Abstract
Ved hjelp av DNA-mikromatriser, genererte vi både mRNA og miRNA uttrykk data fra seks ikke-småcellet lungekreft (NSCLC ) vev og deres tilpasnings normal kontroll fra tilstøtende vev for å identifisere potensielle miRNA markører for diagnostikk. Vi viste at HSA-MIR-96 er betydelig og konsekvent oppregulert i alle 6 NSCLCs. Vi har bekreftet dette resultat i et uavhengig sett av 35 sammenkoblede tumorer og deres tilstøtende normale vev, så vel som deres sera som er samlet før kirurgisk reseksjon eller kjemoterapi, og resultatene antydet at HSA-MIR-96 kan spille en viktig rolle i NSCLC utvikling og har stort potensial til å bli brukt som en ikke-invasiv markør for diagnostisering NSCLC. Vi spådde potensielle miRNA målet mRNA basert på ulike metoder (TargetScan og Miranda). Videre klassifisering av miRNA regulerte gener basert på deres forhold til mirnas avslørte at HSA-MIR-96 og enkelte andre mirnas pleier å ned-regulere sine mål mRNA i NSCLC utvikling, som har uttrykk nivåer givende til direkte interaksjon mellom mirnas og sine mål mRNA. I tillegg identifiserte vi en signifikant korrelasjon av miRNA regulering med gener sammenfaller med høy tetthet av CpG øyer, noe som tyder på at miRNA kan representere en primær reguleringsmekanisme som regulerer grunnleggende cellulære funksjoner og celle differentiations, og slik mekanisme kan være komplementære til DNA metylering i undertrykke eller aktivere disse
Citation. Ma L, Huang Y, Zhu W, Zhou S, Zhou J, Zeng F et al. (2011) En integrert analyse av miRNA og mRNA uttrykk i ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 6 (10): e26502. doi: 10,1371 /journal.pone.0026502
Redaktør: Boris Zhivotovsky, Karolinska Institutet, Sverige
mottatt: May 23, 2011; Godkjent: 28 september 2011; Publisert: 27 oktober 2011
Copyright: © 2011 Ma et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet støttes av Science Foundation Natural i Zhejiang-provinsen (Y2110960) og Bureau of Science and Technology of Zhoushan tildelt professor Yongkui Zhang (20081059), og Forskningsfondet for Zhoushan Hospital tildelt Dr. Lina Ma, og National Basic Research Program ( 973 Program, 2011CB944100 og 2011CB944101) og Natural Science Foundation of China National (90919024) tildelt professor juni Yu. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Foreløpig er ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) den ledende årsak til kreft dødsfall i verden [1]. Kirurgisk reseksjon er hovedsakelig utført i tidlig stadium tilfeller og er også effektivt, men effekten er begrenset for pasienter med lokalavansert kreft på grunn av den høye frekvensen av fjernmetastaser og gjentakelse. Således, kjemoterapi og strålebehandling, så vel som en kombinasjon av begge, blir alltid utført ved behandling av pasienter med lokal kreft. Men det 5-års overlevelse av lungekreft pasienter synker dramatisk med kliniske stadier av sykdommen, for eksempel, fra anslagsvis 61% for pasienter med stadium IA sykdommen til 38% for pasienter med stadium IB sykdommen. Andre etappe relaterte 5-års overlevelse av sykdommen er 34% for pasienter med IIA sykdom, 13% for pasienter med stadium IIIA sykdom, 5% for pasienter med stadium IIIB sykdom, og 1% for pasienter med stadium IV [2] , [3], [4], [5]. De fleste lungekreftpasienter er bare diagnostisert etter svulstene har spredd seg utover sine primære områder, og dette er en viktig årsak til den dårlige utfallet av lungekreft behandlinger. I tillegg variasjon analyse blant en rekke kreftformer antydet at lungekreft har større antall av muterte gener enn andre kreft [6]. Derfor oppdagelsen av effektive diagnostiske markører og avhøre mekanismer for lungekreft utvikling, er både nødvendig for å bedre overlevelse av lungekreft pasienter.
