Abstract
Tidligere studier antydet Ataxia-telangiectasia gruppe D utfyller genet (ATDC) som et onkogen i mange typer kreft. Men dens uttrykk og biologiske funksjoner i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er fortsatt uklart. Heri undersøkte vi uttrykket mønster i 109 tilfeller av human NSCLC prøvene ved immunhistokjemi og funnet ut at ATDC ble overuttrykt i 62 av 109 NSCLC prøver (56,88%). ATDC overekspresjon korrelert med histologisk type (p 0,0001), tumor status (p = 0,0227) og histologisk differensiering (p = 0,0002). Deretter overexpressed vi ATDC i normal menneskelig bronkial epitelcellelinje HBE og utarmet sitt uttrykk i NSCLC cellelinjer A549 og H1299. MTT og kolonidannelse analyse viste at ATDC overekspresjon fremmet celleproliferasjon mens dens uttømming hemmet cellevekst. Videre viste cellesyklusanalyse som ATDC overekspresjon redusert prosentandelen av celler i G1 fase og økte prosentandelen av celler i S-fasen, mens ATDC siRNA behandlingen økte G1 faseprosent og redusert S-fasen prosent. Videre studier viste at ATDC overekspresjon kan opp-regulerer cyclin D1 og c-myc uttrykk i HBE celler mens uttømming nedregulert cyclin D1 og c-myc uttrykk i A549 og H1299 celler. I tillegg ble ATDC overekspresjon også forbundet med en økt spredning indeks, cyklin D1 og c-Myc-ekspresjon i humane NSCLC prøver. Ytterligere eksperimenter viste at ATDC oppregulert cyclin D1 og c-myc ekspresjonen uavhengig av Wnt /β-catenin eller p53 signalveien. Interessant, ATDC overekspresjon økt NF-kB reporter luciferaseaktivitet og p-IkB proteinnivå. Tilsvarende blokkerte NF-kB hemmer virkningen av ATDC på oppregulering av cyclin D1 og c-Myc. I konklusjonen, viste vi at ATDC kan fremme kreft spredning lunge gjennom NF-kB indusert oppregulering av cyclin D1 og c-myc
Citation. Tang ZP, Dong QZ, Cui QZ, Papavassiliou P, Wang ED Wang EH (2013) Ataxia-Telangiectasia Gruppe D utfyller Gene (ATDC) Fremmer Lung Cancer Cell Proliferation ved å aktivere NF-kB Pathway. PLoS ONE 8 (6): e63676. doi: 10,1371 /journal.pone.0063676
Redaktør: Giuseppe Viglietto, Universitetet Magna Graecia, Italia
mottatt: 15 november 2012; Godkjent: 07.04.2013; Publisert: 12 juni 2013
Copyright: © 2013 Tang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (tilskudd 81071905 og 81272606). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
lungekreft er en av de viktigste årsakene til alle kreftdødsfall over hele verden, og i særdeleshet ikke-små-celle lungekreft (NSCLC) utgjør størstedelen av diagnostiserte tilfeller [1], [2] . Av flere faktorer, inkludert genetisk, epigenetisk og microenvironmental, spiller viktige roller i overlevelse og koloniseringen av tumorceller på et fjernt område vev, som fører til metastase [3]. Men til tross for mange eksperimentelle studier, en underliggende molekylære mekanismen som styrer metastasering av enkelte svulster er ennå ikke fullt ut forstått. På grunn av begrenset suksess for konvensjonell terapi i å oppnå en langsiktig overlevelse i lungekreftpasienter, har forskningen vært fokusert på de biologiske veier som er involvert i tumorprogresjon og neoplastiske celle overlevelse for å identifisere potensielle terapeutiske mål [4].
