Abstract
Bakgrunn
Behandling av metastatisk prostatakreft (PCA) med enkle midler har vist bare beskjeden effekt. Vi antok dual hemming av ulike baner i PCA resulterer i forbedret tumor hemming. Src-familie kinaser (SFK) og insulin-lignende vekstfaktor-1 (IGF-1) aliserte akser er avvikende aktivert i både primær-PCA og benmetastaser og regulere forskjellige og overlappende funksjoner i PCa progresjon. Vi undersøkte antitumoreffekten av hemming av disse banene.
Materialer og metoder
Src andIGF-1 reseptoren (IGF-1R) hemming ble oppnådd
in vitro
av kort hårnål (sh) RNA og
in vitro Hotell og
in vivo
av små molekyl hemmere (dasatinib og BMS-754807, mot SFK og IGF-1R /insulinreseptoren (IR), henholdsvis).
Resultater
In vitro
, hemning av IGF-1 signale påvirket celle overlevelse og spredning. SFK blokade alene hatt beskjedne effekter på spredning, men betydelig forbedret IGF-1R blokade. Disse funnene korrelerte med en robust hemming av IGF-1-indusert akt1 fosforylering av dasatinib, mens akt2 fosforylering var SFK uavhengig og bare hemmet av BMS-754807. Således fullstendig inhibering av Akt begge gener, ikke sett av hvert av legemidlene alene, er sannsynligvis en viktig mekanisme for redusert overlevelse av PCA-celler. Videre dasatinib og BMS-754807 hemmet
in vivo
vekst av primære humane xenograft MDA PCa 133, med tilsvarende hemming av Akt i svulster. Også, både ortotopisk og intratibial tumorvekst av PC-3-celler ble mer potent hemmet av dual SFK og IGF-1 R /IR-blokade i forhold til enten svei alene, med en tilsvarende reduksjon i benomsetningsmarkører.
Konklusjoner
Dual IGF-1R /IR og SFK hemming kan være en rasjonell terapeutisk tilnærming ved PCA ved å blokkere både uavhengige og komplementære prosesser som er kritiske for tumorvekst
Citation. Dayyanis F, parikh NU, Varkaris AS Song JH, Moorthy S, Chatterji T, et al. (2012) Kombinert Hemming av IGF-1R /IR og Src-familie kinaser Forbedrer Antitumor effekter i prostatakreft ved å redusere Aktivert Survival Pathways. PLoS ONE 7 (12): e51189. doi: 10,1371 /journal.pone.0051189
Redaktør: Kaustubh Datta, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 03.07.2012; Godkjent: 30 oktober 2012; Publisert: 26.12.2012
Copyright: © 2012 Dayyanis et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. F.D. ble støttet av United States National Institutes of Health stipend T32 CA009666; F.D., G.E.G., J.C.A., og C.J.L. ble støttet av en P50 CA140388-01; F.D., G.E.G., og C.J.L. Det ble også støttet av en bevilgning fra Prostate Cancer Foundation. Dette arbeidet ble også støttet av NIH gjennom MD Anderson Cancer Center Support Grant, 5 P30 CA016672-35. S.N.M. ble støttet av en Prostate Cancer Research Program tilskudd på UTMDACC. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og har følgende konflikter. De erklærer at JC og M.G. er ansatt i Bristol-Myers Squibb. Dette endrer ikke sin tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Metastatisk prostatakreft (PCA) står for anslagsvis 28.000 dødsfall i 2012 [1]. I avansert, kastrering-resistente metastatisk PCa (CRPC), eksisterer noen behandlingstilbud. Det er bare tre FDA-godkjente kjemoterapeutika for CRPC: docetaxel og cabazitaxel [2], [3], som begge viser bare en beskjeden overlevelse fordel for menn med CRPC, og mer nylig, CYP17 inhibitor abirateronacetat, godkjent for bruk etter docetaxel svikt (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT00638690), bedre total overlevelse etter 3,9 måneder [4]. For minimalt symptomatisk metastatisk CRPC, en randomisert fase 3 studie viste overlevelse fordel med vaksinen Sipuleucel-T [5] .Dermed, mens lovende agenter er bedre overlevelse av PCA pasienter, er ytterligere terapeutiske midler klart behov for avansert stadium sykdommen [6].