mirnas er korte ikke-kodende RNA (~22 nt lang) som binder komplementære sekvenser i mål-mRNA, noe som resulterer i deres selektiv nedbrytning eller selektiv inhibering av translasjon. Derfor, ved å regulere deres målgener, er mirnas kjent for å være involvert i et bredt spekter av biologiske funksjoner, så som cellulær proliferasjon, differensiering og apoptose [7], [8]. Avvikende mirnas uttrykk er blitt rapportert å forårsake sykdommer, så som kreft [9], Alzheimers sykdom [10], hjertesykdommer [11], spinal motor neuron anomalier [12], og etc .. I NSCLC, har det vært antydet at mir -31 kan virke som et oncogent miRNA etter undertrykke tumor suppressorer: LATS2 og PPP2R2A [13], og ekspresjon av hSA-MIR-205 er blitt foreslått for å være i stand til å skille fra skvamøs nonsquamous ikke-små-celle lunge karsinom [14]. I tillegg bevis viser at høyt HSA-mir-155 og lav HSA-la-7a-2 uttrykk korrelert med dårlig overlevelse av lungekreftpasienter [15], og har-miRNA-126 kan fremme NSCLC celler apoptose indusert ved bestråling gjennom PI3K-Akt vei [16]. mirnas er nå fremstår som svært vevsspesifikke biomarkører for diskriminere kreftformer fra noncancerous vev, og ulike krefttyper, samt ulike prognostiske resultater [15], [17].
mRNA profilering har avdekket at transkripsjonen abnormitet av mange gener er ansvarlig for utviklingen av NSCLC [18], [19], og differensiell ekspresjon av mirnas også har blitt oppdaget mellom lungekreft vev og de tilstøtende normalt vev [15], [20]. I denne studien brukte vi microarrays å måle uttrykk nivåer av miRNAs og mRNA samtidig i paret NSCLC og deres tilstøtende normalt vev for å undersøke mulige roller miRNAs. Våre analyser er både integrert og ganske dypt i søket etter mulige kandidater mirnas og deres mRNA mål for videre undersøkelser og kliniske applikasjoner.
Resultater
forskjellig uttrykt mRNA hos NSCLC vev sammenlignet med sine sammenkoblede normalt vev
Vi utførte genuttrykk profilering for parede tumor normal vevsprøver fra 6 NSCLC pasienter og undersøkt 34,694 gener /karakterutskrifter. Vi definerte 581 opp-regulerte gener og 1, 297 ned-regulerte gener som var konsekvent opp- eller ned-reguleres i alle 6 tumorvev sammenlignet med de tilstøtende normale vev (tabell S2 og S3 tabell). Blant forskjellig uttrykte gener, identifiserte vi to vesentlig oppregulert og 22 signifikant nedregulert gener på en falsk Discovery Rate (FDR) på 0,1 (tabell S2 og Tabell S3). Vi deretter utført GO berikelse analyse ved hjelp av hypergeometrisk test og multippel test justeringsmetoden BH gjennom WebGestalt2 [21] og definert beriket trasé på en
p
verdien av 0,001. Den hypergeometrisk fordeling er en diskret sannsynlighetsfordeling som beskriver antall suksesser i en sekvens av
n
trekker fra en begrenset befolkning uten erstatning, akkurat som den binomiske fordelingen beskriver antall suksesser for tegner med erstatning. Hypergeometrisk test bidrar til å finne hvilke GO vilkår er overrepresentert i en stor gen listen. I henhold til hypergeometrisk testresultater, ble cellesyklusen M-fase og DNA-metabolisme overveiende aktivert, mens reaksjonsveier som er involvert i immunfunksjoner ble betydelig undertrykt i NSCLC (tabell 1). I tillegg ble oppregulert gener overveiende anriket på «kromosom» i motsetning til nedregulert gener som ble hovedsakelig anriket på «cellemembranen» (tabell 2).
