Abstract
Mangel på immunogenisitet av kreftceller har vært ansett som en viktig grunn for at de ikke i induksjon av en svulst spesifikk T-celle respons. I denne artikkelen presenterer vi bevis for at decitabine (DAC), en DNA-metylering inhibitor som i dag benyttes til behandling av myelodysplastisk syndrom (MDS), akutt myelogen leukemi (AML) og andre ondartede svulster, er i stand til å utløse en anti-tumor cytotoksisk T-lymfocytt (CTL) respons i mus EL4 tumormodell. C57BL /6-mus med etablerte EL4-tumorer ble behandlet med DAC (1,0 mg /kg kroppsvekt) en gang daglig i 5 dager. Vi fant at DAC behandlingen resulterte i infiltrasjon av IFN-γ produserende T-lymfocytter inn i tumorer og tumor forårsaket avvisning. Uttømming av CD8
+, men ikke CD4
+ T-celler gjenopptatt tumorvekst. DAC-indusert CTL-respons syntes å være fremkalt ved induksjon av CD80 ekspresjon på tumorceller. Epigenetisk bevis tyder på at DAC induserer CD80 uttrykk i EL4 celler via demetylering av CpG dinukleotidpolyfosfater steder i formidler av CD80-genet. I tillegg viste vi også at en forbigående, lavdose DAC behandling kan indusere CD80 gen-ekspresjon i en rekke humane kreftceller. Denne undersøkelsen gir det første bevis på at epigenetisk modulasjon kan indusere ekspresjon av en stor T-celle kostimulerende molekyl på kreftceller, som kan overvinnes av immuntoleranse, og indusere en effektiv antitumor CTL-respons. Resultatene har viktige implikasjoner ved utforming DAC-cancer immunoterapi
relasjon:. Wang L-X, Mei Z-Y, Zhou J-H, Yao Y-S, Li Y-H, Xu Y-H, et al. (2013) Low Dose Decitabine Behandling induserer CD80 uttrykk i kreftceller og stimulerer tumorspesifikke cytotoksiske T-lymfocytter Responses. PLoS ONE 8 (5): e62924. doi: 10,1371 /journal.pone.0062924
Redaktør: Fabrizio Mattei, Istituto Superiore di Sanita, Italia
mottatt: 5. desember, 2012; Godkjent: 26 mars 2013; Publisert: 09.05.2013
Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Basic Research Program of China (2005CB522400), National Natural Science Foundation of China (90919044, 30971297, 81000221, og 81170518), høy og ny teknologi Program for PLA (2010gxjs091), Capital Medical Development Scientific Research Fund (No. 2007-2040). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
En hovedutfordring i kreft immunterapi er immune evasion av kreftceller [1]. I løpet av tumorutvikling og progresjon, svulster bygge opp et immunundertrykkende nettverk, inkludert tumorassosierte myeloide celler og forskjellige regulatoriske T-celler [2], [3]. Kreftceller selv er genetisk ustabile; kan de nedregulerer hovedhistokompatibilitetskompleks (MHC) klasse I-molekyler [4], [5] og mister ekspresjon av tumorantigener [6], [7], [8]. I tillegg trenger kreftceller ikke normalt uttrykker nøkkel ko-stimulatoriske molekyler slik som CD80, men i stedet for å uttrykke noen co-inhiberende molekyler som gjengir tumor-antigen spesifikk T-celletoleranse [9]. Alle disse faktorer hindre induksjon av en effektiv T-celle respons på tumorer. Således overvinne immunsvik er av stor betydning i cancer immunoterapi.
epigenetisk bevis tyder på at i kreftceller, er noen av de viktigste immunstimulerende molekyler som reguleres ved hjelp av DNA-metylering i sin promoter-regionen. Noen kjente tumorantigener så som kreft testis antigener (oppfordringer) er nesten utelukkende reguleres ved hjelp av DNA-metylering [10], [11], [12], [13], [14], [15]. MHC klasse I og dens antigenpresentasjon maskiner har også vist seg å være regulert av DNA-metylering [16], [17], [18], [19]. I tillegg til leggene og MHC-molekyler er det også bevis for at adhesjonsmolekyler [16], [20], slik som ICAM-1 og LFA-3, og de ko-stimulerende molekyler [19], [20], slik som CD40 og CD86 kan reguleres ved hjelp av DNA-metylering i kreftceller. Således demethylating midler som kan oppregulere ekspresjon av tumorantigener, MHC klasse I, og adhesjon /kostimulerende molekyler i kreftcellene skulle være nyttige i å forbedre tumor immunogenisitet og deres følsomhet overfor immunødeleggelse. Det er faktisk en mengde bevis som antyder demetylering behandling kan dramatisk øke kreftcelle mottakeligheten for ødeleggelse av T-celler [11], [15], [17], [21]. Imidlertid er det ingen direkte
in vivo
bevis for at demetylering behandling av kreft fører til et spesifikt anti-tumor T-cellerespons.
