Abstract
Nye strategier som er rettet mot epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) har ført til den kliniske utviklingen av monoklonale antistoffer, som behandle metastatisk kolorektalcancer (mCRC), men bare undergrupper av pasienter med økt villtype KRAS og EGFR-genet kopi, svare på disse midlene. Videre er motstanden mot EGFR blokade uunngåelig forekommet, slik at fremtidig behandling vanskelig. Nye bio-imaging (BOI) metoder kan bistå i kvantisering av EGFR i mCRC vev og dermed utfyller immunhistokjemi metodikk i guiding fremtidig behandling av disse pasientene. Hensikten med denne studien var å undersøke nytten av nær infrarød-merket EGF (EGF-NIR) for bio-avbildning av CRC ved hjelp av
in vitro Hotell og
in vivo
orthotopic tumor CRC modeller og
ex vivo
menneskelige CRC vev. Vi beskriver fremstillingen og karakteriseringen av EGF-NIR og undersøke binding, ved hjelp av BOI av et panel av CRC cellekultur modeller som likner heterogenitet av humane CRC vev. EGF-NIR ble spesifikt og selektivt bundet av EGFR-uttrykkende CRC-celler, intensiteten av EGF-NIR-signalet til bakgrunnsforhold (SBR) reflektert EGFR-nivåer, dose-respons og tidsforløp bildebehandling eksperimenter gitt optimale betingelser for kvantisering av EGFR nivåer ved BOI. EGF-NIR avbildning av mus med HT-29 ortotopisk CRC tumor indikerte at EGF-NIR er mer langsomt fjernet fra tumoren og den høyeste SBR mellom tumor og normalt vev tilstøtende ble oppnådd to dager etter injeksjonen. Videre bilder av dissekerte vev viste akkumulering av EGF-NIR i svulsten og leveren. EGF-NIR spesielt og sterkt merket EGFR positive menneskelige CRC vev mens tilstøtende CRC vev og EGFR negative vev uttrykt svake NIR signaler. Denne studien vektlegger bruk av EGF-NIR for prekliniske studier. Kombinert med andre metoder, kan EGF-NIR gi en ekstra bio-imaging spesifikke verktøy i standardisering av målinger av EGFR uttrykk i CRC vev
Citation. Cohen G, Lecht S, Arien-Zakay H, Ettinger K , Amsalem O, Oron-Herman M, et al. (2012) Bio-Imaging av tykktarmskreft modeller ved hjelp av nær-infrarødt Merket epidermal vekstfaktor. PLoS ONE 7 (11): e48803. doi: 10,1371 /journal.pone.0048803
Redaktør: Anthony WI. Lo, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 17 juni 2012; Godkjent: 01.10.2012; Publisert: 08.11.2012
Copyright: © 2012 Cohen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet rapportert her ble støttet av Bio Medical Photonics (BMP) konsortium, israelske Nærings- og handelsdepartementet, MAGNET program. Konsortiet ledelse ikke har noen rolle i design, datainnsamling og analyse, eller utarbeidelse av manuskriptet. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en av de vanligste kreftformen hos de vestlige samfunn. Langsiktig overlevelse av CRC-diagnostiserte pasienter er korrelert med sykdom stadium ved diagnose. I tidlige stadier, så vel som i utvalgte pasienter med langt fremskreden sykdom, er operasjonen den viktigste modalitet behandling [1]. Minst 40% av pasienter med CRC vil utvikle enten synkrone eller metachronous fjernmetastaser, vil de fleste av dem bukke under for sin sykdom og dø [2]. Noen av egenskapene av den ondartede fenotypen til CRC er korrelert med overekspresjon og hyper-aktivering av reseptor tyrosinkinaser så som epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR), som gjør disse reseptorene attraktive mål for kreftbehandling [3]. I de fleste CRC pasienter, progresjon fra normal colonic slimhinne til kreft innebærer en definert kaskade av molekylære endringer, som sprer seg over årene [4]. Endoskopisk polypektomi ble vist å redusere CRC relatert dødelighet [5]. Denne fremgangsmåten krever fibro-optisk koloskopi visualisering av CRC vevet etterfulgt av histologisk evaluering. I tillegg CRC vev er ofte evaluert av RT-PCR [6], immunhistokjemi [7] og
i situ
hybridisering [8] teknikker, som viste en mye høyere grad av uoverensstemmelse mellom primærvalg og relaterte CRC metastaser [ ,,,0],9].