Nyere fremskritt i forståelsen av signalveier som styrer veksten av PCA celler i beinet har ført til en rekke kliniske studier med målrettet terapi. En av de mest lovende mål ved PCA er Src-familie kinaser (SFKs), en familie av ikke-reseptor-protein-tyrosin-kinaser, ekspresjon og spesifikke aktiviteter av disse er øket i flere typer av humane tumorer [7]. Prekliniske data i PCa viser at inhibering av SFKs avtar proliferasjon og, mer kraftig, invasjon og migrasjon [8], [9]. I tillegg er Src-aktivitet viktig i mikromiljøet, påvirker osteoclast funksjon. Således inhibitorer Src blokk, delvis tumor /mikro interaksjoner som fører til «ond sirkel» av benmetastase [10]. I studier med
in vivo
ortotopiske museforsøk, hemming av SFKs redusert både prostata svulst vekst og utvikling av lymfeknutemetastaser [11]. Delvis basert på disse funnene og noen lovende resultater fra en fase 1/2 studie [12], dasatinib, et lite molekyl multi-kinase inhibitor med selektivitet forSFK /abl [8], har blitt testet i kombinasjon med docetaxel i en randomisert fase 3 rettssak for pasienter med CRPC (ClinicalTrials.gov ID: NCT00744497).
Analyser av fase 1/2 rettssaken indikere SFK hemming pluss docetaxel ikke produsere meningsfulle kliniske responser i et flertall av pasientene, men var svært lovende for en undergruppe av pasienter [13]. Således identifisere ytterligere signalveier som bidrar til metastatisk vekst av PCa og kan forsterke virkningen av Src-hemning er egnet til å gi lovende kombinasjoner av inhibitorer som vil være mer effektive for behandling av PCa.
En slik reaksjonsvei deregulert i PCa er mediert av den insulin-lignende vekstfaktor-1-reseptor (IGF-1R). IGF-1R er innblandet i spredning og overlevelse av mange krefttyper [14] og er overuttrykt ved PCA [15]. IGF-1 R-signalering er koblet til PCa risiko, og en av dets ligander, IGF-2, er også overuttrykt i PCA benmetastaser [16], hvor den fremmer proliferasjon og overlevelse av PCA-celler [17], [18], [ ,,,0],19], [20], [21]. Studier med monoklonale antistoffer mot IGF-1R er implisert denne reseptoren som viktig i PCa progresjon i androgen-sensitive så vel som -resistente tumormodeller [22]. Selv om IGF-1 R signalisering medieres delvis av Src-reaksjonsveien, andre nedstrøms signalveier av IGF-1R er Src uavhengig og upåvirket av Src-inhibering [14]; disse tilleggsveier har nylig blitt vist å spille en viktig rolle i celleoverlevelse PCa [23]. Aktivering Src og IGF-1R aktiverer også Akt, en nøkkel effektor av PI3K /Akt /mTOR vei, som er avvikende aktivert i flertallet av maligniteter, fremme cellevekst, proliferasjon og overlevelse [24], [25] .Men hvorvidt disse hemmere er like effektive i å hemme akt1, 2 og 3 funksjoner er ikke kjent, og hvis kombinere dem produsert bedre resultater i å hemme denne overlevelse veien ble et mål for dette arbeidet. Her, undersøkte vi de individuelle og kombinerte effekten av dasatinib, en SFK-inhibitor, og BMS-754807, er en potent og reversibel lite molekyl inhibitor av IGF-1R [26] og insulinreseptoren (IR) med aktivitet mot forskjellige faste tumorer
in vitro
så vel som i flere xenograft-modeller [26]. Som hemmere har off-target effekter, ble molekylær knockdown av disse banene også ansatt. Vi viser at inhiberingen av disse reaksjonsveier gir komplementære biologiske virkningene
in vitro
og
in vivo
, og at, i nærvær av IGF-1, inhibering av begge reaksjonsveier er nødvendig for å potente hemmere av Akt fosforyleringen og nedstrøms formidlere av kreft celle overlevelse.
