Abstract
Bakgrunn
Signal svinger og aktivator av transkripsjon 3 (STAT3) er en transkripsjonsfaktor som regulerer ulike cellulære prosesser som celle overlevelse, angiogenese og spredning. I denne studien undersøkte vi at betulinsyre (BA), en triterpene fra barken på hvit bjørk, hadde hemmende effekt på hypoksi-mediert aktivering av STAT3 i androgen uavhengig menneskelige prostata kreft PC-3 celler.
metodikk /hovedfunnene
BA hemmet protein uttrykk og transkripsjons aktiviteter hypoksi-induserbar faktor-1α (HIF-1α) under hypoksisk tilstand. Konsekvent, BA blokkert hypoksi-indusert fosforylering, DNA bindingsaktivitet og kjernekraft opphopning av STAT3. I tillegg BA betydelig redusert cellulære og utskilte nivåer av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), et kritisk angiogen faktor og et målgen av STAT3 induseres under hypoksi. Videre BA hindret
in vitro
kapillarrør dannelse i human navlestrengvene endotelialceller (HUVECs) opprettholdes i kondisjonert medium av hypoksiske PC-3-celler, noe som tyder på anti-angiogene aktivitet av BA i henhold hypoksisk tilstand. Av notatet, kromatin immunpresipitering (chip) analyse viste at BA hemmet binding av HIF-1α og STAT3 til VEGF promoter. Videre tie STAT3 hjelp siRNA transfeksjon effektivt forbedret redusert VEGF produksjon indusert ved BA behandling under hypoksi.
Konklusjon /Betydning
Til sammen våre resultater tyder på at BA har anti-angiogen aktivitet ved å forstyrre bindingen av HIF-1α og STAT3 til VEGF-promoteren i hypoksiske PC-3-celler
relasjon:. Shin J, Lee HJ, Jung DB, Jung JH, Lee HJ, Lee EO, et al. (2011) Undertrykkelse av STAT3 og HIF-1 Alpha som megler antiangiogene aktivitet av Betulinic Acid i hypoksisk PC-3 prostata kreft celler. PLoS ONE seks (6): e21492. doi: 10,1371 /journal.pone.0021492
Redaktør: Karen L. Mossman, McMaster University, Canada
mottatt: 16 mars 2011; Godkjent: 29 mai 2011; Publisert: 24 juni 2011
Copyright: © 2011 Shin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Korea Science and Engineering Foundation (KOSEF) Grant finansiert av den koreanske regjeringen (MEST) (nr 2011-0063466). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Signal transduser og aktivator av transkripsjon 3 (STAT3) er en av STAT proteinfamilie og konstitutivt aktiv i et bredt spekter av humane kreftceller [1]. Aktiverte STAT3 proteiner av cytokiner og vekstfaktorer danne homo- eller heterodimerer, og deretter translocate fra cytoplasma til kjernen, hvor de er binding til promotoren av forskjellige genprodukter er involvert i anti-apoptose (bcl-2, bcl-x
L og survivin), proliferasjon (cyklin D1), og angiogenese (vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF)) [2]. Interessant, nylige studier har rapportert at STAT3 aktiveres som reaksjon på hypoksi, en felles trekk ved ulike faste tumorer [3], [4]. Aktivert STAT3 medierer oppregulering av hypoksi induserbar faktor alfa (HIF-1α), til en større regulator tilpasse henhold hypoksiske betingelser ved å øke dens stabilitet og transkripsjonelle aktivitet [5]. Dermed nylig STAT3 og HIF-1α er attraktive mål molekyler av naturlige forbindelser og urteekstrakter i kreftforskning.
Betulinic syre (BA), opprinnelig rapportert som et menneske melanom-spesifikk hemmer, er en triterpenoid hovedsak hentet fra barken av hvite bjørk (
Betula pubescens
) [6]. Nylige bevis antyder at anti-kreft-effekter av BA [7], [8], anti-inflammatorisk [9] og anti-viral [10] aktiviteter via forskjellige signalveier så som epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR) [11], pinnsvin [12], signal transduser og aktivator av transkripsjon 3 (STAT3) [13] og nukleær faktor kappa B-(NF-kB) [14]. Likevel, det er ingen bevis for at BA formidler anti-kreft aktivitet gjennom å hemme STAT3 signalering i solide tumorer.