EGFR er ofte overuttrykt i en rekke av fast tumor, i hjernen, bryst, lunge, eggstokk og bukspyttkjertel, og er forbundet med økt metastatisk potensiale og dårlig prognose av CRC [10]. Biologiske legemidler som hemmer EGFR har vist klinisk aktivitet som enkle midler eller i kombinasjon med kjemoterapi, er den mest lovende av disse midlene blir cetuximab og panitumumab. Dessverre er disse antistoffene er klinisk effektive i bare et mindretall av pasientene med CRC [11]. Den kliniske Suksessen til disse monoklonale antistoff-terapi er jevnt begrenset av utviklingen av ervervet resistens mot EGFR blokade [12]. En mekanisme for å motstand ble nylig belyst: cetuximab resistente celler inneholder en EGFR-mutasjon i det ekstracellulære domenet (S492R) som svekker cetuximab, men ikke epidermal vekstfaktor (EGF) binding [12]. Derfor, siden responsen overfor terapi kreve at EGFR mål å være til stede, er utviklingen av BOI metoder for kvantitativ påvisning av EGFR proteinnivåer i CRC primære og sekundære tumorvev nødvendig, for å lede behandling av individuelle valgt for EGFR-målrettet antistoff behandling og spesielt de som får tilbakefall mens på EGFR-målrettet mot terapier [13]. Ankomsten av EGFR-målrettede antistoffer, cetuximab og panitumumab har banet vei for individualisert medisin av mCRC. Gjeldende data tyder på at evalueringen av KRAS og BRAF mutasjon og PI3K /PTEN endring kan være nyttig for å velge pasienter som er usannsynlig å svare på anti-EGFR-målrettede antistoffer. Det ble funnet at responderende svulster CRC bærer villtype KRAS /BRAF og har en tendens til å ha en beskjeden, øke kopiantallet av EGFR-genet, som er oversatt til en beskjeden økning i EGFR nivå. Derfor vil EGFR genkopitallet påvisning og kvantitativ evaluering av EGFR proteinnivået sannsynlig bedre skreddersøm av cetuximab og panitumumabs terapi for mCRC pasienter [12]. Men de tekniske vanskeligheter ved immunhistokjemi teknikk, som brukes til å vurdere ekspresjon av EGFR i faste vev, kan ha begrenset påvisning av små EGFR proteinnivået øker så langt [11]. Derfor er nye sensitive BOI metoder for EGFR protein nivå i mCRC nødvendig. EGFR scintigrafi, representerer en slik metode som er basert på binding, internalisering og oppbevaring av de radiomerkede EGFR-målrettede midler i intracellulære og har blitt demonstrert med radiomerket EGF og med radioaktivt merket monoklonalt antistoff rettet mot EGFR [14]. Imidlertid er ulempen med disse metodene bruk av radioaktive materialer
I nærheten av infrarød (NIR) optisk BOI tilbyr unike fordeler for diagnostikk av mCRC. Den tilbyr høy følsomhet, den kan brukes med ulike NIR-koder og det kan gi dynamisk, sanntid
in vitro Hotell og
in vivo
bilder av ikke radioaktive midler [15]. NIR lys (700-1000 nm bølgelengde) kan trenge inn i vev, og tilbyr en potensielt trygg, ikke-invasiv metode for å karakterisere svulstene [16]. I de fleste anvendelser er NIR BOI benyttes for å assistere målrettede fluorescerende kontrastmidler som ikke bare gir forbedret kontrast, men også enda viktigere, avslører spesifikke molekylære hendelser assosiert med CRC tumor initiering og progresjon [17]. Nyere studier har etablert bruk av Affibody-mediert målretting av NIR hissige fluorescerende kontrastmidler for påvisning av ondartede celler og svulster [18].
Derfor målet med denne studien var å utvikle og karakterisere romanen
in vitro
CRC modeller som lignet CRC heterogenitet og for å vurdere om det er mulig å kvantifisere graden av EGFR i
ex vivo
ferske vevsprøver, orthotopic svulst i mus og nyutviklede cellelinjer modeller CRC ved hjelp av EGF konjugert med IRDye 800CW (EGF-NIR) sonde. Vi har funnet optimale forhold for BOI av EGFR ved hjelp av EGF-NIR sonde i disse modellene, som gjelder for endoskopisk og Odyssey infrarød bildesensor analyser. Videre, ved hjelp av bildeprosessering analyse og western-blotting bekreftet vi at intensiteten av EGF-NIR-signalet til bakgrunnsforhold reflekterer EGFR proteinnivået i
in vitro
CRC-modeller og
in situ
human CRC vev undersøkt.