Ataxia-telangiectasia gruppe D utfyller genet (ATDC) er et medlem av den tredelte motiv (TRIM) familie [5]. TRIM proteiner har typisk en rekke konserverte domener inkludert flere sinkfingermotiv og et leucin zipper motiv. Disse proteiner er blitt vist å delta i cellevekstregulering og utvikling, og har vært implisert i en rekke humane sykdommer så som HIV-infeksjon og leukemi [6], [7]. Særlig TRIM proteiner som TRIM8, TRIM22, TRIM38 og TRIM40 har blitt rapportert til å drive regulere NF-kB-aktivering [8] – [11]. ATDC, også kjent som TRIM29, ble først identifisert i et søk etter genet er ansvarlig for genetisk lidelse ataksi-telangiectasia og ble funnet å ha Radiosensitivity suppressor funksjoner [12]. Etterfølgende studier viste at ATDC ble overuttrykt i flere typer kreft, inkludert pankreatisk, mage, blære, kolorektal, eggstokk og livmorkreft, så vel som i plasmacelle myelom [13] – [21]. Mens, dets ekspresjon var tilsynelatende redusert i flere andre tumorer, slik som melanom, bryst, prostata, hode- og nakkekreft [22] – [27]. Bare én rapport beskrevet økt ATDC mRNA uttrykk i forbindelse med høy histologisk grad, stor svulst størrelse, omfang av tumorinvasjon og lymfeknutemetastase i magekreft [15]. Men til vår beste kunnskap, protein uttrykk for ATDC og sitt forhold til clinicopathological faktorer i primær lungekreft har aldri blitt karakterisert.
En fersk studie i bukspyttkjertelen adenokarsinom cellelinje vist at ATDC samhandler med bustete -2 og komponentene i β-catenin ødeleggelse komplisert å stabil β-catenin og aktivere wnt signalering, en viktig vei som fremmer tumorprogresjon i mange typer kreft [13]. Andre studier antydet at ATDC binder p53 i cytoplasma beslaglegging den fra kjernen fører til nedregulering av dens target-genet p21 [28]. I A431 humane plateepitel carcinom-cellelinje, ble ATDC kjent for å interagere med de mellomliggende filamentprotein vimentin og med en hemmer av proteinkinase C, for derved å virke som en komponent av proteinkinase C signaltransduksjonsbane [29]. Alt i alt har disse tidligere studiene tyder på at ATDC kunne fungere som en onkogen for å fremme cancer celleproliferasjon og invasjon. Men de biologiske roller ATDC i lungekreftceller har ennå ikke blitt fastslått.
For å løse de ovennevnte spørsmålene, vi sjekket ATDC uttrykk og vev distribusjon i ikke-småcellet lungekreft ved immunhistokjemi og analysert sin tilknytning til clinicopathological parametere. Vi har også undersøkt rollene ATDC på celleproliferasjon og cellesyklusprogresjon ved hjelp av gevinst-eller tap-av-funksjon tilnærminger. Enda viktigere, vi utforsket potensialet mekanismen som ATDC funksjoner for å fremme spredning av lungekreft celler.
Metoder
Pasienter og Prøvene
Denne studien ble gjennomført med godkjenning av Institutional Review board i Kina Medical University. Skriftlig samtykke ble gitt av deltakerne for informasjon som skal lagres i sykehus database for de prøver som skal anvendes i denne studien. Og all klinisk undersøkelse har blitt gjennomført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen. Den primære kreftprøver ble samlet inn fra 109 pasienter med plateepitelkreft (SCC) eller adenokarsinom i lungene som gjennomgikk komplett kirurgisk reseksjon i First Affiliated Hospital of China Medical University mellom 2001 og 2004. Stor cell carcinoma, adenosquamous cellekreft eller annen NSCLC subtyper ble ekskludert fra denne studien. Oppfølging informasjonen ble innhentet ved å gjennomgå pasientenes journaler. Ingen av pasientene hadde fått strålebehandling eller cellegift før kirurgisk fjerning, og alle pasienter ble behandlet med rutine kjemoterapi etter reseksjon. Alle 109 saker ble anmeldt for histologisk subtype, differensiering, og tumorstadium. Den histologisk diagnose og grad ble vurdert på haematoxylin og eosin-farget seksjoner i henhold til Verdens helseorganisasjon (WHO) retningslinjer for klassifisering. Av 109 tilfeller, 46 (42,2%) var SCC og 63 (57,8%) var adenokarsinom. Lymfeknutemetastaser ble funnet i 44 (40,4%) av de 109 pasientene. Den p-TNM staging system av International Union mot kreft (7th Edition) ble brukt til å klassifisere tilfellene.