uttrykt forskjellig mirnas i NSCLC vev sammenlignet med sine sammenkoblede normalt vev
Vi utførte miRNA uttrykket profilering ved hjelp av de samme 6 parede prøver av primærtumor og tilstøtende normalt vev. Vi fikk 25 oppregulert og 24 nedregulert mirnas som var konsekvent opp- eller nedregulert i alle 6 tumorvev sammenlignet med de tilstøtende normalt vev før betydning test (tabell S4 og tabell S5). Basert på en strengere analyse, fikk vi en enkelt betydelig oppregulert miRNA, HSA-MIR-96, til en falsk Discovery Rate (FDR) på 0,1. Vi videre undersøkt uttrykk nivå av sine potensielle mRNA mål (Disse målene har bevart miRNA bindingsseter blant virveldyr eller pattedyr, og ble spådd å bruke TargetScan): 13 av 728 totalt kandidat målgener (Tabell S2 og Tabell S6) (konto for 2,24% av 581 up-regulerte gener) ble oppregulert og 48 av de totalt (tabell S3 og tabell S6) (står for 3,70% av 1, 297 nedregulert gener) ble nedregulert (figur 1A). Vi deretter validert HSA-MIR-96 uttrykk basert på kvantitativ RT-PCR i et uavhengig sett med 35 NSCLC og deres serumprøver (for sera, uttrykket verdier ble normalisert til normale mennesker uten kreft historie eller annen sykdom på den tiden), og funnet hSA-MIR-96 var signifikant oppregulert i begge vev og serumprøver fra pasienter med NSCLC (figur 2). Derfor HSA-MIR-96 kan være en viktig faktor for å bidra til NSCLC utvikling og kan ha stort potensial til å bli brukt for å diagnostisere.
(A) Microarray resultatene av nedregulert mål kandidater av HSA-MIR -96 i NSCLC. Vi testet seks sammenkoblede NSCLC vs. normalt vev. C og N står for kreft og tilstøtende normalt vev, henholdsvis. Stjernen betegner gener tilhører korrelerte gruppen og de resterende gener er gruppert i anti-korrelert gruppe i henhold til uttrykket forhold til disse genene sine regulatoriske miRNAs. (B) Validering av microarray resultater ved QRT-PCR. Vi valgte 10 nedregulert mål kandidater av HSA-MIR-96 og utførte QRT-PCR eksperimenter for validering av relativ mRNA uttrykk i referanse til glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH). De relative uttrykk verdiene er gjennomsnitt ± SE. *,
P
0,05 av
t
test; **
P
0,001 av
t
test
To grupper av sammenligninger ble utført. (1) svulst vs. tilstøtende normale lungevev, og (2) kreft serum sammenlignet med ikke-kreft serum. Relativ HSA-MIR-96-ekspresjon ble bestemt i referanse til en intern U6 snRNA kontroll. Relative uttrykk verdier er normalisert gjennomsnitt ± SE.
Som mirnas alltid undertrykke uttrykket av målet gener, de 48 nedregulert målene for HSA-MIR-96 kan være mest sannsynlig å bidra til NSCLC utvikling gjennom HSA-MIR-96 regulering. Vi valgte 10 nedregulert målene for HSA-MIR-96 for å validere sine mRNA uttrykk nivåer ved hjelp QRT-PCR i 20 NSCLC og funnet ut at alle av dem var signifikant nedregulert i tumorvev sammenlignet med de tilstøtende normalt vev (Figur 1B ). For å undersøke hvordan disse 48 nedregulert mulige mRNA-mål kan påvirke utviklingen av NSCLC, klassifisert vi dem basert på GO betingelser, og funnet at disse genene var involvert i en rekke grunnleggende biologisk prosess, inkludert metabolisme, biologisk regulering, cellekommunikasjon, utviklingsprosess, immunsystem, og etc. (figur S2).
