klonal progresjon av histologisk normalt vises luft slimhinnen i svulsten var sporbar gjennom mtDNA mutasjoner. Dette er den mest definitive studier for å demonstrere at de 2 svulster i de motsatte steder i en pasient (pasient 1) er klonalt beslektet. Men vi kunne ikke undersøke mer følge opp pasienter på grunn av mangel på bio-prøver. Dokumentasjon av disse omfattende klonale populasjoner med mtDNA mutasjoner belyser utfordringene ved tidlig deteksjon tilnærminger. Videre rettet mot disse mtDNA mutasjoner kan være nyttig basert på molekylær deteksjon i spytt og blod DNA i chemoprevention tilnærminger og nye biologiske behandlingsformer. Videre funksjonell analyse av de vanligste mtDNA mutasjoner vil tillate oss å bedre forstå sin spesielle rolle i kreft progresjon og chemoresistance.
Materialer og metoder
Pasienthistorie og lunge prøver
tre oppfølgingslungekreftpasienter ble undersøkt for mtDNA mutasjon med signert informert samtykke i en Johns Hopkins IRB godkjent protokoll. Pasient 1 var en 75 år gammel kvinne som gjennomgikk en høyre øvre lobektomi i 2002 for et stadium IIB dårlig differensiert plateepitelkarsinom (T3N0MX). I 2004, hun gjennomgikk en venstre nedre lobektomi for en andre stadium IIB (T2N0MX) plateepitelkarsinom. Pasient 2 var en 58 år gammel mann, som i 2005 gjennomgikk en høyre øvre lobektomi for et stadium IA (T1N0MX) moderat differensiert plateepitelkarsinom. Begge pasientene var vanlige røykere for mer enn 10 år. Pasient 3 var en 48 år gammel kvinne som gjennomgikk en høyre øvre lobektomi for et stadium IA (T1N0MX) bronchioloalveolar karsinom. Denne pasienten var en ikke-røyker. Under oppfølging, ble luftveisslimhinne biopsier tatt fra områder mistenke for mild til moderat til alvorlig dysplasi eller carcinoma in situ (CIS) basert på Auto-fluorescens-Bronkoskopi (r.y. og J.B.). Alle biopsiprøver ble tatt på samme tid. Biopsier ble histologisk evaluert av en lunge patolog (W.H.W). De kirurgisk resected lungesvulster ble også hentet fra hver pasient. Som en kontroll ble matchet normal lymph node fri for tumor ble anvendt i hvert tilfelle. I tillegg har vi også sekvensert matchet normale og tumorvev fra 8 andre lungekreftpasienter (tabell 4).
Mitokondrie hele genomet forsterkning og sekvense
Genomisk DNA ble ekstrahert i henhold til vår standard protokoll fra microdissected tumorvev og andre prøver [5]. Vi forsterket hel mitokondrie-genomisk DNA fra 10 ng genomisk DNA som templat ved hjelp av Repli-g mitokondrisk DNA-amplifikasjon sett i overensstemmelse med produsentens protokoll som er beskrevet tidligere [8]. Det amplifiserte DNA ble deretter renset ved anvendelse av DNA MiniAmp Rens kit (Qiagen, Valencia). Vi undersøkte renheten av det amplifiserte mtDNA og nukleært DNA kontaminering ved PCR-analyse ved bruk av primer spesifikk for mitokondrier kodede COXI /COXII og atom kodet β-aktin. Fire til fem hundre nanogram renset mtDNA ble brukt for sekvensering på Affymetrix MitochipV2.0 plattformen [5], [8].
Mitochip v2.0 sekvense rekke analyse
Vi utførte fragmentering, merking og Chip hybridisering av mtDNA som per Affymetrix protokollen med nødvendige kontroller som beskrevet tidligere [5], [8]. Dataanalyse ble utført ved anvendelse Affymetrix GSEQ programvare og Revidert Cambridge Referanse Sekvens (RCRS) ble anvendt som referansesekvens [24]. Den MitoAnalyzer programvaren ble også anvendt for å verifisere de mtDNA mutasjoner ved forskjellige nukleotidposisjoner som beskrevet tidligere [5], [8] .Somatic mutasjoner ble identifisert som basepar-endring i mtDNA sammenlignet med normal mtDNA sekvens funnet i lymfeknuter uten svulst. Kjønnsceller mutasjoner ble identifisert som basepar-endring som er tilstede i de normale lymfocytter, så vel som tumor-vev og /eller margin sammenliknet med de RCRS [14]. En bakterie linjen sekvens varianten ble utpekt som ny når fraværende i den menneskelige mitokondrie-databasen og andre relevante studier i de samme haplogroups [14], [25]. Sequence varianter tidligere rapportert i ulike sykdommer, inkludert kreft er utpekt som sykdomsfremkallende [14], [25].
kvantitativ real-time PCR
For å undersøke mtDNA innhold, brukte vi 7900HT sekvens deteksjonssystemet (Applied Biosystems, Foster City, California) for å forsterke atom DNA (nDNA) kodet β-aktin og mtDNA kodet Cytokrom C oksidase i (COI) ved hjelp av genomisk DNA mal som beskrevet tidligere [26].
Statistisk analyse
Student
t
-test ble utført for å bestemme statistisk signifikans. P-verdi mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant. Alle P-verdier generert var tosidig.
Odds ratio
Oddsen for 20 tilfeldige identiske mtDNA mutasjoner som oppstår ved en tilfeldighet i to separate svulster lokalisert i motsatt lungene til samme pasient ble beregnet som [ ,,,0],(genomstørrelse) × (mutasjoner)] × [(genomstørrelse) × (mutasjoner)] altså [16,499:1 × 20] × [16,499:1 × 20] = 6,9 × 10
10:01 [27].