Decitabine (DAC), en DNA-demethylating middel [22], har nylig dukket opp som et potent terapeutisk for behandling av pre-leukemi hematologisk sykdom-MDS [23], [24], etablert leukemi [25], [26], [27] og avansert lungekreft [28]. Lav dose DAC kan føre til vedvarende anti-tumor effekt selv etter avsluttet behandling [24], [29], [30], noe som tyder på at en aktiv immunrespons kan induseres i de behandlede pasientene. For å avgjøre om DAC behandling kan indusere anti-tumor immunresponser
in vivo
studerte vi effekten av lavdose DAC behandling i mus med etablerte T-celle lymfom EL4 svulster. Vi fant at forbigående og en lav dose DAC behandlingen resulterte i induksjon av en antitumor cytotoksisk T-lymfocytt (CTL) som reaksjon mediert tumorregresjon. DAC-indusert CTL respons synes å være utløst av induksjon av CD80 uttrykk på EL4 celler. I tillegg har vi også funnet at en forbigående, lavdose DAC behandling kan indusere CD80 gen-ekspresjon i en rekke humane kreftceller. Denne undersøkelsen gir det første bevis på at epigenetisk modulasjon kan indusere ekspresjon av en stor T-celle kostimulerende molekyl på kreftceller, som kan overvinnes av immuntoleranse, og indusere en effektiv antitumor CTL-respons.
Methods
mus
C57BL /6 og CBF1 mus ble kjøpt fra Beijing Vital-River Lab Animal Technology Co Ltd C57BL /6 congenic strekk mus B6.SJL-Ptprc
en Pepc
b /Boy-M (CD45.1
+) ble gitt av Dr. Chunfeng Qu (State Key Laboratory of Molecular Oncology, Cancer Institute /Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing, Kina). Alle mus ble opprettholdt på kinesisk PLA General Hospital (CPGH) i patogenfrie forhold. Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med nasjonale og institusjonelle retningslinjer for dyr omsorg og ble godkjent av dyr bruk og omsorg komiteen CPGH.
Cell Kultur og EL4 kloning Etablering
Alle cellelinjer ble opprinnelig erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC). EL4-celler (mus T-celle lymfom /leukemi cellelinje) ble dyrket og opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) supplert med 10% varme-inaktivert hesteserum (Hyclone), 100 ug /ml penicillin /streptomycin og L-glutamin. Cellene ble inkubert ved 37 ° C i 5% CO
2. EL4 subkloner ble etablert ved hjelp av begrensende fortynning i 96-brønn rund-bunnet vevskulturplater basert på CD80 ekspresjon. To EL4-subkloner, dvs. EL4 C45 med høy ekspresjon av CD80, og EL4 C3 uten ekspresjon av CD80, ble anvendt for denne studien. Den humane leukemi-cellelinjene K562 (cellelinje avledet fra en pasient med kronisk myelogen leukemi hos blastkrise), U937 (akutt myelogen leukemi, M5), THP-1 (akutt myelogen leukemi, M5), NB4 (akutt myelogen leukemi, M3) , Kasumi-en (akutt myelogen leukemi, M2), Molt-4 (T-celle akutt lymfatisk leukemi), Hut-78 (T-celle lymfom) og Raji (Burkitt lymfom) ble dyrket og vedlikeholdes i RPMI-1640 (Hyclone) medium supplert med 10% føtalt bovint serum.
in vitro og in vivo behandling med Decitabine
Decitabine (DAC, Xian-Janssen Pharmaceuticals Ltd, Kina) ble oppløst i fosfat-bufret saltvann (PBS) (pH 7,4) for å oppnå 100 uM bestander og lagret ved -20 ° C. For
in vitro
studier ble DAC tilsatt til cellekulturmediet til en endelig konsentrasjon på 0,25 uM i 72 timer. Den samme konsentrasjon av Cytidine (Sigma) i PBS eller PBS bare ble tilsatt til celler som kontroll behandling. 24 timer etter behandling cellene ble høstet for videre studier. For
in vivo
studier ved bruk av DAC, ble mus med etablerte EL4-tumorer injisert med DAC (1,0 mg /kg kroppsvekt i 200 ul PBS) eller PBS i.p. en gang daglig i 5 påfølgende dager. Mus ble ofret 7-10 dager etter avsluttet behandling og tumorer skåret ble behandlet for svulst infiltrerende lymfocytter (TIL) analyse.