Klassifisering av mRNA basert på deres forhold til miRNA regulering
for å karakterisere hvordan mirnas kan regulere sine mål mRNA, utførte vi en omfattende analyse på korrelert uttrykk for miRNAs og deres mål mRNA. mirnas er uttrykt som lange forløper RNA som behandles av en cellulær nuklease, drosha, før de blir transportert av en exportin-5-avhengig mekanisme inn i cytoplasma [22], [23]. Når i cytoplasma, blir mirnas spaltes ytterligere ved hjelp av enzymet dicer [24], [25], og dette resulterer i 17-24 nt mirnas som er forbundet med en cellulær kompleks som er lik den RNA-induserte stanse kompleks som deltar i RNA interferens. Men mirnas hovedsak regulerer mRNA oversettelse, mens sirnas direkte RNA ødeleggelse via RNA interferens (RNAi) pathway [8], [26]. Derfor kan overflod av miRNAs hovedsakelig avhenge av sin opprinnelige uttrykk og ikke importert eksogent. I tillegg er flere linjer av bevis tyder på at heving av miRNA ekspresjon fører til nedregulering av målgener, og reduksjon av miRNA ekspresjon fører til oppregulering av målgener [13], [27]. Vi har derfor hypotese at effekten av miRNAs på sine mål mRNA er uttrykk nivå avhengig. Vi brukte en roman tiltak for å evaluere miRNA regulering, kalt
regulering verdi
. Vi først anta at en regulering verdi av en miRNA er positivt korrelert med dets ekspresjonsnivå. Siden en miRNA alltid har mer enn én målgener [28], vi da anta at en regulering verdi av et gitt miRNA er negativt korrelert med antallet sine mål. Derfor kan vi definere en regulering verdi for miRNA som avvik i uttrykket nivå for en gitt miRNA delt på antall uttrykt mRNA mål.
I løpet av kreftutvikling, kan regulering variere fra tilfelle til å kontrollere for en gitt miRNA og, derfor, regulering verdi av et gitt miRNA tilsvarer variasjonen av miRNA ekspresjon dividert med antall uttrykt mål. Når uttrykk for en miRNA er nedregulert i kreft, blir regulering verdi negativ hvis antall av sine uttrykte mål ikke er vesentlig endret. For et mål mRNA, er dens regulering verdien summen av alle regulerings verdier fra sine regulatoriske miRNA. Basert på disse definisjonene, klassifisert vi alle forskjellig uttrykt gener i kreft inn i forskjellige grupper, basert på deres korrelasjoner-korrelerte eller anti-korrelerte med miRNA regulering. Før du gjør dette, spådde vi de potensielle målgener av disse konsekvent opp- eller nedregulert mirnas.
Vi brukte tre metoder for å forutsi potensielle mål av miRNAs. Programvaren TargetScan fokuserer mer på miRNA frø (2-8nt i 5′-regionen til modne miRNA), som bevis antyder viktigheten av denne regionen for miRNA target gjenkjennelse [29], [30], [31], [32]. I tillegg har sekvenskonservering av målse vært ansett som et viktig trekk for å redusere falskt positive [30]. Vi spådde derfor potensielle miRNA mål ved hjelp TargetScan og konserverte målse blant virveldyr eller pattedyr bruker
P
CT metode for TargetScan [33]. Men ikke frø områder som ikke alltid konferere undertrykkelse, og programvaren Miranda tar også hensyn til annen region av miRNA i tillegg til frø områder [34]. Vi deretter brukt Miranda som et annet alternativ metode for å forutsi miRNA mål. De to programvare ble ofte brukt til å forutsi miRNA mål, og i tillegg kan begge brukes til å forutsi mål for nye mirnas som illuminia miRNA microarray «humanMI_V2» inneholder mange nye mirnas som genereres fra neste generasjons sekvense innsats over hele verden. Vi fikk 16,160 konservert miRNA-målet parene blant virveldyr eller pattedyr som bruker
P
CT metode for TargetScan (tabell S6), 70,320 miRNA-target parene ved hjelp TargetScan uten tanke på bevaring tilstand (tabell S8), og 77,988 miRNA-target parene ved hjelp av Miranda (tabell S10). Vi observerte at 48,841 miRNA-målet parene var tilstede i begge TargetScan og Miranda resultater (69,46% av TargetScan resultater, 62,63% av Miranda resultater), og 12,403 miRNA-target par av konserverte TargetScan Resultatene var vanlig med Miranda resultater (76,75% av konservert TargetScan resultater). Derfor var det ca 70% prediksjon resultater som var vanlig i de to ulike metoder, og konserverte prediksjonsresultater av TargetScan exhibite en større andel av felles gener.