(A) reaksjons~~POS=TRUNC for syntesen av EGF-NIR-konjugat, den første aminosyren asparagin på den aminoterminale er angitt som Asn1. (B) Separasjon av syntesereaksjonsblandingen på gelgjennomtrengningskromatografi og av EGF-NIR prøve fra gel-gjennomtrengningskromatografi på (C) anionbytterkromatografi; EGF-NIR-komplett linje (800 nm); gradient av NaCl-stiplet; ukonjugert EGF-stiplet linje. (D) HPLC-separasjon av EGF-NIR renset fra anionbytterkromatografi. Full linje representerer absorbans ved 226 nm og stiplede linjen viser graderingen. Sett-12% SDS-PAGE analyse av 10 mikrogram av EGF-NIR skannet med Odyssey og umodifisert EGF farget med Coomassie blå. (E) NIR spekteret av EGF-NIR [eksitasjon (grå linje) og utslipp (svart linje)]; Sett-IRDye 800CW NHS ester; (F) EGF-induserte NIR Erk fosforylering.
HT-29-celler ble inkubert i 15 minutter ved 37 ° C (A) og 4 ° C (B) med 7 nM EGF-NIR-i nærvær eller fravær av 100 nM EGF. Konkurranse eksperimenter med 500 nM av cetuximab, TGF-α eller NRG1 ble også gjennomført. I kontrolleksperimenter ble kulturene inkubert med 7 nM NIR-Dye å evaluere ikke-spesifikk merking av cellene. NIR-intensiteten ved 800 nm ble bestemt under identiske forhold for alle kulturer og gjennomsnitt ± SD (n = 9) er presentert. Øvre inserts: NIR skanner; lavere innsatser: fase kontrast photomicrographs av kulturene, * p 0,05 vs. NIR-Dye; ** P 0,05 vs. EGF-NIR
HT-29 celler ble transfektert i 2 dager med 5 nM anti-EGFR Silencer velge siRNA eller egge RNA eller venstre ubehandlet (kontroll).. Evaluering av EGFR uttrykk ble utført av In Cell NIR avbildning ved hjelp 7 nM EGF-NIR (svarte striper) og Western blotting (grå søyler). Verdiene er gjennomsnitt ± SD (n = 3). * P. 0,05 vs. kryptert eller kontroll
Materialer og metoder
Cell Culture
Menneskelig tykktarmskreft cellelinjer HT-29, SW620, COLO205, A431 humane epitelceller plateepitel carcinom celler og rotte tynntarm epitelial celle klon IEC-6 ble anskaffet fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og justert for vekst i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) inneholdende 10% føtalt bovint serum, 2 mM L -glutamine og 10 000 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Cellene ble dyrket ved 37 ° C, 6% CO
2 i en fuktet inkubator. Alle forsøk ble utført under GLP-betingelser ved bruk av et rent rom i henhold til krav ISO7 (10.000 partikler /m
3).
Fremstilling, rensing og karakterisering av EGF-NIR
EGF- NIR ble syntetisert i henhold til LI-COR biovitenskap (Lincoln, NE, USA) instruksjoner ved hjelp IRDye 800CW NHS ester (2-(3-{5-[7-(5-amino-1-carboxy-pentylcarbamoyl)-heptanoylamino]-1-carboxy-pentyl}ureido)-pentanedioic syre) for konjugering til human rekombinant EGF (Peprotech, Asia, Rehovot, Israel). I korthet, EGF (32 nmol) ble inkubert med 5 ekvivalenter av IRDye 800CW NHS-ester i 1 M K2HPO4, pH 9,0, i 2 timer i mørke ved 20 ° C, under omrøring. Etter konjugering, ble koblingen blanding av frie reagenser og EGF-NIR påført Hiprep 26/10 (Fine Sephadex G-25, partikler størrelse 90 mikrometer) avsalting kolonne (GE Healthcare, biovitenskap, Buckinghamshire, UK) med et volum på 55 ml (Vo = 15 ml). Denne kolonnen ble ekvilibrert og eluert ved 10 ml /min med destillert vann ved hjelp av FPLC AKTA P900 instrument (GE-Healthcare og biovitenskap, Buckinghamshire, UK). Dette ble etterfulgt av oppsamling av det utelukket topp og å justere den til pH 8,0 ved tilsetning av 1 ml av 0,02 M Tris HCl buffer (pH 8,0). Oppløsningen ble anvendt for anionbytterkromatografi på HiTrap DEAE FF (DEAE Sepharose High Flow, GE Healthcare, Life Sciences, Buckinghamshire, UK) ekvilibrert med 0,02 M Tris HCl buffer (pH 8,0) ved en strømningshastighet på 1 ml /min og EGF -NIR ble eluert fra kolonnen ved anvendelse av en gradient på 1-100% NaCl i ekvilibreringsbuffer. Det rensede EGF-NIR ble dialysert i 3000 avskåret dialyseposer (Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA) i 14 timer i mørket ved 4 ° C mot destillert vann. Den destillerte oppløsning ble lyofilisert, og 