Materialer og metoder
cellekulturer
PC-3 og LNCaP celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection. De representerer både adenovirus og små-celle varianter av PCa [27]. PC3-MM2 [28] og PC3-LG-celler [29] ble vennlig levert av Dr. Jesaja Fidler (The University of Texas MD Anderson Cancer Center). PC-3-villtype-celler og stabile transfektanter ble opprettholdt i DMEM F-12 medium (Hyclone) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS; Hyclone) og 1% penicillin /streptomycin (Gibco). LnCap villtype-celler og stabile transfektanter ble holdt i RPMI 1640 medium (Hyclone) supplert med 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin. BMS-754807 ble gitt av Bristol-Myers Squibb, og dasatinib ble vennlig levert av Dr. John C. Araujo (MD Anderson). Cell-godkjenning og mycoplasma screening ble utført hvert halvår i henhold til institusjonelle retningslinjer.
Stabile transfektanter
Klar-til-transfeksjon kort hårnål (sh) RNA-GFP-puromycin konstruksjoner mot menneske IGF1-R (# SR302344) og Src (# SR304574) ble kjøpt fra OriGene Technologies. En universell egge negativ kontroll shRNA (# SR30004) ble levert av produsenten. -Celler ble transfektert ved å bruke Fugene 6-reagens (Roche) i henhold til produsentens instruksjoner. Stabile kloner ble utvalgt med puromycin. Målet knockdown ble verifisert 3-4 uker etter transfeksjon ved Western blot, som beskrevet nedenfor.
celleproliferasjonsanalyse
Celler (3 x 10
4per brønn) ble dyrket i 6-brønns retter for opp til 96 timer med og uten dasatinib (100 nM) eller BMS-754807 (0,5-5 mm). For celle telling ved forskjellige tidspunkter ble cellene vasket en gang med PBS (Gibco), inkubert med TrypLE dissosiasjon reagens (Gibco) og tellet ved bruk av en automatisert cellelevedyktighet analysator (Vi-Cell XR; Beckman Coulter). Alle forsøk ble utført in triplo.
Annexin V-farging
Farging av apoptotiske celler ble utført ved anvendelse av et annexin V-PE deteksjon kit (BD Pharmingen) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet ble cellene dyrket i 48 timer, etterfulgt av farging med annexin V-PE. Cellene ble analysert på en BD FACS Canto flowcytometer, ved hjelp av FACS Diva programvare (BD Biosciences).
Cellesyklus
Cellene ble dyrket i 24 timer, høstet, og vasket en gang i PBS, deretter resuspendert i iskald 70% etanol og oppbevart ved -20 ° C i 1 time. Cellene ble deretter vasket en gang i PBS og ble behandlet i 45 minutter med DNAse-fri RNase (Invitrogen) ved 37 ° C. Propidiumjodid ble tilsatt ved en sluttkonsentrasjon på 1 pg /ml, og cellene ble inkubert i 20 minutter ved romtemperatur. Analysen er gjort på en BD FACS Canto flowcytometer, ved hjelp av FACS Diva programvare.
Dyr
sveitsiske nu-nu /NCR nakne mus ble kjøpt fra dyreproduksjonsområde ved Institutt for eksperimentell stråling Oncology ved MD Anderson. Alle mus ble plassert og holdt under spesifikke patogen-frie forhold i henhold til MD Anderson Institutional Animal Care og bruk komité retningslinjer. MD Anderson Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) anmeldt denne studien og spesielt godkjent det.
xenografttumorer
Subkutane grafts MDA PCa 133 (en xenograft fra en kastrering-resistent pasient avledet fra en benmetastase som uttrykker AR og PSA og vokser bare i mus og ikke i cellekultur) ble samlet som tidligere beskrevet [30]. I korte trekk, ble fragmenter av tumor implantert subkutant i alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) mus i en størrelse mindre enn 1 mm
3. Tumorene fikk vokse inntil de nådde størrelsen på 3 mm
3, og deretter på mus (n = 4 i hver gruppe) ble behandlet daglig med dasatinib og BMS-754807, alene og i kombinasjon, i 26 dager. Svulster ble målt to ganger ukentlig, og volumet ble beregnet ved hjelp av formelen
V = W
2 × L /2
. På dag 26 ble musene avlivet, svulstene ble høstet, og proteinlysatene ble fremstilt som angitt nedenfor for vestlige blotter.