Reverse Transcription-PCR (RT-PCR)
Total RNA ble hentet fra DAC-behandlet eller kjøretøy behandlede EL4 celler og andre menneskelige leukemi og lymfom celler ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. RT ble utført ved bruk av revers transkripsjon System (Promega) på 1 pg av total RNA, og PCR-amplifikasjoner ble deretter utført ved anvendelse av primere som vist i tabell 1.Simultaneous forsterkning av glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) genet ved bruk av primere for mus (5 forover «-GATGCCCCCATGTTTGT-3′, revers 5»-CCGTTCAGCTCTGGGATGA -3 «) og hos mennesker (forover 5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′, revers 5»-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3 «) ble anvendt som en intern kontroll for mengden og integritet RNA analysert. Alle PCR produktene ble løst på agarosegeler og visualisert ved hjelp etidiumbromidfarging.
Real Time PCR
Real-time PCR ble utført ved hjelp av en ABI 7900-HT sekvens system (PEApplied Biosystems , Carlsbad, CA, USA) ved hjelp av tidligere fastsatte vilkår [31]. SYBR Premix Ex Taq PCR kit (Takara Bio, Inc.) og de samme primere som brukes for RT-PCR ble benyttet for å forsterke mus P1A, Mela, Magea4, CD80, CD79b, CD74, CD48, CD300a, CD3eap, CD274, CD247, CD180 og GAPDH gener. Hver prøve ble analysert i triplikat, og forsøkene ble gjentatt to ganger. Den relative mengde av mRNA ble beregnet ved å plotte Ct (syklus nummer), og den gjennomsnittlige relative uttrykk for hver gruppe ble bestemt ved den komparative metode (2
– △△ Ct).
tumorigenesis
C57BL6 mus ble injisert med forskjellige doser (oftest ved hjelp av 1 x 10
4 celler /mus, sc) av DAC-behandlede eller kontrollere EL4 celler. Tumorvolumene ble målt som en b
2/2 (a = lengde, b = bredde) hver to til tre dager. Å indusere mus leukemi, ble musene injisert med 2 × 10
4 EL4 celler /mus iv
In vivo CD8 + og CD4 + T Cell Nedbryting
C57BL /6 mus ble injisert med 400 mikrogram av anti-CD4 (klone GK 1,5; BioXcell, NH, USA) eller anti-CD8 (klon 53 til 6,72; BioXcell, NH, USA) monoklonale antistoffer ip 4 dager umiddelbart etter behandling med DAC. Kontrollmusene ble behandlet med renset rotte IgG2b eller IgG2a, henholdsvis (BioXcell, NH, USA). Uttømming effekter ble vurdert ved endepunktet av eksperimentet ved farging av milt og kreftceller for CD4 og CD8 hjelp av anti-CD4 (RM4.4) og anti-CD8 (5H10-1) mAbs (eBioscience), etterfulgt av flowcytometrisk analyse .
antistoffer og flowcytometrisk analyse
Alle antistoffer som brukes ble kjøpt fra BD Biosciences (San Diego, California) eller eBioscience (San Diego, California). For farging av celleoverflatemarkører, celler (kreftceller, splenocytes og enkeltcellesuspensjoner av svulster) ble farget med antistoffer (FITC-, PE, APC- eller Percp- merket CD80, CD4, CD8a, CD3, NK1.1, IFN -γ og isotypekontrollantistoffer) i fargingsbuffer (PBS med 1% FCS) på is i 30 min. Celler ble fiksert i 1% paraformaldehyd i PBS. For påvisning av intracellulære cytokiner ble celler stimulert
in vitro
med PMA (100 ng /ml) og ionomycin (1000 ng /ml) i 5 timer. Golgi
Stop (BD Pharmingen, USA) ble tilsatt (1/1500) i løpet av de siste to timers inkubering. Cellene ble først farget for celleoverflatemarkører slik som CD4 eller CD8, etterfulgt av en standard intracellulær cytokin fargeprosedyre for IFN-γ. Celler ble samlet inn ved hjelp av en FACSCalibur® flowcytometer og data ble analysert ved hjelp av FlowJo programvare (Tre Star, Inc., OR).
