Abstract
Mål
Flotillin genet er kjent som en svulst promoter eller suppressor, avhengig av tumortype eller svulst scenen. Vi forsøkte å undersøke den kliniske betydningen av flotillin2 protein uttrykk i magekreft.
Metoder
Vi undersøkte flotillin2 og ErbB2 nivåer i vevet microarray av 282 magekreftprøver og analysert sammenhengen mellom flotillin2 nivåer, clinicopathologic faktorer og prognose. Reguleringen av erbB2 ved flotillin2 ble undersøkt med flotillin2 siRNA-transfektert mage kreftceller.
Resultater
Flotillin2 delvis samlokalisert med erbB2 på plasmamembranen som oppdages av konfokalmikroskopi, nivåer av erbB2 ble redusert etter flotillin knockdown i SGC-7901 kreftceller, og uttrykk for flotillin2 var positivt korrelert med at av erbB2. I ikke-neoplastiske gastrisk mucosa, ble flotillin2 ikke uttrykt i det epiteliale rom. I magekreft, ble positiv farging av flotillin2 vist i 129 (45,7%) av 282 tilfeller, også, det var signifikant assosiert med Lauren klasse, histologisk type lymphovascular invasjon og svulst plassering. Videre overlevelsesanalyse viste at flotillin2 ekspresjon var et uavhengig prognostisk faktor av dårlig overlevelse (p 0,001).
Konklusjoner
Disse resultater indikerer at en positiv korrelasjon mellom flotillin2 og erbB2 ekspresjonsnivåer, flotillin2 kanskje involvert i stabilisering av erbB2 på plasma membran, flotillin2 signifikant korrelert med kreft progresjon og dårlig prognose i magekreft
Citation. Zhu Z, Wang J, Sun Z, Sun X, Wang Z, Xu H (2013) Flotillin2 Expression korrelerer med HER2 Nivåer og dårlig prognose i magekreft. PLoS ONE 8 (5): e62365. doi: 10,1371 /journal.pone.0062365
Redaktør: Joseph Najbauer, Universitetet i Pécs Medical School, Ungarn
mottatt: 15 februar 2013; Godkjent: 20 mars 2013; Publisert: 02.05.2013
Copyright: © 2013 Zhu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (81272718), Young Scholars «forskningsfond for doktorgradsutdanning av høyere utdanning i Kina (20122104120008) og fondet for Scientific Research av det første sykehuset i Kina Medical University (FSFH1208). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Mange plasma membran proteiner er kjent for å være involvert i celledeling, celle adhesjon, cellemotilitet og tumorcelle invasjon, sto for mer enn to tredjedeler av kjente narkotika mål. Cellemembranen og assosierte proteiner er av vesentlig interesse med hensyn til ulike aspekter av tumor, fra kreftfremkallende og metastatiske mekanismer for å molekylær diagnose og terapi [1]. Flotillins er forbundet med vesikulær invaginations av plasmamembranen, og fungere som regulatorer av signaltransduksjon [2]. Blant flotillin familiemedlemmer, er det to forskjellige flotillin gener (flotillin1 og 2), flotillin2 protein ekspresjon har blitt rapportert i noen humane kreftcellelinjer og tumorprøver [3], [4], [5], [6]. Siden flotillin2 samhandler direkte med signalmolekyler som reseptorer, kinaser, adhesjonsmolekyler og G-proteiner, fungerer den som en svulst modulator gjennom regulering av celledeling, differensiering, apoptose, adhesjon og invasjon [4].
Overuttrykte av erbB2 (human epidermal vekstfaktor-reseptor-2), også kjent som HER2, er membran-assosiert tyrosinkinase som kan føre til aktivering av cellulære signaloverføringssystemer, noe som resulterer i cellulær transformasjon og cellesprednings hendelser assosiert med cancer, for eksempel brystkreft kreft, eggstokk-kreft og magekreft [7], [8], [9]. Høy ekspresjon nivå av erbB2 er signifikant korrelert med økt tumorinvasjon, metastase, resistens mot kjemoterapi, og dårlig prognose av pasienter [10]. Nyere studier har vist at flotillin2 protein, blant andre funksjoner, var involvert i endocytiske mekanismer og cellulære trafikk prosesser, og ble funnet å være i et molekylkompleks med erbB2 [11]. For å forstå om stabilisering av erbB2 på plasmamembranen er mediert av flotillin2 og deres kliniske betydning, gjennomførte vi sammen membran proteomikk analyse av menneskelig magekreft.