Vi først brukte konserverte prediksjonsresultater å klassifisere mRNA basert på deres forhold til miRNA regulering. Spesielt vi definert 197 og 190 gener som anti-korrelert og korrelert, henholdsvis, og 1491 som «andre», hvis miRNA regulering verdier er null (tabell S7). Vi har undersøkt videre fordeling av miRNA regulering verdi, genekspresjon nivå og potensialet forholdet mellom disse to parametre. I de 197 anti-korrelerte gener, 171 (står for 13,18% av 1 297 nedregulert gener) ble nedregulert og 26 (står for 4,48% av 581 up-regulerte gener) var oppregulert. Gene fordeling basert på regulering verdi også foreslått at den anti-korrelerte gruppe alltid ble nedregulert ved mirnas (figur 3a). I de 190 korrelerte gener, 140 (står for 10,79% av 1 297 nedregulert gener) var nedregulert og 50 (står for 8,61% av 581 up-regulerte gener) var oppregulert. Gene fordeling basert på regulering verdi antydet at det korrelerte gruppen alltid ble nedregulert (figur 3A). For 1491 gener i «andre», 986 (står for 76,02% av 1,297 nedregulert gener) ble nedregulert og 505 (står for 86,92% av 581 up-regulerte gener) var oppregulert (Tabell 3). Som konklusjon viser disse resultater indikerer at mirnas har en tendens til å ned-regulere genekspresjon, spesielt for de av anti-korrelerte gruppe. Vi undersøkte også mulige funksjoner av anti-korrelert gruppe, som var ment å være regulert av mirnas, og fant at de var involvert i en rekke biologiske prosesser, inkludert metabolisme, immunsystem, celledreping, flercellet organisme utvikling, og celle-kommunikasjon ( Figur S3).
Vi klassifisert alle uttrykk variabel mRNA under lungekreft utvikling basert på deres forhold til miRNAs. Resultatene er klassifisert i korrelert, anti-korrelert, og andre (ingen korrelasjon). De korrelerte mRNA vise korrelerte uttrykk til sine regulatoriske miRNA uttrykk og anti-korrelert mRNA ikke. Tre forskjellige metoder ble brukt for å forutsi potensielle miRNA mål: «konservert» er de genene som har bevart miRNA bindingsseter blant virveldyr eller pattedyr, og disse genene ble spådd av
P
CT metode for TargetScan ; «TargetScan» er de genene som er spådd ved hjelp av et perl script av TargetScan uten å vurdere bevaring. «Miranda» er de gener som er spådd potensielle mål basert på Miranda v3.3a på Linux-plattformen. (A) Gene fordeling av de korrelerte og anti-korrelerte mRNA ble plottet basert på deres miRNA reguleringsverdier. (B) Gene fordeling av de tre grupper av mRNA ble plottet basert på deres ekspresjon verdier. Uttrykket verdien ble definert ved å referere til den for den tilstøtende normalt vev (log2). (C) Forholdet mellom genuttrykk og miRNA regulering.
Vi ytterligere bekreftet dette resultatet ved hjelp av spådommer om TargetScan uten å vurdere sekvenskonservering og spådommer for Miranda. Ved hjelp av Miranda, har vi 482 og 294 gener som anti-korrelert og korrelert, henholdsvis, og 1102 som «andre». Bruke TargetScan uten å vurdere bevaring, har vi 472 og 285 gener som anti-korrelerte og korrelert, henholdsvis, og 1121 som «andre». Vi undersøkt videre i skjæringspunktet mellom TargetScan og Miranda, og fant at de tre metodene delt ca 80% i anti-korrelerte gruppe; TargetScan og Miranda delt ca 70% gener i korrelert gruppen, mens
P
CT-metoden deles bare ca 50% gener med de resterende to metoder i korrelerte gruppen. I samsvar med resultatene av konserverte spådommer, mirnas i anti-korrelert gruppe synes regulere høyere andel av nedregulert mRNA i forhold til de øvrige gruppene er definert basert på følgende to metoder (tabell 3), og anti-korrelert gruppe utstilt påfallende forskjellig fordeling av regulering verdi i forhold til det korrelerte gruppen (figur 3A).