0,1 mg tørre prøver av EGF-NIR oppløst i 1% trifluoreddiksyre (TFA) ble til slutt separert ved HPLC ved anvendelse av en Sperisorb DDS2 kolonne (LKB instrumenter, Gaithersburg MD) ved anvendelse av to lineære gradienter: den første gradient 10-35%, etterfulgt av en andre gradient av 35-85% acetonitril i 1% TFA. Rensingen ble utført ved en strømningshastighet på 4,7 ml /min (100 bar trykk). Den fullstendige løpe fortsatte i 45 minutter og den EGF-NIR toppen ble beregnet ved optisk absorbans ved 226 og 700 nm. Molar konsentrasjoner av fargestoffer og EGF ble beregnet ved hjelp av molare ekstinksjonskoeffisientene av 270 000 M
-1cm
-1 for IRDye 800CW på 780 nm, og 18 000 M
-1cm
-1 for EGF. Absorbans ved 280 nm ble anvendt for å beregne proteinkonsentrasjon EGF basert på dens molare ekstinksjonskoeffisient. Absorbansen dobbelt bølgelengde ble benyttet for å bestemme farvestoff: protein-forhold. EGF-NIR Misjon ble målt i PBS ved hjelp av et fluor-Max 4 spectrofluorimeter (JY Horiba, Edison, NJ, USA) med en Xenon buelampe som eksitasjon kilde til 774 nm i 1 cm skål, og med en skannehastighet på 80 nm /sek. For validering, ble EGF-NIR fra LI-COR biovitenskap (Lincoln, NE, USA) også brukt. EGF-NIR ble sendt inn for analyse på 12% SDS-PAGE sammenlignet med innfødte, umerket EGF. Prøver av 10 ug protein ble separert og visualisert ved commassie blåfarging og NIR-utslipp ble målt ved posisjonering og skanning av gelen i Odyssey® infrarød bildesensor (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA).
Western blotting av EGFR og Erk fosforylering
nivåene av EGFR i cellelinjer og CRC vev og Erk fosforylering, ble beregnet ved ekstraksjon med cellelyse buffer (Cell Signaling Technology, Inc. Danvers, MA, USA). Evnen av EGF-NIR å stimulere ERK-fosforylering i A431-celler ble sammenlignet med umerket EGF. 2 x 10
6-celler ved 90% konfluens i en 6-brønners plate ble serum-sultet i 2 timer. Sult media ble erstattet med vanlig medium som inneholder 7 nM EGF-NIR. Celler ble inkubert i 15 minutter ved romtemperatur og høstet. 50 ug protein lysater ble separert ved 10% polyakrylamid SDS-PAGE og overført på is til nitrocellulosemembraner (90 V i 1,5 timer, Whatman, Dassel, Tyskland). Ikke-spesifikk binding ble blokkert ved inkubering av membranene i 2 timer ved romtemperatur (RT) med 5% ikke-fett tørrmelk (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) i Tris-bufret saltvann inneholdende 0,1% Tween-20. Immundeteksjon ble utført med monoklonalt anti-EGFR-antistoff (Cell Signaling Technology, Inc. Danvers, MA, USA) eller primære antistoffer (1:1,000) mot fosfor-eller pan-ERK1 /2 (Cell Signaling Technology, Inc. Danvers, MA, USA), etterfulgt av pepperrot peroksidase (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, USA) og utviklet med ECL (Pierce, Rockford, IL, USA)
(A) Venstre. en ordning med CRC polypp med høy flekker av transform CRC celler (fokusområdet) og heterogene området, inkludert både normale og transform CRC celler; Midten: generering av en heterogen blanding ved forskjellige forhold (%) mellom HT-29 og SW 620; 0 – ingen celler; + /++ -presence Forskjellige cellekonsentrasjoner; Høyre: focal plating (i en ring) av HT-29 og A431 mono omgitt av SW620 enkeltlag; Sett-nivået av EGFR (170 kD) og ikke-modne EGFR (150 kD) i cellene; (B) Forholdet mellom NIR intensiteten av 15 min binding med 7 nM EGF-NIR (gjennomsnitt ± SD, n = 9) og prosentandelen av SW620 i celleblandingen med enten HT-29 (fylte sirkler) eller HCT116 (åpen sirkler) * p 0,05 vs. 100% SW620; (C) Forhold mellom SBR (gjennomsnitt ± SD, n = 9) og EGF-NIR-konsentrasjon; A431 (åpne sirkler); HT-29 (fylte sirkler); binding ble utført i 15 minutter. Sett inn: NIR skanner; * P 0,05 vs. 0,01 nM; (D) Kinetikken til 7 nM EGF-NIR-binding (gjennomsnitt ± SD, n = 9) til brenn kulturer av A431 (åpne sirkler) eller HT-29 (lukkede sirkler); Sett inn: NIR skanner; * P. 0,05 vs. 0 min
Utarbeidelse av
in vitro
CRC Modeller og i Cell NIR Imaging (IC-NIR)
Homogen monolag av en individuell cellelinje.