I denne studien beskriver vi flotillin2 og erbB2 uttrykk nivåer er positivt korrelert på cellenivå, samt i magekreft vev og vi viser at erbB2 er internalisert og brytes ned av en mekanisme på flotillin2 uttømming. Videre clinicopathologic betydningen av flotillin2 ble videre undersøkt ved hjelp av arkiv vevsprøver og statistisk analyse. Vi fant at flotillin2 er en uavhengig prognostisk faktor, også en potensiell ny biomarkør for lymfeknutemetastaser. Våre data vil rette for en forståelse av mage kreft karsinogenisitetsstudier og gruvedrift biomarkører for diagnostisering og behandling av denne sykdommen.
Materialer og metoder
vevsprøver og oppfølging
En totalt 282 pasienter som hadde kirurgi for magekreft mellom januar 2006 og desember 2009 kl First Affiliated Hospital Kina Medical University ble valgt for denne studien. Alle pasienter-avledet prøver ble samlet inn og arkivert i henhold til protokoller godkjent av Institutional Review Boards of the First tilknyttet Hospital Kina Medical University. Diagnosen ble bekreftet av minst to patologer og iscenesettelse var basert på patologiske funn i henhold til syvende amerikanske Joint Committee on Cancer retningslinjer. Median varighet av oppfølging var 51 (range, 5-78) måneder.
282 pasienter som gjennomgikk gastroctomy ble utsatt for nøye klinisk observasjon, inkludert bryst og buk CT bildebehandling, CEA nivå, og blodprøver på 2- til 3-måneders intervaller og en årlig gastroskopi. Total overlevelse (OS) priser ble definert som intervallet fra den første operasjonen til klinisk eller radiologisk påvist tilbakefall eller metastasering og død, henholdsvis. Sluttdato for oppfølgingsstudie for å gjennomføre analysen var 29. juni ble 2012.
Etikk uttalelse
Etisk godkjenning for denne forskningen hentet fra forskningsetiske komité for Kina Medical University, Kina. Alle pasienter som gir svulstvevet samt normale prøver mage vev signerte en samtykkeerklæring før kirurgisk fjerning av magekreft for å tillate denne forskningen som skal utføres.
TMA konstruksjon og immunhistokjemi
Hematoxylin og eosin (H 0,05) ble deretter satt inn i multivariat analyse. HR med 95% konfidensintervall (KI) ble målt til å anslå fare risikoen for individuelle faktorer. P 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant. Analysene ble utført ved hjelp av SPSS statistisk programvare programversjon 19,0 (SPSS Inc., Chicago, IL).
Resultater
Uttrykk for flotillin2 og erbB2 i magekreft
Farget seksjoner av microarray (TMA) av 282 vev kjerner ble gradert for deres cytoplasmatic immunhistokjemisk farging intensitet mot flotillin2 og erbB2 protein. De 282 lesbare prøver inkludert 282 gastrisk karsinom, 181 peri-karsinom og 101 prøver av normal gastrisk epitel vev. Tumorceller viste typisk diffus membranfarging av flotillin2 kan finnes i gastrisk karsinom (figur 1a) med den tilsvarende plasseringen av erbB2 (figur 1b), i ikke-neoplastiske gastrisk mucosa, flotillin2 og erbB2 var begge ikke uttrykt. Positiv farging av flotillin2 ble vist i 129 (45,7%) av 282 prøver, erbB2 var 59 (20,9%). Amplifisering av erbB2-genet ble bestemt ved to-farge FISH av xenotransplantater i nakne mus. ErbB2 genamplifisering i en klynge mønster (rød) ble observert i MGC-803, BGC-823 og SGC-7901 celler, erbB2 overekspresjon bare i menneskelig SGC-7901 magekreftcelle (figur 2a-c).
representative protein ekspresjon av (A) flotillin2 og (B) erbB2 i et vev microarray kjerne ble tatt fra en gastrisk karsinom. SGC-7901 gastrisk kreft celler ble farget med anti-erbB2, anti-flotillin2 antistoff henholdsvis, ble farget antistoffet visualiseres ved TRITC /FITC-konjugert geite-anti-muse-IgG-antistoff, og objektglassene ble deretter undersøkt ved hjelp av en konfokal laser scanning mikroskop. TRITC (erbB2) vises som rød (C), FITC (flotillin2) som grønn (D), og sammenslåingen av grønt og rødt blir gul (E).
Forsterkning av HER2-genet ble bestemt av fisk. Det ble ikke observert HER2 genamplifisering i en klynge mønster (rød) i (A) MGC-803, (B) BGC-823, og (C) SGC-7901 magekreftceller, HER2 i forhold til ekspresjon i humane SGC-7901 celle. (D) Western blot analyse og (E) Kvantitativ real-time PCR ble åpnet for erbB2 og flotillin2 i SGC-7901 cellelinje etter knockdown av flotillin-2. Uttrykket status for flotillin2 er svært konkordant med at av erbB2, siRNA ble blank vektor, β-Actin ble brukt som intern kontroll.