Cell Culture and Treatment
NHBE, A549, H1299, H157 og H460 cellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). LH7 og LK2 cellelinjer ble kjøpt fra Shanghai Cell Bank of Chinese Academy of Science. Den BE1 cellelinjen ble gitt som en gave av Dr. J Zheng (Avdeling for patologi, Peking University School of Medicine). Den BE1 cellelinje ble etablert av Dr. J Zheng og Dr. WY Zhu i 1995, og nå kan kjøpes fra National Platform of Experimental Cell Resources for Sci-Tech (Peking, Kina). Celler ble dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) inneholdende 10% føtalt kalveserum. Cellene ble dyrket på sterile vev kultur retter og ble passert hver 2 dager med 0,25% trypsin (Invitrogen). NF-kB hemmer BAY 11-7082 (10 mikrometer, 6 timer) ble kjøpt fra Sigma Aldrich.
Immunohistochemistry
Kirurgisk skåret vevsprøver ble fiksert med 10% nøytral formalin, innstøpt i parafin og 4 um tykke seksjoner ble fremstilt. Farging ble utført ved hjelp av avidin-biotin-peroksidase kompleks metode (Ultra Sensitive TM, Maixin, Fuzhou, Kina). Snittene ble deparaffinized med xylen, rehydrert med gradert alkohol serie og kokt i 0,01 M citratbuffer (pH 6,0) i 2 minutter i en autoklav. Endogen peroksidaseaktivitet ble blokkert ved bruk av hydrogenperoksid (0,3%) før inkubering av seksjonene med normalt geiteserum for å redusere ikke-spesifikk binding. Vevssnitt ble deretter inkubert med ATDC kanin polyklonalt antistoff (1:150 fortynning) (cat.17542-1-AP, Proteintech, IL, USA). Kanin immunoglobulin (ved samme konsentrasjon av antigen spesifikke antistoff) (cat.NC-100, Maixin, Fuzhou, Kina) ble anvendt som en negativ kontroll. Immunhistokjemisk farging for Ki67 (1:200 fortynning) (cat.MAB-0129, Maixin, Fuzhou, Kina), c-myc (1:500 fortynning) (cat.ab32, Abcam) og cyclin D1 (1:100 fortynning) ( cat.2978, Cellesignalering signale~~POS=TRUNC teknologi, Boston, MA, USA) ble også utført i henhold til produsentens instruksjoner. Farging for alle primære antistoffer ble utført ved romtemperatur i 2 timer. Biotinylert geite-anti-mus-serum-IgG eller biotinylert geite-anti-kanin-serum IgG (klar til bruk) (cat.KIT-9922, Maixin, Fuzhou, Kina) ble anvendt som det andre antistoff. Etter vasking, ble seksjonene inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert streptavidin-biotin, etterfulgt av 3, 3′-diaminobenzidin tetrahydroklorid for å utvikle peroksidase-reaksjonen. Kontra ble gjort med hematoksylin, og delene var så dehydrert med etanol før de blir montert.
To etterforskere uavhengig evaluert alle kreft lysbilder. Fem tilfeldige felt ble undersøkt per lysbilde, og 100 celler ble evaluert per høy forstørrelse feltet (400 ×). Normal bronkialepitelet i tumorsnitt ble anvendt som en intern negativ kontroll. Farging av ATDC ble scoret etter en semi-kvantitativ skala ved å evaluere fargeintensitet og prosentandel av celler i representative tumorområder i forhold til det som ble observert i kontrollcellene. Positiv farging ble definert som en tydelig cytoplasmisk farging av tumorcellene. Intensiteten av ATDC cytoplasmatisk farge ble ytterligere stratifisert som 0 (ingen farging), 1 (svak) og 2 (sterk). Prosent skår ble utpekt som en (1-25%), 2- (26-50%), 3 (51-75%) og 4 (76-100%). Poengene for hver tumorprøve ble multiplisert for å gi en endelig score på 0-8 og det totale uttrykket av ATDC ble bestemt som enten negativ eller lav uttrykk (-), hvis den totale poengsummen var mindre enn 4, og som positivt uttrykk eller høy uttrykket (+), hvis den totale poengsummen var ≥4.
immunhistokjemisk farging for Ki-67 ble evaluert og scoret som prosentandel av de immunreaktive kreftceller, med totalt 500 kreftceller undersøkt per lysbilde. Medianverdien av denne serien (35%) ble anvendt som en terskelverdi for å stratifisere tumorene i gruppen med en lav ( 35%) indeks og en med en høy (≥35%) indeks på celleproliferasjon. Uttrykket av c-myc og cyclin D1 ble definert som høy grad av uttrykk eller lavt nivå i henhold til de tidligere kriteriene [30], [31].