CRC-celler ble sådd ut ved en tetthet på 150.000 celler /brønn i 12 brønner vevskulturplater (Nunc, Rochester, NY, USA) to dager før eksperimentene genererer homogen celle monolag. Deretter ble kulturmediet erstattet med friskt medium inneholdende 7 nM EGF-NIR, i 15 minutter ved 4 ° C og 37 ° C, for å måle total binding. Ved slutten av forsøket ble kulturene vasket tre ganger med 1 ml PBS og celleassosiert NIR intensitet ble bestemt. For å evaluere ikke-spesifikk binding, ble beslektede kulturer inkubert med den samme konsentrasjon av EGF-NIR, ved de samme betingelser, i nærvær av overskudd av 100 nM EGF. Spesifikk binding av EGF-NIR-avbildning er definert som differansen mellom den NIR intensiteten av total binding og NIR intensiteten av ikke-spesifikk binding. Konkurranse eksperimenter med 500 nM enten cetuximab, som skaper vekstfaktor α (TGF-a) eller neuregulin 1 (NRG1) ble utført ved samtidig inkubasjon av konkurrenten med EGF-NIR. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SD av minst tre uavhengige eksperimenter (n = 9). NIR bilde ble estimert ved hjelp Odyssey infrarød bildesensor på følgende vilkår varierer: oppløsning: 170-340 mikron; pikselområde: 0,03 mm
2 (ca. 15-20 celler); kvalitet: middels lav; fokusere offset: 1-3; kanaler: 800 nm; intensitet: 1-3.
Heterogene samlings monolag av CRC celler
For å etterligne forhøyninger av transform CRC cellene i polypp [19] og for å muliggjøre direkte målinger av signal til bakgrunn ratio i. det samme eksperiment, et midtcellekultur tilnærmingen ble anvendt. Ulike kolorektal kreft cellelinjer (med ulike nivåer av EGFR) eller 15 × 10
3 A431 (høye nivåer av EGFR) ble belagt til konfluens i en 4 mm indre diameter kloning ring (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA ) plassert i midten av en brønn. Celler ble overlatt til følge i 2 timer i en inkubator. Deretter ble 15 x 10
3 SW620-celler (som mangler EGFR) ble sådd ut i det cellefrie område rundt kloning ring og igjen å følge i 2 timer ved de samme betingelser. To typer av slike eksperimenter ble utført: a. ett fokus. b. to brennpunktene. Ved slutten av cellene skulle vedhefte trinn, ble kloningsringen fjernet og cellene ble vasket med kulturmedium. To dager etter generering av modellen, ble kulturene utsatt for binding og bildebehandling eksperimenter som tidligere beskrevet. Signal /bakgrunnsforhold (SBR) verdier indikerer forholdet av NIR fluorescente signalet fra den sentrale sirkelen (fokal område av CRC eller A431-celler) til NIR fluorescente signalet fra utenfor området (SW620).