Derfor, i denne studien undersøkte vi rollene til STAT3 og HIF-1 α i BA indusert anti- angiogen aktivitet i hypoksiske PC-3 prostatakreftceller ved MTT-analyse, Western blotting, immunocytokjemi, ELISA og EMSA.
Resultater
cytotoksiske effekten av betulinsyre (BA) mot PC-3 celler
cytotoksisk effekt av BA (fig. 1) ble bedømt ved MTT-assay. PC-3-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av BA (0, 12,5, 25, 50 eller 100 uM) i 24 timer. Cellelevedyktigheten ble redusert til 78,49 ± 5,67 og 62,64 ± 1,26% ved konsentrasjoner på 12,5 og 25 uM, henholdsvis, og vedvarende to~60% til over 25 um (fig. 2A).
, Molekylvekt = 456.
(A) PC-3-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av BA (0, 12,5, 25, 50 eller 100 uM) i 24 timer. Cellenes levedyktighet ble analysert ved MTT-analyse. (B) Celler ble utsatt for normoxia eller hypoksi for 0,5, 2, 4, 6, 8, 12 eller 24 timer. Cellelysater ble fremstilt og underkastet Western blotting for å bestemme ekspresjon av HIF-1α. (C) Cellene ble behandlet med eller uten BA (5 eller 10 uM) under normoksiske og hypoksiske tilstand i 4 timer. Cellelysater ble fremstilt og underkastet Western blotting for å bestemme ekspresjon av HIF-1α. (D) Kjerne ekstrakt fremstilt fra celler behandlet med BA (0, 10, 20 eller 40 uM) under normoxia eller hypoksi i 4 timer. HIF-1α transkripsjonsaktiviteten ble målt ved hjelp av Transam HIF-1 transkripsjonsfaktor assay kit. Data representerer middel ± S.D.
##, p 0,01
vs
normoxia kontroll, og
*, p 0,05 og
** 0,01
vs
hypoksi kontroll.
Effekt av betulinsyre (BA) på hypoksi-indusert HIF-1α aktivering i PC-3 celler
Hypoksi er et kjennetegn av solide svulster [15] og HIF-1α er en transkripsjonsfaktor som svar på hypoksi [16]. For å undersøke om BA kan påvirke HIF-1α indusert av hypoksi, vi først bestemmes det beste tidspunktet for hypoksi-indusert HIF-1α uttrykk i PC-3 celler. Celler ble utsatt for normoxia eller hypoksi for 0,5, 2, 4, 6, 8, 12 eller 24 timer. HIF-1α ekspresjon ble dramatisk induseres under hypoksiske betingelse for 4 h (fig. 2B). Deretter ble cellene behandlet med eller uten BA under hypoxi i 4 timer. BA redusert hypoksi-indusert HIF-1α ekspresjon i en doseavhengig måte sammenlignet med hypoksi kontroll (Fig. 2C). I tillegg, hypoksi aktivert vesentlig HIF-1α transkripsjon mens BA behandling inhiberte hypoksi-formidlet transkripsjonen aktivering av HIF-1α på en doseavhengig måte (fig. 2D). Disse resultater antyder at BA har evnen til å hemme ekspresjon, så vel som transkripsjonen av HIF-1α i hypoksiske PC-3-celler.