Association mellom uttrykk for flotillin2 med erbB2
Vi analyserte den cellulære lokalisering av erbB2 og flotillins i SGC-7901 magekreftcelle. Vi kunne vise ved konfokalmikroskopi at flotillin2 delvis co-lokalisere med erbB2 på plasmamembranen (Figur 1a-e). Våre data viser at uttrykket av flotillin2 gjør har en signifikant sammenheng med at av erbB2 (p 0,001) i immunhistokjemisk vev rekke analyse (tabell 1). I tillegg kunne samvirke mellom flotillins og erbB2 demonstreres ved immunoblot (figur 2d) og kvalitets RT-PCR eksperimenter (figur 2e), banket ned av endogene flotillin2 resulterte i trekking ned av erbB2. Vi neste analysert virkningen av flotillins på internalisering og påfølgende nedbrytning av erbB2. Som beskrevet nedenfor, erbB2 og HER2 har også mange relasjoner av clinicopathological faktorer til felles.
Sammenhengen mellom flotillin2 og clinicopathological faktorer
I denne studien, 282 magekreftpasienter med tilstrekkelige primære svulster materialer og oppfølging gang var tilgjengelige, hvis vev ble samlet inn i løpet av de siste 6 årene. Tabell 2 ga beskrivende statistikk for parametere målt for disse pasientene. Median varighet av oppfølgingen var 54 måneder (variasjon 9-78 måneder). Den 5-årige total overlevelse (OS) rate var 48,2%
Vi fant at økt uttrykk av flotillin2 og erbB2 ble begge signifikant assosiert med histologisk type (p 0,001, henholdsvis)., Lauren karakter (p 0,001, respektivt) og Lymphovascular invasjon (p = 0,059 og p 0,001, tabell 2). I tillegg ble flotillin2 signifikant korrelert med tumorstørrelse (p = 0,006), T trinn (p = 0,001) og lymfeknutemetastase (p = 0,033, tabell 2). Imidlertid ble ikke observert noen signifikant korrelasjon mellom flotillin2 uttrykk og andre parametere inkludert alder, kjønn, sted, makroskopiske type og levermetastaser.
Uttrykk av flotillin2 i forhold til prognose
Ved hjelp av Cox proporsjonal farer regresjon modellen ble univariable forholdet mellom tumoregenskaper og pasientenes resultat oppnådd (tabell 3). Av de 282 pasientene som ble analysert, ble statistisk signifikante forskjeller i OS sett, med et dårlig resultat for pasienter med høyere farging av flotillin2 og erbB2. Andre prediktive faktorer som ble funnet å være korrelert med OS var alder (P = 0,042), størrelse (P = 0,001), makroskopiske type (p = 0,001), Pt (P 0,001) og pN trinnet (P 0,001) (tabell 3). Ved hjelp av log-rank test, var det signifikante forskjeller i OS mellom positive og negative pasienter med flotillin2 og erbB2 (P 0.001, henholdsvis) i alle pasienter ble vist i Figur 3.
(A) Pasienter med en erbB2 -positivt tumor viste et vesentlig kortere tidsrom overlevelse etter kirurgi enn de med en erbB2-negativ tumor (p = 0,014). (B) Pasienter med en flotillin2-positiv tumor viste det verste utfallet. Høy flotillin-2 og erbB2 uttrykk er signifikant korrelert med dårlig pasient utfallet (p 0,001).