Ulike CRC-celler ble fokalt belagt på en bakgrunn av IEC6 enterocyte enkeltlag. Kulturene ble inkubert i 15 minutter ved 37 ° C med 7 nM EGF-NIR i nærvær (ikke-spesifikk binding – hvite søyler) eller fravær (total binding – grå søyler) på 100 nM umodifisert EGF. Signalet (CRC cellelinje) /bakgrunn (IEC6) forholdet ble beregnet til identiske betingelser for alle kulturer og er presentert som gjennomsnitt ± SD (n = 9). Betydning: * p 0,05 sammenlignet med IEC6 verdier; ** P 0,05 sammenlignet med total binding av den respektive gruppen p 0,05 sammenlignet med A431 og 0,05 sammenlignet med COLO 205; Lavere inserts: NIR skanner; Øvre inserts: venstre-EGFR protein uttrykk ved Western blotting; pil indikerer posisjonen til modne EGFR 170 kD-proteinet og ikke-glykosylert 150 kD-proteinet; høyre-mRNA uttrykk for CEA og β-aktin i cellekulturer.
Heterogene suspensjoner av CRC celler.
For å etterligne heterogen fordeling av transform CRC cellene i polypp [20] og for å muliggjøre vurdering av sensitiviteten for påvisning av den minimale mengde av EGFR-uttrykkende celler hos normale kontroll enterocyttene, heterogent blandede kulturer av HT-29 og SW620-celler ble fremstilt. Suspensjonskulturer av HT-29 ble blandet med suspensjonskulturer av SW620 for å generere ulike prosentandel av de enkelte cellekulturen i det samme volum. SW620-celler kunne skjelnes fra HT-29 celler ved deres langstrakte morfologi. Ved betingelser som er betegnet som «0%» suspensjonen inneholder 0% HT29-celler og 100% SW620-celler, og ved «100%», inneholder suspensjonen 100% HT-29 celler og 0% SW620 celler. I de andre tilfeller prosenter angir forholdet mellom prosent HT-29 celler og andelen av SW620-celler. Bindings eksperimentelle betingelser og målinger av NIR fluorescerende intensitet (vilkårlige enheter /mm
2) av de forskjellige heterogene kulturene ble utført som ovenfor.
(A) Fotografi av en ortotopisk tumor og EGFR-protein ekspresjon i svulster; (B) Tidsforløp av EGF-NIR-akkumulering i vev fra tumorbærende mus. Musene ble injisert i.v. med 1 nmol av EGF-NIR i ubehandlede mus (øvre rad, n = 6) eller mus på forhånd injisert med 1 ug /ml cetuximab (nederste rad, n = 4); høy oppløsning BOI av en mus injisert med EGF-NIR og sirklene viser ROI-målinger (C) Tid løpet av vev opphopning av EGF-NIR på 48 timer fra mus som presenteres i B; Signalintensitet ved 800 nm ble normalisert til bakgrunnsfluorescens ved hjelp av en vilkårlig tumor krets (10-20 ROIs /mus) sammenlignet med et identisk område på flanken (tilstøtende muskel); * P 0,05 sammenlignet med EGF-NIR 4 timer; ** P 0,05 sammenlignet med mus injisert med EGF-NIR; (D) EGF-NIR signal /bakgrunnsforhold i isolert vev fra tumorbærende mus 48 timer etter injeksjon. * P 0,05 sammenlignet med muskel, ** p 0,05 sammenlignet med leveren; Sett inn: Øvre-fotografier av vev i retten; Midt-NIR bilder; Nedre-spektral intensitetskart; Intensitet skala-rød-brun (5) høy uttrykk; blå (3) svært lav uttrykk.