Gene Expression microarray analyse
Total RNA ble ekstrahert fra DAC- behandlet og kjøretøy behandlet EL4 celler ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. cDNA merket med et fluorescerende fargestoff (Cy5 og Cy3-dCTP) ble generert ved hjelp CapitalBio cRNA Amplification og merking Kit (CapitalBio, Beijing, Kina). SmartArray (CapitalBio, Beijing, Kina) chips som inneholder ca 25 000 mus gener ble hybridisert med merket cDNA prober på en Genechip system. Arrays ble skannet med en confocal LuxScan ™ scanner og bildene som ble oppnådd var deretter analysert ved hjelp LuxScan ™ 3.0-programvaren (Både fra CapitalBio, Beijing, Kina). Betydningen Analyse av mikromatriser (SAM) ble utført for å bestemme differensielt uttrykte gener
Bisulfite Sekvense
metylering status av CPG dinukleotider innen to regioner (oligo. 1: nukleotid -792 til -335, oligo2: nukleotid -151 til 258), i forhold til den 5 «ende av CD80-genet, ble analysert. Genomisk DNA ble fremstilt fra EL4 subkloner EL4 C3 (CD80
-) og EL4 C45 (CD80
+), kjøretøy eller DAC-behandlede EL4-celler ved hjelp av veiviseren genomisk DNA Purification Kit (Promega Inc, USA). For subkloning og sekvensering av de enkelte alleler, ble bisulfitt-behandlet genomisk DNA amplifisert ved hjelp av Epitect bisulfit kit (Qiagen, Tyskland) ved hjelp av følgende primerpar: fragment 1 (forover 5′-GGGTATTTTTTTAAAAGAAGAGA-3 «, revers 5»-AATCCTACAAAAACATCAATCAAC-3- «), fragment 2 (forover 5′- GGTTGGGTGGGAATTATTTTATT-3′, revers 5»-ACTTAAACACCTCCTAAACTCACA-3 «)
PCR-produktene ble gelrenset og klonet inn i pGEM-T vektor (Promega Inc, USA. ). PCR-fragmentene av individuelle kloner innsatte ble sekvensert ved bruk av en ABI PRISMDNA sequencer (Applied Biosystems, USA).
Blandet lymfocyttreaksjon og CD80 blokade
T-celler høstet fra milt og lymfeknuter EL4- immuniserte BALB /c-mus ble anvendt som responderceller. DAC eller kjøretøy behandlet EL4 celler bestrålt med røntgen (14 Gy) ble brukt som stimulator celler. Responderceller og stimulatorceller ble inkubert i 96-brønners plater i et forhold på 08:01, 04:01, 02:01 og 01:01, og dyrket ved 37 ° C med 5% CO
2 i 6 dager. T-celleproliferasjon ble undersøkt med Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumomoto, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet, etter inkubasjon i 6 dager ved 37 ° C, 10 pl vannløselige tetrazoliumsalt (WST) -8 ble tilsatt til hver brønn, og cellene ble inkubert i ytterligere 4 til 6 timer ved 37 ° C. Absorbansen til prøven ved 450 nm ble målt. For CD80 blokade, anti-CD80 (16-10A1, eBioscience, San Diego, CA) eller en kontroll isotypematchende IgG, (eBioscience, San Diego, CA) ble tilsatt til ko-kulturbrønner ved en sluttkonsentrasjon på 5 ug /ml .
IL-2 og IFN-γ ELISA
Supernatanter av blandede kulturer ble høstet 72 timer etter ko-kultur og ble analysert for IL-2 og IFN-y ved hjelp av ELISA-sett (eBiosciences, San Diego, CA).