Kvantitativ Real-time PCR (SYBR Grønn Method)
Kvantitativ real-time PCR ble utført ved anvendelse av SYBR grønn PCR masterblanding med et totalt volum på 20 ul i 7900HT Fast real-Time PCR System (Applied Biosystems). Reaksjonsbetingelsene er som følger: 95 ° C i 30 sekunder, 40 sykluser av 95 ° C i 5 sekunder og 60 ° C i 30 sekunder. En dissosiasjon trinn ble anvendt for å generere en smeltekurve for å bekrefte spesifisiteten til forsterkning. p-aktin transkripsjoner ble forsterket og fungerte som referanse. De relative nivåer av genekspresjon var representert som ΔCt = Ct-genet -Ct referanse, og folden endring av genekspresjon ble beregnet ved hjelp av 2-ΔΔCt metode. Forsøk ble utført in triplo
primer-sekvensene var som følger:.
β-aktin fremover, 5′-ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC-3 «, β-actin omvendt, 5′-CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3′ ; ATDC fremover, 5»-GCACCGGACACCATGAAGA-3 «, ATDC revers, 5′-GGAGACGAGGGCTGGTATGA-3».
Western Blot analyse
Totalt proteiner fra NSCLC vev og lungekreftcellelinjer ble hentet i lysis buffer (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) og kvantifisert ved hjelp av Bradford-metoden. Femti mikrogram protein ble separert ved SDS-PAGE (12%). Etter overføring, ble det polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner (Millipore, Billerica, MA, USA) inkubert over natten ved 4 ° C med følgende antistoffer: ATDC (1:1000; cat.17542-1-AP, Proteintech), β- aktin (1:500; cat.612657), β-catenin (1:1000; cat.610154) (BD Transduction Laboratories), cyclin A2 (1:1000; cat.4656S), cyclin D1 (1:1000; katt. 2978), cyclin E1 (1:800; cat.4129), CDK2 (1:1000; cat.2546), CDK4 (1:1000; cat.2906), CDK6 (1:1000; cat.3136), p- Rb (Ser807 /811) (1:2000; cat.8516), P21 (1:800; cat.2947), p-IKB (Ser32) (1:500; cat.2859) (Cell signale teknologi, Boston, MA , USA), c-myc (1:1000; cat.ab32, Abcam), aktiv β-catenin (1:500; cat.05-665, Millipore), p65 (1:500; sc-8008, Santa Cruz) . Etter inkubering med peroksidase-koblet anti-mus (cat.sc-2005) eller kanin (cat.sc-2004) IgG (Santa Cruz Biotechnology) ved 37 ° C i 2 timer, ble bundne proteiner visualisert ved bruk av ECL (Thermo Fisher Scientific) og kvantifisert ved hjelp Bioimaging Systems (UVP Inc., Upland, CA, USA). De relative proteinnivåer ble beregnet i referanse til p-aktin som lasting kontroll.
Plasmid Transfeksjon og små interfererende RNA Behandling
pCMV6-ATDC plasmid ble kjøpt fra Origene. pCMV6 tom vektor ble anvendt som en negativ kontroll. On-target pluss sirnas for ATDC (M-012409-01) og ikke-måls siRNA # 1 (D-001810-01) ble kjøpt fra Dharmacon (Lafayette, CO, USA). Plasmidet og siRNA ble transfektert inn i cellene ved anvendelse av Attractene Transfeksjon reagens (Qiagen, Hilden, Tyskland). I korthet ble cellene sådd ut i en 6-brønners plate 24 timer før forsøket. De mRNA og proteinnivåer ATDC ble bestemt 48 timer etter transfeksjon.
Cell Proliferation Test og Colony Forming analyse
Celleproliferering Analysen ble utført ved hjelp av Cell Counting Kit-8-løsning (Dojindo, Gaithersburg, MD) i henhold til produsentens protokoll. I korthet ble cellene sådd ut i en konsentrasjon på 5 x 10
3 celler /100 ul /brønn i 96-brønners kulturplater og behandlet med 10 ul /brønn av celletellingsleder-8-løsning i løpet av de siste 4 timene av kulturen . Optisk tetthet av brønnene ble målt ved 450 nm bølgelengde ved anvendelse av en mikroplateleser.