ortotopiske prostata /intratibial injeksjoner
Intraprostatic injeksjon av luciferase-uttrykke PC3 -LG celler ble utført som tidligere er publisert av vår gruppe [31]. Kort sagt ble 40 Swiss nu-nu /Ncr nakne mus (8-12 uker gamle) ble bedøvet med 2% isofluran i en isofluran-oksygenkammer, og deretter plassert i en liggende stilling. En midtlinjesnitt ble gjort på nedre del av magen, og prostata ble exteriorized som beskrevet av Park et al. [32]. Femti mikroliter av HBSS inneholdende PC3-LG (total, 5 x 10
5 celler) ble injisert orthotopically som tidligere beskrevet [31] inn i en lateral flik av prostata. Såret ble lukket med metall kirurgiske klemmer. Ti dager etter xenograft injeksjon ble svulst engraftment bestemt av
in vivo
bioluminesens imaging (IVISTM 100 system; Xenogen Co.) med musene under 2% isofluran innånding anestesi. Tretti-to mus som viser luciferaseaktiviteten i nærheten av medianverdien ble valgt ut og randomisert ved hjelp av en Excel® (Microsoft) program inn i 4 grupper (n = 8 for hver gruppe): kontroll kjøretøy, BMS-754807 alene (12,5 mg /kg kropps vekt /dag), dasatinib alene (12,5 mg /kg kroppsvekt /dag), og en kombinasjon av BMS-754807 (6,25 mg /kg kroppsvekt /dag) og dasatinib (12,5 mg /kg kroppsvekt /dag). Disse konsentrasjonene ble bevisst valgt på nivåer hvor mono aktivitet ikke var forventet. Alle legemidler ble administrert av oral sonde 6 dager /uke. Musene ble avlivet 4 uker etter injeksjon av cellene. Primære svulster i prostata ble skåret ut og veiet
Intratibial injeksjon av PC3-mm2-celler ble utført som tidligere beskrevet [28].; Kort sagt ble nakne mus som bedøvet som beskrevet ovenfor, og 2,5 x 10
5-celler ble injisert inn i tibia som beskrevet [28]. Tolv dager etter injeksjon ble musene behandlet med saltoppløsning (n = 10) dasatinib (n = 9), BMS-754807 (n = 9), eller begge deler (n = 8) ved de doseringer som er beskrevet ovenfor. Fire uker etter behandlingsstart, ble musene avlivet. Røntgenbilder ble tatt fra alle mus, og fra 4 mus i hver gruppe, ble det tibiae høstet og forberedt, og computertomografi ble utført som beskrevet tidligere [32], [33].
Bone ødeleggelse etter intratibial injeksjon av PC3-mm2 celler i hårløse mus ble gradert basert på følgende score: 0 = minimale endringer; 1 = lytisk benskader, cortex intakt; 2 = Cortex ødeleggelse, ingen signifikant hevelse av bløtdeler; 3 = Cortex ødeleggelse, betydelig bløtvev engasjement.
Immunoblotting
Immunoblotting ble utført som beskrevet tidligere [34]. I korthet ble cellene lysert og klaret, og proteinene ble separert via 8% SDS-PAGE, etterfulgt av overføring på polyvinylidenedifluoride membraner (Millipore). Membranene ble inkubert med antistoffer mot Src, Yes, Fyn, Lyn, IGF-1R, Akt, ERK1 /2, og S6 (alle kjøpt fra Cell Signaling) og LC3 (Sigma), etterfulgt av pepperrot peroksidase-konjugert sekundært antistoff (Bio -Rad).