statistikker
Statistiske analyser ble utført ved bruk av GraphPad Prism programvare (GraphPad Software, Inc., USA). Student t test ble brukt for å sammenligne tumor volum forskjeller mellom to grupper. For sammenligning av mus overlevelse, ble Kaplan-Meier overlevelsesanalyse og log-rank test benyttet. En
P
verdi mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
DAC Behandling hemmer EL4 Cell tumorigenesis og fører til regresjon av etablerte Svulster i C57BL /6 mus
for å teste om DAC behandling påvirker tumorigenicity av kreftceller i mus, ble EL4 celler behandlet med enten DAC (0,25 mm) eller Cytidine (0,25 mm) eller kjøretøy (PBS) i 72 timer. Vi inkluderte Cytidine som et kontrollmiddel siden DAC er analog Cytidine. I tillegg har en tidligere studie viste at nucleotide (tymidin) behandling er giftig for EL4 celler [32]. Levedyktige EL4 celler fra de ovenfor nevnte behandlinger ble deretter injisert i C57BL /6 mus subkutant (s.c.) i et antall av 1 x 10
4 celler /mus. På dette nummeret, Cytidine og kjøretøy behandlet EL4 celler dannes svulster i alle injiserte mus og vokste gradvis; i motsetning til dette ble det ikke dannet tumorer i mus som mottok DAC-behandlede EL4-celler (figur 1A). EL4-tumorer ble etablert i C57BL /6 mus bare når meget høyt antall DAC-behandlede EL4 celler ble anvendt (8-16 ganger høyere doser) (figur 1B). Intravenøs injeksjon av bærer-behandlede EL4-celler (1 x 10
4 celler /mus) førte til utviklingen av EL4-indusert leukemi hos mus CBF1 og forårsaket døden for de fleste mus; i motsetning til dette ingen mus som mottok dette antall DAC-behandlede EL4-celler døde av leukemi (figur 1C). For å teste hvorvidt
i
vivo
injeksjon av DAC kunne hemme veksten av etablerte tumorer, EL4-celler ble injisert i C57BL /6 mus s.c. Når tumorene vokste til en størrelse på omtrent 5 x 6 mm, ble disse musene behandlet med DAC eller PBS i.p. daglig i 5 påfølgende dager. I motsetning til den progressiv tumorvekst i bærerbehandlede mus, DAC behandling forårsaket kontinuerlig tumorregresjon, selv etter DAC behandling ble stoppet (figur 1D). Således DAC-behandlede EL4-celler viser redusert kapasitet i tumorgenese, og forbigående DAC behandling av mus med etablerte tumorer fører til kontinuerlig tumorregresjon.
(A) EL4-celler ble behandlet med DAC (0,25 uM i kulturmedium) eller Cytidine eller PBS i 72 timer. Cellene ble deretter injisert inn i hver mus s.c. ved en dose på 1 x 10
4 celler /mus. Tumorstørrelse ble målt i to retninger hver to eller tre dager. Tumor volum ble beregnet ved hjelp av en formel: volum = (L x B
2) /2 hvor L = lengde; W = bredde. *
P
0,05 når DAC-behandling er i forhold til PBS eller Cytidine behandling. Fem til seks mus ble benyttet i hver gruppe, og data ble oppsamlet fra to eksperimenter. (B) EL4-celler behandlet med DAC ble injisert i C57BL /6 mus s.c. ved en dose på 1 x 10
4 celler /mus (G1), 8 x 10
4 celler /mus (G2) eller 16 x 10
4 celler /mus (G3). PBS-behandlede EL4-celler (1 x 10
4 celler /mus) fungerte som kontroll. Mus overlevelse data vises. Fem mus ble inkludert i hver gruppe, og data som er vist er representative for tre uavhengige eksperimenter. (C) DAC-behandlede eller PBS-behandlede EL4-celler ble injisert inn i hver mus i.v. ved en dose på 1 x 10
4 celler /mus. Mus overlevelse ble overvåket i opptil 100 dager etter tumorcelle-injeksjon. Ti mus per gruppe ble anvendt, og data som er vist er representative for tre uavhengige eksperimenter. (D) mus med etablerte EL4-tumorer ble behandlet med DAC eller PBS i.p. i 5 påfølgende dager med start på dag 10. De viste data er representative for tre forsøk. Stjernene viser statistisk signifikans av
P
. 0,05
DAC Behandling induserer Anti-tumor CTL Responses
Det faktum at forbigående DAC behandling resulterte i vedvarende tumor regresjon antyder at DAC behandling kunne ha indusert anti-tumor immunresponser. For å teste denne muligheten, ble C57BL /6-mus med etablerte EL4-tumorer behandlet med DAC som beskrevet ovenfor (figur 1D). Syv til ti dager senere ble musene avlivet, og mononukleære celler fra svulster ble farget for CD4, CD8 og NK1.1 /CD3, fulgt av analyse ved hjelp av flow cytometri. Som vist i figur 2A, hadde tumorer fra DAC-behandlede mus betydelig økt antall av CD8
+ og CD4
+ T-celler sammenlignet med tumorer fra vehikkelbehandlede mus; NK1.1
+ CD3
– NK-celler var knapt synlig i tumorer fra DAC-behandlede og PBS-behandlede mus (figur 2A, B). Tumorene fra DAC-behandlede mus inneholdt et høyere antall IFN-γ produserende CD8 + T-celler sammenlignet med tumorer fra bærer-behandlede mus (figur 2C, D). For å avgjøre om økte T-celle responser var ansvarlige for DAC-indusert tumorregresjon, ble C57BL /6 mus med etablerte EL4 svulster behandlet med DAC også behandlet med anti-CD8 eller anti-CD4-antistoffer eller deres relative kontroll antistoffer i.p. Anti-CD8 eller anti-CD4-behandlingen resulterte i fullstendig uttømming av CD8
+ eller CD4
+ celler fra miltene og tumorer (figur 3A, C). Uttømming av CD8
+ T-celler (Figur 3B), men ikke CD4
+ T-celler (figur 3D), resulterte i mer aggressiv tumorvekst i ellers beskyttede mus. Således DAC behandling av mus med etablerte tumorer indusert CD8
+ T-celle-mediert anti-tumor-immunitet.