Effekt av betulinsyre (BA) på hypoksi-indusert aktivering STAT3 i PC-3 celler
Nyere studier har rapportert at en transkripsjonsfaktor STAT3 er involvert i transcriptional regulering av HIF-1α [17]. I vår studie, hypoksi forbedret fosfor-STAT3 nivå mens normoxia ikke påvirke det. BA behandling inhiberte hypoksi-formidlet STAT3 fosforylering på en doseavhengig måte (fig. 3A). Også EMSA avslørte at BA hindret STAT3 /DNA-bindingsaktivitet i henhold til hypoksi på en doseavhengig måte (fig. 3B). Videre imunocytochemical (ICC) farging med anti-HIF-1α-antistoff viste en signifikant atom ekspresjon av HIF-1α etter hypoksisk tilstand. I motsetning til dette, BA behandling dempes HIF-1α ekspresjon i cellekjernen i hypoksiske PC-3-celler (fig. 3C), noe som tyder på dets hemmende effekt på den nukleære translokasjonen av HIF-1α.
PC-3-celler ble behandlet med eller uten BA (5 eller 10 uM) under normoksiske og hypoksiske tilstand i 4 timer. (A) Cellelysater var forberedt og utsatt for Western blotting for fosfor-STAT3 og STAT3. (B) Kjerneekstrakter ble fremstilt og påført på EMSA for å analysere STAT3-DNA-bindingsaktivitet. (C) Cellene ble behandlet med eller uten BA (10 pM) under hypoksi. Immunocytochemistry ble utført for STAT3. DAB (brunt) og hematoksylin-eosin ble anvendt som et substrat og en kontra, respektivt.
Effekter av betulinsyre (BA) på hypoksi-indusert angiogenese
Hypoksi er en av angiogenese indusere gjennom HIF-1α aktivering [18]. Således ble den hemmende effekten av BA evaluert på hypoksi-formidlet angiogenese. VEGF, en kritisk faktor angiogenese [19], ble evaluert ved de utskilte cellulære og proteinnivåer ved hjelp av ELISA og Western blotting, respektivt. BA betydelig redusert VEGF produksjon på en doseavhengig måte ved hjelp av ELISA (Fig. 4A). Konsekvent, BA dempes VEGF protein ekspresjon i en doseavhengig måte ved hjelp av Western blotting (fig. 4B).
(A og B) PC-3-celler ble behandlet med 0, 5 eller 10 uM BA i 24 timer . (A) VEGF-nivåene i kultursupernatantene ble målt ved hjelp av en Quantikine VEGF ELISA kit. (B) Cellelysater ble fremstilt og underkastet Western blotting for å bestemme VEGF-ekspresjon. Grafer representerer relative bandet intensiteter av VEGF /β-aktin. Data representerer middel ± S.D.
##, p 0,01
vs
normoxia kontroll, og
*, p 0,05 og
** 0,01
vs
hypoksi kontroll. (C) HUVECs ble behandlet med VEGF (20 ng /ml) som positiv kontroll eller kultur supernatanten fra PC-3-celler behandlet med eller uten BA (10 pM) under normoxia eller hypoksi. Rør-analysen ble utført ved anvendelse av vekstfaktor redusert Matrigel. Celler ble fiksert med Diff-Quick-løsning, fotografert tilfeldig under en Axiovert S 100 lysmikroskop ved 100 x forstørrelse og tellet.
I tillegg HUVEC rør formasjon assay, som er kjent som et typisk angiogenese
in vitro
modell, ble utført for å bekrefte anti-angiogene virkning av BA den hypoksi-formidlet angiogenese. VEGF ble anvendt som en positiv kontroll av angiogenese induksjon. HUVECs blandet med supernatanter fra PC-3-celler ble dyrket i fravær eller nærvær av BA i henhold til hypoksi. Som vist på fig. 4C, hypoksi-indusert tube formasjonen ble forhindret av BA behandling i PC-3 celler mens klar tube formasjonen ble utstilt i ubehandlet kontroll etter hypoksi, noe som tyder på at BA hemmer hypoksi-mediert angiogenese.