For kolonidannelsesbestemmelsen,-celler ble satt opp i tre 6 cm cellekulturskåler (1 x 10
3 celler pr tallerken ) og inkuberes i 12 dager. Platene ble vasket med PBS og farget med Giemsa. Antallet kolonier med mer enn 50 celler ble telt.
Cell Cycle Analysis
Cells (5 × 10
5) ble sådd på en 6 cm vev kultur parabolen. Etter 12 timers inkubering ble cellene behandlet med serum sult i 24 timer før transfeksjon med angitte doser av plasmider eller siRNA. Ved de angitte tidspunkter ble cellene høstet, fiksert i 1% paraformaldehyd, vasket med fosfatbufret saltvann (PBS) og farget med 5 mg /ml propidiumjodid i PBS supplert med RNase A (Roche, Indianapolis, IN) i 30 minutter ved romtemperatur. De fargede celler ble samlet opp og analysert ved hjelp av strømningscytometri BD systemer
Luciferase Assay Reporter
reportergen transfeksjon og luciferase aktivitetsanalyse ble utført som følger:.-Celler i konfluent vekst på en 24 brønners plate ble ko-transfektert med ildflue luciferase reporter (0,2 ug) sammen med Renilla luciferase reporter (Promega Co.) (0,02 ug) i 12 timer ved bruk av en attractene reagens (Qiagen) ifølge protokollene gitt av produsentene. De reporter plasmider fra TOP /FLASH, p53 og NF-kB ble kjøpt fra BioTime bioteknologi, Kina. Luciferase-aktiviteten ble målt i cellulære ekstrakter ved bruk av en dobbel luciferase-gen rapportert assay kit (Promega, CA, USA). Den relative aktivitet av reportergenet ble beregnet ved å dividere signalene fra ildflue luciferase reporter av de signaler som oppnås fra Renilla luciferase reporter.
Statistical Analysis
SPSS versjon 16.0 for Windows ble brukt for alle statistisk analyser. The Chi-squared test ble brukt for å undersøke mulige sammenhenger mellom ATDC uttrykk og clinicopathologic faktorer. Den t-test ble brukt for å teste forskjellen mellom gruppene og p-verdiene var basert på tosidig statistisk analyse, med en p-verdi på 0,05 utpeke statistisk signifikans
Resultater
Overuttrykte ATDC protein i ikke-småcellet lungekreft Vev og dens forhold til Clinicopathological Faktorer
for å undersøke ATDC protein nivåer i lungekreft, vi undersøkte ATDC uttrykk i et panel av 109 NSCLC prøvene og 20 sammen homologe normale lunge vev ved hjelp av immunhistokjemi. Overekspresjon av ATDC ble notert i 62 (56,88%) av 109 NSCLC-prøver, og den ATDC protein ble primært lokalisert i cytoplasma av tumorceller (figur 1C-F). Ingen eller svak flekker signaler ble påvist i normal lunge vev og normal bronkial epitel ved siden av svulsten (figur 1A-B).
A. Negativ farging i normale pneumocytes i alveolene av ikke-neoplastisk lungevevet. B. Negativ farging i normal bronkiale epitel i ikke-neoplastisk lungevevet. C. Negativ ATDC flekker i lunge adenokarsinom. D. Svak ATDC flekker i lunge adenokarsinom. E. Svak ATDC flekker i lunge plateepitelkarsinom. F. Sterk ATDC flekker i lunge plateepitelkarsinom.
Forholdet mellom ATDC uttrykk og flere clinicopathologic parametere ble også analysert. Som vist i tabell 1, ble det observert en signifikant sammenheng mellom ATDC overekspresjon og omfanget av den primære tumor (T1 T2 versus-T4:42.11% mot 64,79%, p = 0,0227), histologiske differensiering (vel differensiering sammenlignet med moderat /dårlig differensiering: 31,43% mot 68,92%, p = 0,0002) og histologiske typer (plateepitelkarsinom versus adenokarsinom: 97,83% versus 26,98%, p 0,0001). Ingen statistisk signifikant forskjell ble funnet mellom ATDC overekspresjon og pasientens alder (p = 0,5449), kjønn (p = 0,3696), lymfeknutestatus (p = 0,2327) eller TNM stadium (p = 0,5085).