(A-B) C57BL /6 mus med etablerte EL4-tumorer ble behandlet med DAC (1 mg /kg kroppsvekt) eller PBS en gang daglig i 5 påfølgende dager. 7-10 dager etter behandling ble musene avlivet, tumorene ble høstet, og dissosierte tumorceller ble farget for ekspresjon av forskjellige celleoverflatemarkører, etterfulgt av strømningscytometri kvantifisering for CD8
+, CD4
+ og NK1. 1
+ CD3
– celler. (C) Strømningscytometrisk analyse og kvantifisering av intracellulær IFN-γ produksjon av tumor-infiltrerende CD8
+ T-celler. Barer representerer gjennomsnittet + SD; n = 3-7 mus per gruppe. (D) Flowcytometrisk analyse av intracellulære IFN-γ produksjon av tumor infiltrerer CD4
+ T-celler. Barer representerer gjennomsnittet + SD; n = 3-7 mus per gruppe. Students t test ble benyttet for statistisk analyse. Tall i flowcytometrisk tallene tyder% positive celler som tilsvarer hver gate.
Fire doser av anti-CD8 eller anti-CD4 antistoff (400 mikrogram /per mus, ip) ble injisert på 4 dagers mellomrom begynner på dag 1 etter DAC behandling. Tre mus i hver gruppe ble anvendt for forsøket er vist. (A) CD8
+ T-celler i miltene og tumorer ble analysert ved flow-cytometri etter at anti-CD8 antistoff eller en isotype-matchet kontrollantistoff behandling. (B) Tumor vekst i mus behandlet med anti-CD8 eller en isotype-matchet kontrollgruppe mAb følgende DAC administrasjon. Dataene er representative for to uavhengige forsøk med lignende resultater. Stjernene viser statistisk signifikans av
P
0,05. (C) CD4
+ T-celler i miltene og tumorer ble analysert ved flow-cytometri etter at anti-CD4-antistoff eller en isotype-matchet kontrollantistoff behandling. (D) Tumor vekst av mus behandlet med anti-CD4 eller en isotype-matchet kontroll mAb følgende DAC administrering. Dataene er representative for to uavhengige forsøk med lignende resultater. Tall i flowcytometrisk tallene tyder% positive celler som tilsvarer hver gate.
DAC behandling induserer CD80 uttrykk i tumorceller
Siden DAC behandlingsinduserte CTL responser i EL4 svulster, vi en hypotese om at DAC behandling kan oppregulerer immunstimulerende molekyler tilstede på EL4 celler som kan stimulere CTL-responser i immunkompetente mus. Tidligere studier har rapportert oppregulering av MHC klasse molekyler og tumorantigener av demethylating midler [11], [17]. Men vi klarte å påvise oppregulering av MHC klasse I og klasse II molekyler i DAC-behandlede EL4 celler (data ikke vist). For ytterligere å utforske mekanismene for DAC-indusert tumor immunitet, sammenlignet vi differensial uttrykket av gener i DAC-behandlede EL4 celler og kontroller ved hjelp av cDNA microarray analyser (GEO tiltredelse # GSE38473) og funnet ut at DAC behandling vesentlig endret genuttrykk profilering i EL4 celler sammenlignet med kjøretøy behandling (figur S1 A). Totalt 847 oppregulert gener ble identifisert i DAC-behandlede EL4 celler med SAM-analyse (Figur S1B). Blant de oppregulert genene i DAC-behandlede EL4-celler, 3 kreft testis antigener og 9 klynge av differensiering (CD) molekyler inkludert CD80 (B7-1), en viktig T-celle-kostimulerende molekyl, ble identifisert (figur 4A). RT-PCR og QRT-PCR også bekreftet sin oppregulering (figur 4B og 4C).