Effekter av betulinsyre (BA ) på bindingen av STAT3 og HIF1 α til VEGF-promoteren i hypoksiske PC-3-celler
Nyere studier viser at STAT3 aktivering er direkte kobling til den transkripsjonelle regulering av VEGF ved binding til VEGF-promoteren [20], [ ,,,0],21]. I lys av denne hendelsen, gjennomførte vi kromatin immunoprecipitation (chip) analyse. Som vist på fig. 5A, bindingsaktiviteten av STAT3 og HIF-1α til VEGF-promoteren ble påvist etter hypoksi (kolonnene 5-8) sammenlignet med normoxia (sporene 1-4). Spesielt, BA behandling trykt bindingen av STAT3 og HIF-1α til VEGF promoter i hypoksisk tilstand (sporene 9-12).
(A) PC-3 celler ble behandlet med eller uten BA (10 mm) under normoxia eller hypoksi i 4 timer. Den immunopresipitert med kanin DNA normal IgG, HIF-1α eller STAT3 antistoff ble amplifisert ved hjelp av PCR-analyse for VEGF-promoteren. (B) Cellene ble transient transfektert med siRNA for krafse eller STAT3 i 24 timer og behandlet med eller uten BA (10 uM) i 18 timer under hypoksi. VEGF-nivåene i kultursupernatantene ble målt ved hjelp av en Quantikine VEGF ELISA kit. Data representerer middel ± S.D.
#, p 0,05
vs
kontroll, og
*, p 0,05
vs
kontroll siRNA. Cellelysater ble utsatt for Western blotting for fosfor-STAT3, STAT3 og HIF-1α.
For å bekrefte den kritiske rollen STAT3 i antiangiogene regulering av BA i hypoksiske PC-3 celler, STAT3 siRNA transfeksjon ble utført i PC-3 celler. Behandling med enten BA eller STAT3 siRNA redusert produksjonen av VEGF med 39,6% og 45,9%, respektivt, sammenlignet med ubehandlet kontroll. Videre BA behandling signifikant redusert VEGF-produksjon med 63,25% i STAT3 siRNA-transfekterte PC-3-celler (fig. 5B). Western blotting viste at siRNA for STAT3, men ikke kontroll, effektivt blokkert STAT3 (Fig. 5B).
Diskusjoner
Prostatakreft klassifisert som et adenokarsinom er den nest vanligste ondartede svulster i amerikanske menn , med anslag over 192,280 nye tilfeller og ca 27,360 dødsfall i 2009 [22], [23]. Betulinic syre (BA), en plante-avledet penta lupane-type triterpenoid kan være hentet fra ulike planter som
Sarracenia flava product: [24],
Diospyros
spp.,
Inga punctata product: [25],
Ziziphus
spp., og
Vauquelinia corymbosa product: [26]. Flere grupper rapportert anti-kreft-aktivitet av BA i en rekke kreftformer, inkludert lungekreft, kolorektal, bryst, prostata og livmorhalskreft [27], men ikke normale celler [28]. Også BA fullstendig hemmet tumorvekst uten toksisitet hos atymiske mus som bærer humane melanomer [6]. I tillegg ble anti-kreft-aktivitet av BA utøves ved å indusere apoptose i kreftcellene. For eksempel, BA-indusert apoptose var uavhengig av p53 i neurorectodermal tumor [29] og melanomceller [30]. I neuroblastom celler, BA indusert apoptose gjennom tap av mitokondrie membran potensial, reaktive oksygenforbindelser (ROS) produksjon og caspaseaktivering [31].
Interessant, Karna og kolleger nylig rapportert at BA hemmet uttrykk for HIF- 1α og vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) i humane endometriale cancerceller [32]. Imidlertid er de regulatoriske mekanismer der BA hemmer angiogenese ikke fullt ut forstått. I denne studien fant vi at BA trykt hypoksi-mediert akkumulering av proteiner, transcriptional aktivering og kjernefysiske lokalisering av HIF-1α i PC-3 celler. I samsvar med resultatene av Karna papir, våre data viste også at BA inhiberte signifikant VEGF-sekresjon og protein ekspresjon i hypoksiske PC-3-celler. I tillegg
in vitro
tube-analysen ytterligere bekreftet anti-angiogenenic effekten av BA i hypoksiske PC-3 celler.