RT-PCR og EGFR siRNA lyddemping
Total RNA ble isolert og genomisk DNA ble degradert fra RNA preparater, med SV total RNA isolering system (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland). 1 ug total RNA ble revers transkribert (Promega, Madison, WI, USA), ifølge produsentens instruksjoner. PCR ble utført i et sluttvolum på 50 pl inneholdende 5 ug cDNA, 50 pmol av hver oppstrøms og nedstrøms forstand sense primere av CEA eller EGFR [21], [22], og 25 ul av GoTaq® Grønn Master Mix (Promega, Madison , WI). PCR-eksperimenter ble utført i 35 sykluser. For å generere forskjellige cDNA-fragmenter, ble en Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Tyskland) som er programmert som følger: denaturering ved 95 ° C i 1 minutt, hybridisering ved 61 ° C og forlengelse ved 72 ° C i 1 min. Å slå ned EGFR standard amin transfeksjon agenten protokoll fra Ambion (Applied Biosystems, Austin, TX, USA) ble fulgt. Kort, 5 nM av 21 mer anti-EGFR Silencer velge små forstyrrelser RNA (siRNA) og egge RNA ble revers transfektert inn i A431-cellekulturer ved hjelp siPORTNeoFX transfeksjon middel ifølge produsenten protokollen. Cellene ved en tetthet på 80.000 celler /ml ble påført på 12-brønners plater og 2 dager etter transfeksjoner ble analysert. Slå ned av EGFR mRNA ble bekreftet ved Western blotting. Følgende carcinomaoppfinnelse embryonale antigen (CEA) og EGFR primere, utarbeidet av SyntezzaBioScience Ltd., Jerusalem, Israel, ble brukt:
Menneskelig CEA CAM5: Sense: 5′-CGCATACAGTGGTCGAGAGA-3 «; Antisense: 5»-ATTGCTGGAAAGTCCCATTG-3 «
Rat CEA1: Sense: 5′-CTACAGGCTGAGGGATGCTC-3′ Antisense: 5′-GGTCCCGTCACAGTTACGTT-3 «
Menneskelig EGFR: Sense: 5′ CGAGGGCAAATACAGCTT-3 «Antisense: AAATTCACCAATACCTATT-3»
Menneskelig EGFR siRNA: Sense: 5′-CCAUAAAUGCUACGAAUAUtt-3 «Antisense: 5′-AUAUUCGUAGCAUUUAUGGag-3»
egge~~POS=TRUNC siRNA: Sense: 5 «-UAACGACGCGACGACGUAATT-3′ Antisense: 5»-UUACGUCGUCGCGUCGUUATT-3 «
Utarbeidelse og NIR Imaging av CRC ortotopiske Svulster i Mus
Denne studien bruker Mann Balb /c naken (Harlan Israel) mus ble godkjent, utført og overvåket av retningslinjene i The Chaim Sheba Medical Center Animal Care og bruk komité. HT-29 celler ble trypsinert, vasket og resuspendert i en konsentrasjon på 1 x 10
7 celler /ml i PBS. For tumorimplantering ble musene bedøvet ved intra-peritoneal injeksjon av en blanding av ketamin (100 mg /kg) og xylazin (20 mg /kg). Trans-anal injeksjon av 1 x 10
6 HT-29 celler ble utført i henhold mikroskop forstørrelse (X40) med en 27 g nål. Injeksjonen ble rettet submucosally inn i den ytre, bakre endetarmen, ca 2-3 mm utover endetarmen og inn i endetarmsslimhinnen [23]. Musene ble overvåket to ganger ukentlig i startfasen og progresjon. Svulster nådd ~ 0,75 cm i størrelse på 3-4 uker.
In vivo
avbildning av EGF-NIR fluorescens i mus ble utført med en LI-COR biovitenskap små dyr imager Odyssey MousePOD®. For å visualisere tumorer, 1 nmol av EGF-NIR i 100 ul saltvann ble injisert via halevenen inn i tumor-positive mus i nærvær (n = 4) eller fravær (n = 6) av cetuximab (1 pg /ml) og evaluert for systemisk clearance av NIR-avbildning ved intervaller på 1-8 timer over et tidsrom på tre dager, hvoretter mer enn 95% av signalet var fjernet. Musene ble fotografert inntil to dager etter injeksjon og avlives. Statistisk analyse av bildene for hver mus ble normalisert ved hjelp av samme intensitet skalaer, på de vilkår som er beskrevet tidligere. SBR ble beregnet som følger: betyr NIR intensiteten av tumor dividert med midlere NIR intensiteten av bakgrunnen for den tilstøtende muskel. Regioner av interesse (ROI) med identiske områder ble brukt til både svulsten og bakgrunn. Standardavviket til middel bakgrunn ble beregnet ved hjelp av 10-20 Rois. På grunn av tumorstørrelsesforskjeller mellom de dyrene som fikk EGF-NIR, tumor signal dividert med bakgrunnssignalet av samme størrelse ROI korrigert for område (piksler), forutsatt at svulsten to-dimensjonale (2D) total merking. Svulster, skjelettmuskulatur og levervev fra avlives mus ble dissekert og deres urinprøver ble innsamlet. Vevene ble veid og innført i plastrør retter. Rettene ble skannet på Odyssey infrarød bildesensor. NIR intensiteten av avkastningen av svulsten ble sammenlignet med tilstøtende muskel til å generere SBR. Isolerte vev analyser ble utført ved scanning ved 800 nm kanal, for at vevet akkumulerte EGF-NIR fluorescens-signalet og den SBR ble beregnet. NIR bilde ble anslått til følgende forhold: oppløsning: 170-340 mikron; pikselområde: 0,03 mm
2; kvalitet: middels lav; fokusere offset: 1-3; kanaler: 800 nm; intensitet: 1-3.