Musen SmartArray chips ble hybridisert med RNA avledet fra DAC eller PBS behandles EL4 celler. (A) Heatmap av enkelte oppregulert gener ved DAC behandling. Kolonner representerer microarray data innhentet fra 3 uavhengige biologiske replikat. (B) RT-PCR ble brukt til å validere oppregulert gener. (C) QRT-PCR ble brukt til å kvantifisere oppregulert gener i DAC og PBS behandlet EL4 celler.
For å bestemme utholdenhet og stabilitet DAC- indusert CD80 uttrykk, EL4-celler ble dyrket i medium inneholdende DAC (0,25 uM) eller PBS i 72 timer. DAC-indusert CD80-ekspresjon i EL4-celler ble bekreftet ved både mRNA (figur 5A) og proteinnivå (figur 5B). Kinetisk analyse viste at CD80 uttrykk nådde 3-5 dager etter DAC behandling, og ble opprettholdt ved betydelige nivåer for ca 3 uker, og deretter gikk ned til basenivå (figur 5C). For å teste om DAC behandling kan indusere CD80 uttrykk
in vivo, etter EL4 celler (CD45.2
+) ble injisert subkutant inn i C57BL /6 mus eller i.v. inn CD45.1 congenic mus. To uker senere ble musene behandlet med DAC (1 mg /kg kroppsvekt, i.p.) i 5 påfølgende dager. Sju til ti dager senere kreftceller fra DAC- og kjøretøy-behandlede mus ble undersøkt for CD80 uttrykk. DAC behandling signifikant oppregulert CD80 uttrykk i EL4 celler fra subkutant tumorer (figur 5D, venstre panel), så vel som i EL4-celler fra benmarger (figur 5D, høyre panel). For å bestemme hvorvidt DAC-indusert oppregulering av CD80 er et generelt fenomen, ble 6 humane leukemicellelinjer og 2 humane lymfom cellelinjer behandlet med DAC (1 uM i 72 timer) etterfulgt av RT-PCR-analyse. Fire av 5 CD80–negative cellelinjer (U937, THP-1, NB 4 og Molt-4) viste DAC-indusert CD80 uttrykk, mens i tre cellelinjer med pre-eksisterende CD80 genekspresjon (K562, Hut-78 og Raji) den induserende effekt var ikke åpenbar (figur 5E).
(A) EL4-celler ble behandlet med DAC (0,25 uM) eller PBS i 72 timer. RT-PCR ble benyttet for å påvise CD80 genekspresjon i DAC og PBS-behandlede EL4-celler. GAPDH-genet ble amplifisert samtidig som en lasting kontroll. (B) Flowcytometrisk analyse av CD80 uttrykk i DAC-behandlet og PBS behandlet EL4 celler. (C) EL4-celler ble behandlet med DAC og PBS i 3 påfølgende dager, og ble opprettholdt i kultur. Celler ble høstet hver to dager og farget med anti-CD80, etterfulgt av strømningscytometrisk analyse. (D) EL4-celler (CD45.2) ble injisert s.c. inn i C57BL /6 mus eller i.v. inn CD45.1 congenic C57BL /6 mus. DAC ble administrert intraperitonealt 2 uker senere i 5 påfølgende dager. EL4 celler fra dissosierte tumorer (venstre panel) og bein gresskar (BM) (panel høyre) ble analysert for CD80 uttrykk ved flowcytometri. (E) Induksjon av CD80-ekspresjon i humane kreftcellelinjer. Kreftceller ble behandlet med DAC (0,25 uM) eller PBS i 72 timer. RT-PCR ble benyttet for å bestemme CD80-genekspresjon. Tall i flowcytometrisk tallene tyder% positive celler som tilsvarer hver gate.