Nylig Niu og kolleger foreslo at konstitutivt aktivert STAT3 oppregulert VEGF og Induced tumorangiogenese [20]. Også, Wei og medarbeidere rapporterte at STAT3 aktivering regulerer ekspresjonen av VEGF og human bukspyttkjertelkreft angiogenese Videre er det flere papirer beskrevet rolle STAT3 som en potensiell modulator av HIF-1α-indusert VEGF-signalering i kreftceller [4], [33] . I denne forbindelse, ble effekten av BA på STAT3 og HIF-1α aktivering undersøkt i hypoksiske PC-3-celler i vårt studium. I samsvar med bevisene av Pandey og kolleger at BA undertrykte STAT3 aktivering i myelomatose celler [13], BA forhindret hypoksi-indusert tyrosinfosforylering, DNA-bindende aktivitet og kjernekraft translocalization av STAT3, tyder den hemmende effekten av BA på STAT3 aktivering.
VEGF promoter inneholder ulike transkripsjonsfaktor bindingssteder inkludert STAT3 [20] samt HIF-1 [34]. Fysisk interaksjon av STAT3 med HIF-1 styrer VEGF transkripsjonen aktivering ved deres binding til VEGF-promoteren [4]. I vår studie, hypoksi fremmet binding av STAT3 og HIF-1α til VEGF promoter i PC-3 celler. I motsetning til dette, BA bart inhiberes bindingen av STAT3 og HIF-1α til VEGF-promoteren område under hypoksiske tilstand. I tillegg tie STAT3 bruker sin spesifikke siRNA betydelig forbedret BA-mediert hemming av VEGF produksjon, noe som tyder på involvering av STAT3 i antiangiogene regulering av BA i hypoksiske PC-3 celler. I likhet med vår studie, Gariboldi og kolleger rapporterte at NVP-AEW541, en IGFR1 inhibitor, forstyrret IGF /STAT3 /HIF1 sti i menneskelige glioblastom celler [35]. Leeman-Neill og kolleger rapporterte også at Guggulsterone hemmet STAT3 og HIF-1α og foreslo en biologisk begrunnelse for videre klinisk undersøkelse BA for menneskelig hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) terapi [36].
Kollektivt, vår data viser at BA undertrykket ekspresjon og transaktivering av hypoksi-indusert HIF-1α, STAT3, VEGF samt kapillarrør dannelse i PC-3-celler. Det er bemerkelsesverdig at anti-cancer aktiviteten til BA utøves ved å hemme angiogenese via hemming av binding av STAT3 og HIF-1α til VEGF-promoteren i PC-3-celler. Dermed våre funn tyder på at BA kan være en potent anti-angiogene middel ved å målrette STAT3 /HIF-1α /VEGF system for prostatakreft behandling.
Materialer og Metoder
Forbindelser
Betulinic syre (BA) (figur 1) ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) og ble oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO) som en 10 mM stamløsning for eksperimentell bruk.
Cellekultur kultur~~POS=HEADCOMP
human prostatacancercellelinje PC-3 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) og holdt i RPMI 1640 (Welgene, Daegu, Korea) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% antibiotika-antimyotic løsning. Humane navlestrengvene endotelialceller (HUVECs) ble isolert fra frisk human navlestrengvene og opprettholdt i EBM-2 (Lonza, Valais, Sveits) supplert med 2% FBS, 0,04% hydrokortison, 0,1% VEGF, 0,1% IGF-1, 0,4 % hFGF-B, 0,1% hEGF, 0,1% askorbinsyre, og 1% heparin.
Hypoksi induksjon
Cellene ble inkubert i anaerob inkubator ved 94% N
2, 5% CO
2 og 1% O
2 (Thermo vitenskapelig, Rockford, IL) som tidligere beskrevet [37].