Immunpresipitasjon
for å bestemme fosforylering av akt1 og to spesielt, PC-3 celler var serumsultede opptil 48 timer og deretter inkubert i 2 timer med dasatinib (100 nm), BMS-754807 (5 uM), eller begge deler, etterfulgt av 15 minutters stimulering med 50 ng /mL rhIGF-1 (R E og TUNEL-farging ble utført på MDA PCa 133 xenografttumorer etter explantation som tidligere beskrevet [36], [37]. I hver gruppe, ble 5 forskjellige kraftige felt (HPF) undersøkt og antallet TUNEL-positive celler ble tellet, og det gjennomsnittlige antall TUNEL-positive celler /HPF ble beregnet. Hoechst flekken ble brukt til farging cellekjerner.
ELISA
Kvantitativ bestemmelse av murine alkalisk fosfatase og N-telopeptid i museserum ble utført ved hjelp av de respektive ELISA kits (Tsz ELISA) i henhold til produsentens bruksanvisning. Alle standardkurver hadde en R2 ≥0.990. Positive kontroller for hver analyse ble levert av produsenten.
statistikker
For statistiske sammenligninger av kontinuerlige parametre, Student er
t
-test ble brukt, og for diskrete verdier, chi-kvadrat test ble brukt; α 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
IGF-1R effekten påvirker celleproliferasjon og apoptose
Vi testet vår begrunnelse for kombinert hemming av Src og IGF-1R. trasé ved å bestemme virkningene på vekst og apoptose deretter signaltransduksjon, etterfulgt av effekter på tumorvekst i flere relevante dyremodeller. Celler ble dyrket i 10% FBS, tilstrekkelig til å føre til aktivert IGF-1R. Under disse betingelser, hemming av Src og IGF-1R ved kombinasjonen av dasatinib og BMS-754807 redusert celleproliferasjon i både PC-3 og LNCaP-celler, som vist i fig. 1A. Først fikk vi bekreftet uttrykk for SFKs Src, Yes, Fyn, og Lyn i alle PCA cellene undersøkt (fig. S1 A). For å avgjøre om de hemmere primært berørte Src og IGF-1R, ble stabile shRNA-mediert knockdowns laget for
SRC Hotell og
IGF-1R
, henholdsvis. A 90% knockdown av de respektive signal enzymene ble oppnådd (Fig S1B.). SFK hemming med dasatinib redusert spredning av PC-3 celler, i samsvar med tidligere funn [11]; knockdown av
IGF-1R
redusert spredning på 96 timer mer enn dasatinib gjorde (
P
0,05; S1C), og kombinasjonen av SFK hemming og
IGF-1R
knockdown ytterligere redusert spredning (
P
0,05). Disse funn ble bekreftet ved MTS-analyse av en 96-timers kultur (data ikke vist). Inhiberingen av proliferasjon observert med BMS-754807 var mer uttalt i begge cellelinjene enn med shIGF-1R, noe som tyder på at fenotypen sett med BMS-754807 er sannsynligvis skyldes delvis, til evnen til BMS-754807 for å inhibere insulinreseptoren (IR) og [26] .For å spesifikt undersøke effekten av BMS-754807 på IGF-1 stimulering av IGF-1R, bestemt vi virkningen av økende doser av inhibitoren på PARP-spaltning. Som vist i fig S1D, PARP spalting var doseavhengig. Vi undersøkte også tidsavhengighet av veksthemming. I nærvær av BMS-754807, ble vekstkinetikk hemmet på en tidsavhengig måte i forhold til ubehandlede celler (figur S1E). Disse resultatene er i samsvar med BMS-754807 påvirker cellevekst gjennom økt apoptose
(A) PC-3 eller LNCaP cellene ble dyrket i 96 timer med og uten dasatinib. (DSA, 100 nm) og BMS-754807 ( BMS-807; 2 uM for PC-3 og 0,5 pM for LNCaP-celler), alene og i kombinasjon, og celletall ble bestemt som beskrevet i fremgangsmåtene. (B) PC-3 og LNCaP-celler ble inkubert i 24 timer med og uten DSA (100 nM) og BMS-754807 (5 uM til PC-3 og 1 pM for LNCaP-celler), alene og i kombinasjon, og cellesyklus farging etter 24 timer ble utført ved anvendelse av propidiumjodid. (C) PC-3-celler ble inkubert i 48 timer med og uten DSA (100 nM) og BMS-754807 (2 uM), alene og i kombinasjon, og andelen av apoptotiske celler ble bestemt ved strømningscytometrisk analyse av annexin-V farging. (D) Venstre: cellesyklusen farging med propidiumjodid i PC-3-shIGF-1R celler. Høyre: PC-3-shIGF-1R og kontrollceller ble inkubert i 48 timer med og uten DSA (100 nM), og andelen av apoptotiske celler ble bestemt ved strømningscytometrisk analyse av annexin-V-farging. Alle forsøk ble utført in triplo. *
P
0,05; N.S. ikke signifikant.