DAC induserer Demetyler av arrangøren regionen i CD80 Gene
For å finne den underliggende mekanismen som DAC induserer CD80 uttrykk i EL4-celler, analyserte vi sekvensen av promotorområdet av murin CD80. Det var ingen typisk CpG øyer i promoter regionen CD80. Imidlertid 14 CpG-dinukleotider ble funnet i Exon1 og dens oppstrøms 800 bp region (figur 6A). To par primere ble utformet for bisulfite sekvensering analyse av to fragmenter som dekker nukleotid -792 til -335 (F1), og nukleotid -151 til 258 (F2). Vi først sammen metylering statusen til CpG-dinukleotider i de to fragmenter fra to EL4 subkloner med eller uten naturlig ekspresjon av CD80 (figur 6B). I F1, ble 96% av CpG dinukleotider metylert i CD80
– celler versus 67% i CD80
+ celler. I F2, ble 92% av CpG dinukleotider metylert i CD80
– celler sammenlignet med 6% i CD80
+ celler (figur 6C). DAC behandling av EL4-celler forårsaket en betydelig økning i demetylering områder i både F1 og F2 regioner (figur 6D). Blant DAC-behandlet EL4 celler, CD80-
+ celler utstilt flere demetylering områder sammenlignet med DAC-behandlet CD80
– celler (figur 6E). Således er CD80 genekspresjon i EL4-celler nært knyttet til demetyleringen status for dens promoter-regionen og DAC behandling signifikant øker demetylering av CD80 promotor.
(A) Fordelingen av CpG-dinukleotider i en region 1 kb oppstrøms exon en av CD80-genet. Tallene refererer til posisjonen i forhold til 5′-enden av CD80. To CpG beriket regioner (F1 og F2) ble valgt for Bisulfite sekvensering analyse. (B) Flowcytometrisk analyse av CD80 uttrykk på to EL4 varianter (EL4C3 og EL4C45). Tall i flowcytometrisk tallene tyder% positive celler som svarer til hver gate. (C) Bisulfite sekvensering av CD80-promoter-regionen i EL4C45 (øvre panel) og EL4C3 (nedre panel). Åpne og fylte sirklene representerer demetylert og denaturert CpG områder, henholdsvis. Metyleringen frekvens på CpG steder av hver cellelinje er angitt. (D) Bisulfite sekvensanalyse av CD80 promoter-regionen i DAC- og PBS-behandlede EL4-celler. (E) EL4-celler ble først behandlet med DAC eller PBS, CD80
+ og CD80
– EL4-celler ble deretter sortert ved hjelp av strømningscytometri basert på sortering. Bisulfite sekvense analyse ble utført på DAC-behandlet, CD80
+ og CD80
-. EL4 celler
DAC-indusert CD80 uttrykk på EL4 Cells Triggere Anti-tumor CTL Response
for å finne ut om DAC-indusert CD80 uttrykk i EL4 celler utløser anti-tumor CTL-responser, EL4 celler ble dyrket med DAC i 72 timer. CD80
+ og CD80
– EL4 celler ble deretter separert ved hjelp av flowcytometri-baserte high speed sortering for å få høyt renset CD80
+ og CD80
– EL4 celler (figur 7A). Disse celler ble deretter injisert i C57BL /6 mus (2 x 10
4 celler /mus s.c.). Alle musene som fikk CD80
– EL4 cellene vokste svulster, mens flertallet (60-80%) av musene som fikk DAC-behandlet CD80
+ EL4 celler klarte ikke å vokse svulst. I noen tilfeller, CD80
+ EL4 tumorer vokste transient eller vokste senere (figur 7B). CD80
+ EL4 svulster inneholdt mye høyere tall for CD8
+ og CD4
+ T-celler (Figur 7C-E) sammenlignet med CD80
– EL4 svulster. NK1.1
+ CD3
– NK-celler ble bare påvist i noen tilfeller av CD80
+ EL4-tumorer, men ikke i CD80
– EL4-tumorer (figur 7C, F). Dermed DAC-indusert CD80 uttrykk utløser anti-tumor immunitet
in vivo
.
(A) EL4 celler ble behandlet med DAC. CD80
+ og CD80
– EL4-celler ble separert ved strømningscytometri-baserte sortering. Flowcytometrisk analyse av CD80 uttrykk i EL4 celler før og etter sortering vises. (B) tumorvekst kinetikk DAC-behandlet CD80
+ og CD80
– EL4 celler. 2 × 10
4 CD80
+ eller CD80
– DAC-behandlede EL4 celler ble injisert subkutant i hver mus. Tumorvekst i individuelle mus er vist. (C) Flowcytometri analyse av T-celle og NK celleinfiltrasjon i CD80
+ og CD80
– svulster. Enkeltcellesuspensjoner av tumorer ble farget for CD4, CD8, CD 3, NK1.1 fulgt av strømningscytometri-analyse.