ATDC Fremmer Cell Proliferation i Lung Cancer Cell Lines
uttrykk for ATDC ble analysert ved real-time PCR og Western blot analyser i et panel av lungekreftcellelinjer og i en normal bronkial epitelcellelinje HBE (figur 2aeller B). Vi har funnet at både ATDC mRNA og protein uttrykk nivåer i NSCLC-cellelinjer som var mye høyere enn det i HBE, særlig i A549 og H1299 cellelinjer. For å undersøke en mulig rolle ATDC i cellevekst av lungekreft, transfektert vi en ATDC cDNA uttrykk konstruere inn HBE celler og anvendt en pool bestående av tre ATDC-målretting sirnas til knockdown ATDC uttrykk i både A549 og H1299 celler (Figur 2C-D). HBe-celler viste en betydelig økning i ATDC uttrykk etter ATDC transfeksjon, mens ATDC-spesifikke siRNA effektivt blokkert ATDC ekspresjon i A549 og H1299 cellelinjer.
A. mRNA uttrykk nivåer av ATDC analysert ved real-time PCR i et panel av lungekreftcellelinjer. Legg merke til den høyeste ekspresjon observeres i A549-cellelinjen, og den laveste er sett i HBE celle. B. protein ekspresjonsnivåene av ATDC analysert ved hjelp av Western blot i et panel av lungekreft cellelinjer. Legg merke til en direkte korrelasjon av proteinnivået (B) med transkripsjonene (A) i hver cellelinje. C. Real-time PCR-analyse av ATDC overekspresjon effektivitet i HBE celler og utarming effektivitet i A549 og H1299 celler på en transkripsjonsnivået. D. Western blot-analyse av ATDC overekspresjon effektivitet i HBe-celler og uttynning effektivitet i A549 og H1299-celler på et protein-nivå. Båndet av lavere MW i H1299-celler er et proteinnedbrytningsprodukt. Legg merke til en direkte korrelasjon av proteinnivået (D) med transkripsjonene (C) i hver cellelinje.
MTT-analysen viste at transfeksjon av cDNA inn i ATDC HBe-celler fremmes cellevekst sammenlignet med kontroll (transfeksjon av tomme vektorer) (HBE kontroll versus ATDC cDNA: 1,06 ± 0,05 versus 1,41 ± 0,05, p 0,05). Effekten av ATDC på proliferasjon kapasitet ble også analysert ved hjelp av kolonidannelse analysen. ATDC overekspresjon i HBE celler førte til en bemerkelsesverdig økning i koloni tall (HBE kontroll versus ATDC cDNA: 221 ± 13 versus 441 ± 9, p 0,05). På den annen side cellen formeringshastigheten (A549 NC versus siATDC: 1,23 ± 0,03 versus 0,84 ± 0,03; H1299 NC vs siATDC: 1,72 ± 0,01 versus 1,19 ± 0,02; p 0,05) og kolonidannelse evne (A549 NC versus siATDC: 400 ± 12 versus 150 ± 14; H1299 NC versus siATDC: 258 ± 20 versus 119 ± 17, p 0,05) ble svekket i A549 og H1299 celler med ATDC knockdown (figur 3). Disse resultatene helt foreslå at ATDC kunne modulere lungekreft celleproliferasjon.
A. MTT-analysen viser at ATDC transfeksjon i HBE-celler fremmer cellevekst og ATDC knockdown i A549 og H1299-celler inhiberer celleproliferasjon. B-C. Vurdering av klonogene potensialer av ATDC overekspresjon celler og ATDC utarmet celler ved å telle koloni tall. En bemerkelsesverdig økning i kolonitall ble observert i HBe-celler med overekspresjon ATDC sammenlignet med kontroll, og antall kolonier dannet ved A549 og H1299-celler behandlet med ATDC siRNA var langt mindre enn den for kontrollceller. Kolonner i C representerer middelverdien av 3 dubletter; søylene representerer standardavvik [13]. * Indikerer statistisk signifikans i forskjell mellom de angitte 2 bark verdier (p 0,05).