Cvtotoksisitetsmålinq
for å vurdere cytotoksisitet av BA, 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse ble utført som tidligere beskrevet [38]. PC-3-celler ble sådd ut på 96-brønners mikrotiterplater ved en tetthet på 1 x 10
4 celler per brønn og eksponert for forskjellige konsentrasjoner av BA (0, 12,5, 25, 50 eller 100 uM) i 24 timer. MTT-løsning (1 mg /ml) (Sigma-Aldrich) ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 2 timer ved 37 ° C. Ekstraksjon buffer (20% SDS og 50% dimetylformamid) ble deretter tilsatt og optisk tetthet (OD) ble målt ved anvendelse av mikroplateleser (Tecan Austria GmbH, Grödig, Østerrike) ved 570 nm. Cellelevedyktigheten ble beregnet som en prosent av levedyktige celler i BA-behandlede gruppen sammenlignet med ubehandlet kontroll etter følgende ligning
celle-levedyktighet (%) = [OD (BA) – OD (blank)]. /[OD (kontroll ) – OD (blank)] x 100
Western blot-analyse
Hel-celle-ekstrakter ble fremstilt ved anvendelse av lyseringsbuffer [50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1% triton X- -100, 0,01% SDS, 1 mM EDTA (pH 8,0) og proteasehemmer cocktail tabletter (Roche Applied Science, Inndianapolis, IN)]. Atom og cytoplasmatiske ekstrakter ble oppnådd ved fraksjonert ved hjelp av NE-PER kjernefysiske og cytoplasmatiske utvinning reagenser (Thermo vitenskapelig, Rockford, IL). Proteinprøver ble separert på 10% SDS-PAGE-gel og overført til en nitrocellulosemembran. Membranen ble blokkert i 5% fettfri skummet melk, og analysert med primære antistoffer for HIF-1α (1:500, Gene Tex, Irvine, CA), STAT3 (1:1000, Cell Signaling, Danvers, MA), fosfor-STAT3 (1:500, Cell Signaling, Danvers, MA), VEGF (1:500, Santa Cruz Bioteknologi, Santa Cruz, California) og β-aktin (Sigma, St. Louis, MO) over natten ved 4 ° C. Membranene ble utsatt for HRP-konjugerte sekundære antistoffer i 2 timer ved romtemperatur og protein-ekspresjon ble påvist ved hjelp av forsterket kjemiluminescens (ECL) Western blotting deteksjonsreagensen (GE Health Care Bio-Sciences, Piscataway, NJ).
HIF-1α transkripsjon aktivitetsanalyse
HIF-1α transkripsjonen aktivitet ble analysert ved hjelp av HIF-1α transkripsjonsfaktor analyse ved bruk av Transam HIF-1 transkripsjonsfaktor analysesett (Active Motiv, Carlsbad, CA) ifølge produsentens instruksjoner. Kort sagt ble nukleære ekstrakter tilsatt til 96-brønns mikroplate belagt med oligonukleotider som inneholder hypoksi-responselement (HRE) (5′-TACGTGCT-3 «) fra den erytropoietin (EPO) -genet. HIF-dimerer som er tilstede i kjerneekstrakter bindes med høy spesifisitet overfor denne responselement og blir deretter detektert med et antistoff rettet mot HIF-1α. Tilsetning av et sekundært antistoff konjugert til pepperrotperoksidase (HRP) gir en følsom kolorimetrisk avlesning som er lett kvantifiseres ved hjelp av spektrofotometri. Verdier er uttrykt som optisk tetthet (OD) ved 450 nm med en referansebølgelengde på 655 nm.
Immunocytochemistry
PC-3-celler ble sådd på fire-kammers objektglass med en tetthet på 3 x 10
4 celler pr kammer og behandlet enten med eller uten BA (10 pM) under hypoksi som tidligere beskrevet [37]. Cellene ble fiksert i 4% formaldehyd-oppløsning i 10 minutter ved romtemperatur og blokkert i blokkeringsbuffer (10% BSA /Triton X-100 i PBS) inneholdende 6% hesteserum i 1 time ved romtemperatur. Glassene ble inkubert med anti-STAT3 (1: 100) antistoff over natten ved 4 ° C og deretter probet med anti-mus eller kanin biotinylert antistoff (Vector Labs, Burlingame, CA) i 1,5 timer ved romtemperatur. Uttrykket ble påvist ved hjelp av Vector ABC-kompleks /HRP-kit (Vector Labs, Burlingame, CA) og farge utviklet med 3,3′-diaminobenzidin tetrahydroklorid i mørke. Prøvene ble deretter kontra med hematoksylin-eosin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og analysert under et mikroskop (Leica Microsystems Res., Wetzlar, Tyskland).