Vi deretter undersøkt mål ekspresjonsnivå av de tre reguleringsgrupper, og fant at ekspresjon nivået av anti-korrelert gruppe var høyere enn de øvrige grupper (Figur 3B). Videre undersøkelser av regulerings verdier med uttrykket nivå viste at høyt uttrykte gener i anti-korrelert gruppe tendens til å være nedregulert ved mirnas, mens ydmyk-uttrykte gener tendens til å være oppregulert. Gener i korrelert gruppen oppfører seg motsatt vei (Figur 3C). Dette resultatet antydet at høyt uttrykte gener kan bidra mer til nedregulert gener i anti-korrelert gruppen enn å opp-regulerte gener i samme gruppe.
Potential forhold mirnas med metylering i regulering mRNA uttrykk
Som metylering er en annen viktig mekanisme for å regulere mRNA uttrykk, vi videre studert hvordan det kan samhandle med miRNA regulering. Vi først kategorisert målet gener i HCG (høy CpG innhold), LCG (mellom CpG innhold), og ICG (lav CpG innhold) klasser (Tabell S2 og Tabell S3) ifølge en metode beskrevet tidligere [35]. Vi har funnet at i de konserverte prediksjonsresultater, både anti-korrelerte og korrelerte grupper inneholdt mer HCG gener enn andre eller alle gener (figur 4A), og resultatet antyder at HCG gener er mest sannsynlig å bli regulert av mirnas som har konserverte mål nettsteder.
(A) fordelingen av CpG-tetthet klassifisert gener i hver gruppe. Disse målgener ble spådd å bruke tre forskjellige metoder: «konservert» er de genene som har bevart miRNA bindingsseter blant virveldyr eller pattedyr, og disse genene ble spådd av
P
CT metode for TargetScan; «TargetScan» er de genene som er spådd ved hjelp av et perl script av TargetScan uten å vurdere bevaring. «Miranda» er de gener som er spådd potensielle mål basert på Miranda v3.3a på Linux-plattformen. (B) Forholdet mellom CpG island tetthet og genuttrykk. Tre grupper ble klassifisert. Alle uttrykte gener i NSCLC, miRNA-regulerte gener, og andre gener som ikke kan bli påvirket av mirnas
Siden et stort antall høyt uttrykte gener ble funnet i anti-korrelert gruppe, vi videre spurt om disse HCG genene er alltid høyt uttrykt og har en tendens til å miRNA-regulert. I alle gener uttrykt i NSCLC ble HCG gener ikke sett på som dominerende i høyt uttrykte gener i forhold til LCG eller ICG gener. Topp uttrykk for HCG området fra 5 til 10, mens de av ICG eller LCG gener er i et område på 2 til 7. miRNA en tendens til å regulere flere gener på det relative ekspresjonsnivået av 5 til 10, og derfor, når reguleres ved mirnas, toppen av ICG eller LCG genekspresjon bør være i dette området, og vi har observert at det var mindre LCG gener i dette uttrykket rekkevidde i forhold til HCG eller ICG gener. Imidlertid, «andre» (gener uten regulering verdi variasjon) har også en topp i uttrykket rekkevidde, men det var ingen forskjell i tetthet gen mellom de tre klassene CpG (figur 4B). Oppsummert kan HCG gener bli beriket gener som er regulert av mirnas på grunn av deres høye uttrykk nivåer, men dette er åpenbart ikke den eneste grunnen.