I PC-3 og LNCaP celler, behandling med kombinasjonen av dasatinib og BMS-754807 økt cellesyklus arrest og celledød i forhold til enten inhibitor alene (Fig. 1B). Ved å undersøke den spesifikke bidraget av hver forbindelse, har vi funnet at inkubering av begge cellelinjer med BMS-754807 økte andelen SubG
1-celler (Fig. 1B), som korrelerer med en høyere fraksjon av annexin-V-positive celler hos 48 timer (når celledød var begynnelsen-(fig. 1C), samt tilsvarende med PARP-spaltning (fig. S1F). i motsetning til dette, finnes det ikke noen økning i SubG
1 fraksjon og annexin-V-positive celler ble observert med de Tilsetningen av dasatinib bare. for å screene for mulig induksjon av autophagy, vi også testet hvorvidt legemidler induserte omdannelse av LC3-i til LC3-II, en prosess som indikerer autophagic aktivitet. Som vist i fig. S1G hverken medikament (alene eller i kombinasjonen) produserte signifikante mengder av LC3-II, noe som tyder autophagy er ikke en viktig årsak til celledød.
Siden bare BMS-754807-indusert apoptose, så utførte vi et lignende eksperiment med shIGF-1R PC-3-celler til bestemme hvorvidt redusert IGF-1R ekspresjon spesielt økt apoptose. Faktisk, som vist i fig. 1D, knockdown av
IGF-1R
i PC-3-celler økte andelen SubG
1 samt annexin-V-positive celler sammenlignet med kontrollceller shRNA. Knockdown av
SRC
hatt liten effekt (data ikke vist).
Kombinasjonen av dasatinib og BMS-754807 resulterer i mer potent hemming av Akt enn gjør enten stoffet alene
Vi neste testet om kombinert hemming av SFKs og IGF-1R påvirket signalveier annerledes enn gjorde begge substansene alene. Vi først undersøkt potensielle nedstrøms mellomprodukter av disse banene, ERK1 /2 og Akt. Forsøk ble utført i nærvær og fravær av IGF-1 på grunn IGF-1 er rikt i mikromiljøet av CRPC pasienter. I serum-sultet forhold (for å undertrykke baseline IGF-1R aktivering), bekreftet vi målet hemming med både narkotika etter IGF-1 stimulering (Fig. 2A). ERK1 /2 ekspresjon eller fosforylering ble ikke påvirket av enten inhibitor alene, eller når den brukes i kombinasjon (fig. S2). I motsetning til dette ble Akt aktivering delvis inhibert av hver inhibitor alene, og fullstendig inhibert av kombinasjonen. For bedre å forstå mekanismen for Akt-hemming, vi først demonstrerte ekspresjonen av akt1 og 2 (fig. 2B, C), men ikke akt3 (data ikke vist), til påvisbare nivåer i PC-3-celler. I fravær av IGF-1, akt2, men ikke akt1, er delvis aktivert (fig. 2B, C). I nærvær av IGF-1, blir akt1 aktivert og akt2 fosforylering ytterligere økninger. Som vist på fig. 2B, 80% av akt1 fosforylering hemmes av dasatinib, mens dasatinib er ineffektive i å hemme IGF-1-indusert akt2 fosforylering (Fig 2C.). I motsetning til dette, BMS-754807 delvis, men ikke helt, ned både fosforylering av både akt1 og 2 i nærvær av IGF-1. Dual blokade av IGF-1R og SFK med kombinert BMS-754807 og dasatinib fullstendig inhiberer detekterbar akt1 og 2 fosforylering i nærvær av IGF-1 (fig. 2B, C). For å undersøke effektene på en nedstrøms mål for Akt, ble S6 fosforylering undersøkt. Etter avtale med resultatene av Akt hemming ble delvis hemming av S6 fosforylering sett med både dasatinib og BMS-754807 alene, og fullstendig hemming ble sett med kombinasjonen (Fig. 2D), noe som tyder på at hemme Akt funksjoner krever både dasatinib og BMS- 754807. Således er kombinasjonen av dasatinib og BMS-754807 avtar overlevelse delvis, på grunn av fullstendig inhibering av Akt.