ATDC Forenkler G1 /S Overgang og Up-regulerer Cyclin D1 og c-myc uttrykk på lungekreft celler
cellesyklusanalyse ved fluorescensaktivert cellesortering (FACS) ble utført i ATDC overekspresjon HBE-celler og i ATDC utarmet A549 og H1299-celler (figur 4). ATDC overekspresjon redusert prosentandelen av celler i G1 fase (HBE kontroll versus ATDC cDNA: 68,04% ± 0,04% i forhold til 57,74% ± 0,51%, p 0,05) og økte prosentandelen av celler i S-fasen (HBE kontroll versus ATDC cDNA: 12.48% ± 0,74% versus 27,62% ± 0,61%, p 0,05). Omvendt, ATDC siRNA behandlingen økte cellene i G1 fase (A549 NC versus siATDC: 64,99% ± 0,57% i forhold til 75,99% ± 2,72%; H1299 NC versus siATDC: 52,66% ± 1,47% i forhold til 63,80% ± 1,13%; p 0,05 ) og redusert cellene i S-fasen (A549 NC versus siATDC: 29,59% ± 0,45% versus 9,24% ± 0,06%; H1299 NC versus siATDC: 37,55% ± 3,13% versus 20,80% ± 3,11%; p 0,05) sammenlignet med kontroll. Disse resultatene antyder at ATDC kan fremme cellesyklusprogresjon gjennom G1 /S-grensen
Merk ATDC overekspresjon i HBE-celler øker S-faseceller og senker G1 faseceller. (P 0,05 sammenlignet med kontroll). ATDC knockdown i A549 og H1299 celler øker G1 fase celler og reduserer S fase celler (p 0,05 sammenlignet med kontroll).
For å undersøke mekanismene for cellesyklusprogresjon regulert av ATDC i lungekreft, vi undersøkte effekten av ATDC på cyklin A, cyklin D1, cyklin E, CDK2, CDK4, CDK6, p-Rb og c-Myc i lungecancercellelinjer. Som vist i figur 5, western-blotting-analyse viste at ATDC overekspresjon oppregulert proteinnivåer cyklin D1, CDK4, CDK6, p-Rb og c-Myc i HBE-celler, mens knockdown av ATDC redusert ekspresjon av disse proteiner i A549 og H1299 celler. Til sammen tyder disse resultater på at ATDC kan fremme G1 /S overgang via opp-regulering av cyclin D1 og c-myc ekspresjonen.
Western blot-analyse viser at ATDC transfeksjonen øker Cyclin D1 og c-Myc-ekspresjon i celler og HBe knockdown av ATDC reduserer protein nivåer av cyclin D1 og c-myc i både A549 og H1299 celler, uten vesentlige endringer i cyclin A og Cyclin E uttrykk.
ATDC Expression korrelerer med Ki67 Merking Index, Cyclin D1 og c-myc nivåer i NSCLC Vev
Vi har undersøkt forholdet mellom nivået av total ATDC protein og spredning indeks (Ki67 merking) i NSCLC. Vi fant at tilfeller med et høyt nivå av ATDC proteinekspresjon tendens til å vise en høy indeks spredning, i sammenligning med de med et lavt nivå av ATDC (p = 0,0022) (figur 6). Farging for cyklin D1 og c-Myc ble også utført i NSCLC-prøver og deres forbindelser med ATDC ekspresjon ble analysert (figur 6). Som vist i tabell 1, ATDC overekspresjon korrelert med et høyt nivå av cyclin D1 (p = 0,0010) og c-Myc uttrykket (p = 0,0150).
Immunohistokjemisk farging av ATDC (A og B), cyklin D1 (C og D), c-Myc (E og F) og Ki67 (G og H) i NSCLC prøver. A, C, E og G angir et representativt tilfelle med positiv ATDC viser et høyt nivå av cyclin D1 og c-Myc, et høy-merkeindeksen av Ki67, mens B, D, F og H representerer et tilfelle med negativ ADTC og tilsvarende negativ cyclin D1 og c-myc flekker eller lavt nivå av Ki67 merking.
ATDC Up-regulerer Cyclin D1 og c-myc i lungekreftceller Uavhengig av Wnt /β-catenin eller p53 signalveien
Nyere data viser at overekspresjon av ATDC fører til wnt signale aktivering i bukspyttkjertelen adenokarsinom cellelinjer. Dette reiser spørsmålet om ATDC mediert oppregulering av cyclin D1 og c-myc i lungekreftceller resultater fra en aktivering av Wnt signaltransduksjonsbane der cyclin D1 og c-Myc er viktige komponenter. For å teste dette har vi målt total β-catenin og aktive β-catenin nivåer ved western blot analyse, og undersøkte wnt aktiviteten ved luciferaserapportørplasmid analyser i HBE celler som overuttrykker ATDC og i H1299 og A549 celler slått ned av ATDC. Ingen åpenbare endringer av Wnt aktivitet og β-catenin nivåer ble observert i disse cellene med endrede nivåer av ATDC (Figur 7A-B). Derfor er virkningen av ATDC på lungecancer celleproliferasjon synes å være uavhengig av Wnt /β-catenin signaltransduksjonsbane.