Vi har også utført GO analyse mellom miRNA-regulert og miRNA-insensitive grupper for å vise at deres gener og funksjoner er forskjellig fra de anti-korrelerte og de korrelerte gruppene (figur 5 og figur S5). Som det er vist i figur 5, inneholder miRNA regulerte gruppe flere gener i de følgende prosesser: transkripsjonen regulering, nukleinsyrebindende, cellekommunikasjon, metabolske, og utvikling regulering. Disse forskjellene demonstrere fra en annen vinkel, hvorfor mirnas en tendens til å påvirke HCG gener med konserverte miRNA målse som CpG øy innhold er alltid korrelert med genregulering og funksjonell differensiering, og disse genene kan være av betydning for grunnleggende cellulære funksjoner av forskjellige vertebrater eller pattedyr [36 ]
P
. 0,05 ble betraktet som signifikant [67]
Diskusjoner
i denne studien undersøkte vi mRNA. og miRNA profilering av NSCLC. mRNA profilering viste at et antall differensielt-uttrykte gener er involvert i aktivering av cellesyklus i NSCLC. Dette funnet er i samsvar med resultatene fra tidligere undersøkelser, noe som tyder på at unormal cellesyklus er assosiert med forhøyet risiko for lungekreft [37], [38]. Ned-regulerte gener er funnet å være hovedsakelig anrikes i immunsystemet, så vel som de som er lokalisert på cellemembraner, som vanligvis er korrelert med celle-celle-kommunikasjon og deltar i immunprosessen. Hemninger av disse genene er ment å legge til rette for utvikling av kreft lunge og progresjon, og dette kan til en viss grad skyldes utslipp av kreftceller fra deteksjon og ødeleggelse av vertens immunsystemet [39], [40], [41].
i miRNA profilering sammenligning fant vi HSA-MIR-96 var signifikant oppregulert i NSCLC. 48 HSA-MIR-96 potensielle mål ble hovedsakelig anriket på nedregulert mRNA gruppe og er involvert i en rekke biologiske prosesser i henhold til GO merknader. Basert på regulering verdianslag, viste vi at 42 av dem tilhører den anti-korrelerte gruppe (Figur 1A, Tabell S7). Validerings eksperimenter viste at den modne formen av HSA-MIR-96 er høyt uttrykt ikke bare i kreftvev, men også i sera fra cancerpasienter. Dette resultatet tyder på at HSA-MIR-96 har et stort potensial til å bli brukt som en ikke-invasiv biomarkør for NSCLC diagnose.
Vår nåværende kunnskap om HSA-MIR-96 er ganske begrenset. Det ligger i det intergeniske området mellom NRF1 og UBE2H på humant kromosom 7 [42], og har en meget bred fordeling blant dyr, fra nematoder til pattedyr, og er mer konservert blant virveldyr (figur S4). Tidligere studier har antydet at den fungerer for å regulere utviklingen av differensiering i pattedyr cochlea indre og ytre hårcellene [43], og er forbundet med aggressiv oppførsel humane [44]. I forhold til kreftformer, har HSA-MIR-96 er rapportert å være sterkt uttrykt i blærekreft, [45], prostatakarsinomer, [46], og kronisk myeloid leukemi [47]. Det kan påvises i urin og er korrelert med scene og karakter basert på urin cytologi av urothelial karsinom [48]. Oppregulering av HSA-MIR-96 resulterer i ned-regulering av transkripsjonen faktor FOXO3a og FOXO1, og således induserer celleproliferasjon i humane brystcancer [49], [50]. I våre analyser, fant vi et sett av potensielle mål som kan korrelerer med funksjonen av HSA-MIR-96 i NSCLC utvikling, men ingen av de potensielle mål har blitt validert av eksperimenter. Derfor er videre eksperimentering av essensen i å avsløre forholdet mellom HSA-MIR-96 og NSCLC. I tillegg vil vi øke størrelsen på prøven for å undersøke mulige forhold for HSA-MIR-96 uttrykk med prognose, og andre kjennetegn ved NSCLC.