Elektro mobilitet shift analyse (EMSA)
STAT3-DNA-binding ble analysert ved elektromobilitet shift analyse (EMSA) med Gelshift Chemiluminescent EMSA kit (Active Motif, Carlsbad, California) som tidligere beskrevet [39]. Kort sagt ble nukleære ekstrakter fremstilt fra anetol-behandlede celler og inkubert med STAT3 konsensus oligonukleotider (5′-CTT CAT TTC CCG TAA ATC CCT AAA GCT-3 «) (Santa Cruz Bioteknologi, Santa Cruz, CA). DNA-proteinkompleks dannet ble separert fra frie oligonukleotider på 5% innfødte polyakrylamidgeler. Kjemiluminescens deteksjon ble utført ved hjelp av ECL-reagenser i henhold til leverandørens protokoller (GE Health Care Bio-Sciences, Piscataway, New Jersey).
In vitro tube-analysen
In vitro tube-analysen ble utført som tidligere beskrevet [40]. Matrigel (BD) ble tilsatt på 24-brønners plater og polymerisert ved inkubering i 1 time ved 37 ° C. HUVECs ble sådd ut på Matrigel belagte plater og inkubert i EBM-2 supplert med VEGF (20 ng /ml) eller supernatanten fra PC-3-celler behandlet med BA (0 eller 10 uM) i henhold normoxia eller hypoksi i 24 timer. Etter 8 timers inkubasjon ble cellene fiksert med 4% formaldehyd og tilfeldig utvalgte felt ble fotografert under en Axiovert S 100 lysmikroskop (Carl Zeiss, Weimar, Tyskland) ved 100 × forstørrelse.
Enzyme-linked immunosorbent assay ( ELISA) for VEGF
PC-3-celler ble sådd ut på 60-mm skål i en tetthet på 1 x 10
6 celler /plate og inkubert i fravær eller nærvær av BA (10 uM) under normoxia eller hypoksi i 24 timer. VEGF nivå i supernatanten ble målt ved hjelp av menneskelig VEGF ELISA kit i henhold til produsentens protokoll (Biosource International Inc., Camarillo, CA).
Chromatin immunoprecipitation (chip) assay
PC-3 cellene ble sådd ut på 100 mm skåler i en tetthet på 1,5 x 10
6 celler /skål og behandlet med BA i 4 timer under normoksiske og hypoksiske tilstand og deretter 1% formaldehyd og 0,125 M glysin. Løselig Kromatin ble isolert ved hjelp av EZ-Zyme kromatin prep kit (Millipore, Billerica, MA) og immunopresipitert med antistoffer av normal kanin IgG (EMD Biosciences, Gibbs, New Jersey), HIF-1α eller STAT3. Histon /DNA-tverrbindinger ble reversert ved tilsetning av 5 M NaCl ved 65 ° C i 4 timer, etterfulgt av fenol /kloroform-ekstraksjon og etanolutfelling. PCR reaksjonen ble utført for å forsterke VEGF arrangøren å bruke chip primere (følelse 5′-AGACTCCACAGTGCATACGTG-3 «og antisense 5′-AGTGTGTCCCTCTGACAATG-3».
siRNA trasnfection
PC-3 celler ble midlertidig transfektert med krafse eller STAT3 siRNA (Santacruz bioteknologi, Santacruz, CA) ved 50 nM ved hjelp av INTERFERin siRNA transfeksjon reagens (Polyplus-transfeksjon Inc., New York, New York). etter inkubering i 24 timer ble cellene behandlet med BA og opprettholdt i 18 timer under hypoxi.
Statistisk analyse
Alle data ble uttrykt som middel ± SD Statistisk signifikans ble analysert ved t-test.