A. Det var ingen signifikant endring av Topflash luciferase-aktivitet etter ATDC transfeksjon i HBE-celler, og etter siRNA behandling i A549 og H1299 celler. B. Det var ingen signifikant endring av β-catenin og aktive β-catenin proteinnivåer etter ATDC transfeksjon i celler HBE og etter siRNA behandling i A549 og H1299 celler. C. ATDC transfeksjon i HBE celler eller dets uttømming i A549 cellene ikke endre nivået av p53 luciferase aktivitet. D. ATDC transfeksjon i HBE eller dets uttømming i A549 cellene ikke endre protein nivået av p53 target genet p21.
Siden ATDC ble rapportert å øke celle spredning via hemming av p53 kjernefysiske aktiviteter, vi lurte på hvis ATDC mediert oppregulering av cyclin D1 og c-Myc i lungekreftceller kunne være på grunn av dets inhibitoriske effekt på p53-protein. Blant de 3 cellelinjer nevnt ovenfor, har H1299 celler er vel kjent for å ha p53-genet tapt, mens HBE og A549-celler som uttrykker villtype p53. Derfor vurderte vi effekten av ATDC på p53 aktivitet i HBE og A549 celler. Som vist i fig 7C-D, har overekspresjon av ATDC i HBe-celler ikke vesentlig endrer aktiviteten av p53-responsive luciferase reporter eller ekspresjon av p53-genet p21 mål. Verken endringen ble registrert i A549 celler utarmet av endogen ATDC. I forbindelse med at ATDC regulert cyclin D1 og c-myc nivået i p53-null H1299 celler, tenkte vi at effekten av ATDC på cellesyklusprogresjon i lungekreftceller kan være uavhengig av p53 aktivitet.
ATDC opp-regulerer Cyclin D1 og c-Myc gjennom Aktivering av NF-kB hovedbane
Siden både cyklin D1 og c-Myc var nedstrøms mål for NF-kB, undersøkte vi protein ekspresjon av p65, p-IkB og NF-kB luciferaseaktivitet å vurdere om ATDC kunne regulere aktiveringen av NF-kB veien (8A-B). Det viste seg at ATDC overekspresjon i HBE celler oppregulert NF-kB reporter luciferase aktivitet, og tilsvarende, ATDC uttømming i A549 og H1299 celler nedregulert sin aktivitet. På den annen side nivået av p-IkB var oppregulert i HBe-celler transfektert med ATDC og nedregulert i A549 og H1299-celler utarmet av endogent ATDC, selv om det ikke var noen signifikant endring av den totale p65 nivå i disse cellene. Disse resultatene tyder på en mulig involvering av NF-kB-aktivering i ATDC indusert oppregulering av cyclin D1 og c-Myc. Bay 11-7082, som hemmer fosforylering og degradering av IkBa å blokkere NF-kB-aktivering, ble også benyttet i HBe-celler transfektert med ATDC for å bekrefte effekten av NF-kB-aktivering. Som vist i figur 8C, reverserte NF-kB hemmer virkningen av ATDC på cyclin D1, c-Myc og p-Rb i celler HBE. Derfor kan NF-kB-aktivering er en forutsetning for ATDC indusert oppregulering av cyclin D1 og c-Myc.
A. ATDC overekspresjon oppregulert NF-kB reporter luciferase aktivitet i HBE celler og ATDC uttømming hemmet NF-kB reporter luciferase aktivitet både A549 og H1299 celler. B. ATDC transfeksjon øket p-IkB-ekspresjon i HBE-celler og uttynning ATDC reduserte nivået av p-IkB i A549 og H1299 celler. C. NF-kB hemmer Bay 11-7082 blokkert helt NF-kB reporter luciferase aktivitet og reverserte effekten av ATDC på cyclin D1, c-myc og p-Rb oppregulering.
Diskusjoner
ATDC, som ligger på kromosom 11q22-23, tilhører den tredelte motiv (TRIM) protein familien (også kjent som RBCC familie) og ble overuttrykt i mange forskjellige krefttyper [13] – [21].