Pasienter og CRC Tissue prøvetaking
18 pasienter over 18 år med histologisk bekreftet primært adenokarsinom i tykktarmen ble tilbudt deltakelse i studien. 5 pasienter som fikk før stråling eller kjemoterapi var ikke kvalifisert for studiet. Studien protokollen ble godkjent av Institutional Review Board (IRB, Helsingforskomiteen) av Hadassah-Hebrew University Medical Center. Alle prøver ble innhentet fra samtykkende forsøkspersonene gjennomgår kirurgisk tumorreseksjon som signerte en skriftlig informert samtykke. Alle prøver gikk rutine makroskopisk og mikroskopisk analyse av et styre sertifisert patolog henhold til College of American Patologer (CAP) retningslinjer for histopatologi rapportering (www.cap.org). Vev identifisert av studien patolog som colonic adenokarsinom og tilstøtende vev [24] ble deretter brukt for IC-NIR bildebehandling.
36 Skiver av CRC vev og 19 skiver av tilstøtende kolon vev (n = 10-15 avkastning i hver skive) ble innsendt for
ex vivo
bindingsanalyse i 45 minutter ved 37 ° C med 70 nM EGF-NIR i nærvær (ikke-spesifikk) eller fravær (total binding) av 1 uM umerket EGF. NIR-intensitet ble anslått til identiske betingelser for alle skiver (n = 12). Betydning: * p 0,01 sammenlignet med tilsvarende gruppe i tilstøtende tykktarm EGFR, ** p 0,05 sammenlignet med tilsvarende gruppe i CRC vev EGFR; Sett inn: typisk western blotting for EGFR av sektorene undersøkte
Bilder av fem typiske skiver, spesielt merket med EGF-NIR, som beskrevet i legende for Fig.. 7. 800 nm Odyssey infrarød bildesensor kjøpte bildene ble behandlet ved hjelp av anvendt spektral bildebehandlingsprogrammer, Spectral View. Intensitet skala-rød-brun (5) høy ekspresjon av EGF-NIR bindende; grønn (4) mellom uttrykk; blå (3) svært lav uttrykk.
NIR BOI av CRC Vev
Fresh svulstvev eller tilstøtende kolon vev ble delt i horisontale skiver, 230 mikrometer tykk, som ble utarbeidet med en vibratome VT1000S (Leica, Nussloch, Tyskland) og inkubert i iskald DMEM bindende oppløsning. Skivene ble overført til 24 brønners vevskulturplater fylt med DMEM mettet med 95% O
2 og 5% CO
2 ligner forholdene til rette rektal organkulturer [25]. Platene ble holdt på is i 45 min varighet i DMEM og bindingsforsøk ble utført ved tilsetning av 70 nM EGF-NIR i nærvær (ikke-spesifikk binding) eller fravær (total binding) av 1 uM av umodifisert EGF. Fra hvert vev, ble triplikate skivene inkubert med 70 nM NIR-Dye (IRDye800CW) for å evaluere ikke-spesifikk binding av fargestoffet. Bindingen Eksperimentet ble avsluttet ved vasking av vevet tre ganger med kald PBS. De våte skiver ble overført til nye 24-brønners plater i 1 ml /brønn PBS og skannet for NIR avbildning intensitet ved hjelp av Odyssey infrarød bildesensor, under de forhold som er beskrevet ovenfor. Serielt, over en periode på to år, 43 CRC og 23 prøver tilstøtende kolon vev ble evaluert. ROIs med identiske områder ble anvendt for skiver fra de ulike forsøksgrupper. De gjennomsnitt og standardavvik av NIR intensitet (vilkårlige fluorescerende enheter /mm
2-området) ble beregnet ved bruk av 10-15 ROIs i hvert enkelt skive. Hver skive legges for EGF-NIR bindende eksperiment ble også evaluert etter bildebehandling for EGFR uttrykk ved Western blotting. Dataene oppnådd ble kategorisert i henhold til EGFR positive CRC vev, EGFR negative CRC vev og tilstøtende kolon vev som i et flertall var EGFR negative. Mangelen på EGFR ble påvist ved Western blotting. 85% av skivene ble inkludert i den statistiske analyser i henhold til følgende farmakologiske kriterier: a. totalt bindende; b.