Cox multivariate proporsjonal-hazard regresjonsmodell ble så brukt til å finne ut hvilke faktorer som var sammen predicative av OS. Variabler som ble antatt å være av betydning i univariat analyse ble inkludert i analysen. Betydningen justert for andre co-variates, ble gitt i Tabell 4. multivariat analyse av felles effekt av flotillin2 og erbB2 med andre prognostiske faktorer viste at PT (P 0,001) og pN scenen (P 0,001) flotillin2 (HR = 1,485, 95% KI: 1,278 til 1,725, P 0,001) var en bedre uavhengig prognostisk markør enn erbB2 (HR = 1,375, 95% KI: 1,133 til 1,947 P = 0,004) for OS (tabell 4)
Diskusjoner
vurderingen av biologiske prognostiske faktorer er av klinisk betydning, spesielt for en sykdom med dårlig utfall slik som magekreft. Denne studien bekreftet konstituerende uttrykk for flotillin2 i mage kreft vevsprøver og cellelinjer, fant vi også at flotillin2 var en selvstendig dårlig prognostisk faktor for total overlevelse av mage kreftpasienter. I tillegg er den foreliggende studien viste, for første gang, en positiv sammenheng mellom de uttrykk for flotillin2 og HER2 i magekreft. I forrige undersøkelse, Pust et al. (2012) fant at brystcancercellelinjer avledet fra fjernmetastaser viste en høyere grad av flotillin mRNA og protein uttrykk enn de som er avledet fra primære magekreft. Således, de forklarte rolle flotillin2 som en vevs- og scene-spesifikke tumor-modulator, hvor det virker som en inhibitor eller formidler av tumordannelse og progresjon avhengig av dets proteininteraksjonspartnere så som vekstfaktorreseptorer eller celleadhesjonsmolekyler [11] . Våre resultater er enig med denne beskrivelsen fordi flotillin2 uttrykk i denne studien var positivt korrelert med HER2 uttrykk, som var positivt korrelert med dårlig prognose i magekreft.
Data fra to nyere publikasjoner viser at flotillin har en funksjonell rolle i reseptor-tyrosin-kinase-signalering, spesielt i aktivering av MAP-kinase signalering og regulering av FGF-signalisering i HeLa-celler [16], [17]. I de SKBR3 brystkreftceller, slik at Akt fosforylering blir redusert ved uttømming av flotillin-2, men ikke etter flotillin-1 knockdown, var enig med våre data. Dermed kan reseptortyrosinkinaser eller reseptor-tyrosin-kinase-medierte signalveier reguleres ved flotillins på forskjellige måter og /eller i en celletype-spesifikk måte, er det mulig at de forskjellige signalveier som utløses av erbB2 reguleres ved enten flotillin2. Likevel, de reduserte ErbB2 nivåer utløst av flotillin2 knockdown støtte vår hypotese om en flotillin2-mediert stabilisering av erbB2.
ErbB2 er kjent for å være assosiert med dårlig prognose i magekreft, har flotillins blitt beskrevet å være assosiert med svulst genesis. Vi viste at flotillin2 co-lokaliserer med erbB2 på plasmamembranen og spiller en funksjonell rolle i reguleringen av erbB2 i magekreft. Høy ekspresjon av flotillin2 er assosiert med dårlig prognose og redusert overlevelse tid, og det fremstår som en potensiell prediktor for tilbakefall i magekreft. Det har blitt rapportert at østrogenreseptorer involvert i mage karsinogenese og flotillin2 interagerer med reseptorene [18], [19], noe som indikerer en betydelig innvirkning av flotillin2 funksjon på magekreftutvikling. På den annen side, på grunnlag av våre studier vev microarray, flotillin2 overekspresjon var sterkt assosiert med økt cellemigrering og ondartet transformasjon som fører til spredning til lymfeknuter og økt invasivitet. I vår studie, forhøyet flotillin2 og HER2 begge viste en signifikant korrelasjon med histologisk type (P 0,001 begge), Lauren Karakter (P 0,001 begge), mens flotillin2 får også en høy relevans med T scenen (P 0,001) og lymfeknute metastase (P = 0,033). Den sterke korrelasjon tyder på at flotillin2 kan brukes som en biomarkør for å identifisere undergrupper av pasienter med magekreft med en mer aggressiv fenotype. Den multivariat analyse viste flotillin2 fungerer som en bedre prognostisk markør for å forutsi risikoen for metastasering og gjentakelse (HR = 1,485, 95% KI: 1,278 til 1,725) enn Her2 (HR = 1,375, 95% KI: 1,133 til 1,947) for OS. Vi foreslår at flotillin2 over-uttrykk kan bidra til økt spredning og utvikling av mage kreft.
I konklusjonen, er dette den første demonstrasjonen av en positiv korrelasjon mellom flotillin2 og ErbB2 nivåer i dyrkede magekreftceller samt i vev. Videre korrelerer flotillin2 uttrykk nivå med dårlig prognose i magekreft, noe som indikerer at flotillin2 kan være en prognostisk biomarkør for magekreft. Det er funnet at ErbB2-overuttrykkende tumorer er mer sannsynlig å være resistente mot behandling med et antistoff-basert (trastuzumab /Herceptin) terapi, som er blitt klinisk førstelinjebehandling hos pasienter med erbB2-overuttrykkende magekreft [20] , [21]. Men selv i kombinasjon med andre medikamenter chemotherapeutical, mer enn 20% av pasienter med erbB2-overekspresjon viser ingen respons på behandlingen. Dermed ved å målrette flotillin2 uttrykk, nye strategier i kreftbehandling kan utvikles.