Generelt er mirnas antas å binde 3 «uoversatt region av et mål mRNA og ned-regulere uttrykk ved mRNA eller protein nivåer, men det meste på mRNA nivå [51]. Derfor, når uttrykk for en miRNA er forhøyet, mRNA som er regulert av miRNA er forventet å være nedregulert; da uttrykk for miRNA er undertrykt, bør sitt mål mRNA vise up-regelverket. Imidlertid, ifølge våre resultater, anti-korrelert mRNAer er alltid nedregulert og bare en liten brøkdel av gener som er oppregulert. Videre undersøkelse antydet at i anti-korrelert gruppe, nedregulert mRNA er alltid sterkt uttrykt, og oppregulert mRNA er alltid ydmyk uttrykt. Derfor kan eksistensen av flere høyt uttrykte gener være en viktig bidragsyter til effekten. Grunnen til at høyt uttrykt mRNA tendens til å bli nedregulert ved mirnas og ydmyk-uttrykt mRNA pleier å være oppregulert ved mirnas antyder en eksistens av en regulatorisk balanse som fungerer for å holde hele transkriptomet i en optimalisert dynamisk område.
i vår analyse har vi ikke klart å finne noen ledetråder som er ansvarlig for forskjellen mellom den anti-korrelerer og korrelerte mRNA. GO klassifisering viste ingen åpenbar forskjell enten (figur S5). I tillegg uttrykk nivåer av målet mRNA som har en høy regulering verdi viste ikke signifikant variasjon, og vice versa (Tabell S2, tabell S3, Table S7, Table S9, Tabell S11), og gener som uttrykk er betydelig variert er ikke nødvendigvis betydelig regulert. Siden et mRNA er ofte regulert av mer enn én mirnas [28], er vi fortsatt ikke i stand til å vite hvordan disse mirnas samhandler med hverandre, og hvilken type av direkte interaksjon er mest effektive. Videre kan mirnas undertrykke sine mål gener bare på proteinnivå [52] og målene kan ikke vise merkbare endringer på mRNA-nivå. Det er andre faktorer som er involvert i regulering av mRNA på epigenetiske nivåer, for eksempel histone metylering [53], [54] og acetylering [55], [56], og som alltid er i stand til å forstyrre miRNA-sentriske nettverk [57] [58], noe som gjør tyde slike nettverk vanskeligere.
en annen interessant observasjon er at gener i enten korrelerte gruppe eller anti-korrelert gruppen har en større andel av HCG gener enn at «andre» gruppen. Både korrelert og anti-korrelert grupper anses mest sannsynlig å bli påvirket eller muligens regulert av miRNAs. Dette resultatet tyder på at mirnas har en tendens til å regulere HCG gener. Videre undersøkelser viste at HCG gener tendens til å uttrykke på et høyere nivå sammenlignet med ICG eller LCG gener. Derfor kan det være en mulighet for at flere HCG gener er påvirket av mirnas. Men sammenligninger basert på alle potensielle mål klarte ikke å vise noen forskjell mellom disse gruppene (figur 4A). Som den strenge standarden utvalgte mål har konservert bindingssteder av mirnas blant virveldyr eller pattedyr, mer HCG målgener i miRNA-inspirert gruppe kan relatere til genet utviklingen blant virveldyr.
GÅ sammenligning mellom det regulerte og uregulerte grupper demonstrert de var ganske forskjellige som tidligere alltid inneholder flere gener som er involvert i transkripsjon regulering, nukleinsyre bindende, celle kommunikasjon, metabolske og utvikling regulering. Funksjonen av gener og deres uttrykk er alltid korrelert med CpG island innholdet av arrangører. Det har vært antydet at vaktmester funksjoner er betydelig overrepresentert i HCG klassen, mens begreper knyttet til spesifikke funksjoner karakteristisk for mer differensierte eller strengt regulerte celler er betydelig overrepresentert i LCG klassen [36], [59]. miRNA blitt foreslått å være en primær reguleringsmekanisme som det er til stede fra lave til høye organismer, er det derfor foretrekker å regulere en høyere andel av HCG gener for grunnleggende cellefunksjoner.