(A) PC-3-celler ble serum-sultet i 72 timer og deretter pre-inkubert i 2 timer med BMS-754807 ved enten 2 uM eller 5 uM, med dasatinib ved 100 nM, eller ved begge midler. Etter 2 timer ble cellene stimulert med 50 ng /ml rekombinant human IGF-1 (rhIGF-1) i 3 minutter. Deretter protein ble høstet og (fosfor) -proteins IGF-1R, Src, og Akt ble bestemt ved western blot (WB). Vinculin ble brukt som kontroll lasting. (B og C) PC-3-celler ble stimulert med DSA (100 nM) og BMS-754807 (5 uM) som ovenfor, og deretter ble cellene høstet og immunopresipitert for akt1 (B) eller akt2 (C), fulgt av immunoblotting for fosfor-Akt. (D) PC-3 celler ble behandlet som i (A), og western blot ble kjørt for S6 og fosfor-S6.
Behandling av primære humane xenografttumorer med dasatinib og BMS-754807 er effektiv
in vivo Hotell og induserer svulst apoptose
for å bestemme effekten av kombinert hemming av Src og IGF-1R i en direkte xenograft av menneskelige PCA celler vokser i musemodeller, vi først behandlede mus som bærer primære humane xenograft MDA PCa 133 tumorer (for kastrering-resistente, AR positiv) med dasatinib og BMS-754807 alene og i kombinasjon (n = 4 i hver gruppe). Som vist på fig. 3A, 3 uker, var det en økning i tumorstørrelse i kontrollgruppen samt enkeltmedikamentgrupper, mens svulsten veksten ble betydelig redusert i kombinasjonsgruppen. Denne effekt var enda mer uttalt på dag 26, og på dette tidspunkt ble musene avlivet.
(A) MDA PCa 133 (avledet fra benmetastaser) celler ble implantert subkutant i nakne mus som beskrevet i Metoder. Når tumorene nådde et volum på 3 mm
3, ble musene behandlet med dasatinib og BMS-754807 alene og i kombinasjon (n = 4 i hver gruppe). Tumorer ble målt to ganger i uken. Vist er den relative økning i tumorstørrelse over tid i hver gruppe. *
P
0,05. (B) Musene ble avlivet 16 dager etter behandlingsstart, ble svulstene høstet, og vestlige blotter ble gjort for de angitte (totalt og phospho) -proteins. Vist er representative resultater fra en svulst i hver behandlingsgruppe. (C) Kvantifisering av TUNEL-farging for å påvise apoptose. Vist er den gjennomsnittlige (± SEM) antall apoptotiske celler per høy effekt felt (HPF) i hver gruppe.
immunoblotter på flash-frossen svulster høstet fra den monoterapi-behandlede mus viste hemming av src fosforylering av dasatinib og IGF-1R fosforylering av BMS-754807, viser at disse stoffene treffer sine viktigste mål. Akkurat som vi har observert i
in vitro
studier, Akt og S6 fosforylering ble bare delvis hemmet av hvert medikament alene. I motsetning til dette ble robust inhibering av Akt og S6 fosforylering er observert i kombinasjonsgruppen (fig. 3B). Videre apoptose ble øket, som bestemt ved TUNEL-farging av BMS-754807-behandlede tumorer og videre økes i kombinasjonsgruppen (
P
= 0,01, Fig. 3C). Disse resultatene tyder på at kombinert hemming av Src og IGF-1R er effektiv i primære humane xenografter, mediert delvis av nesten fullstendig hemming av Akt fosforylering.
For å undersøke ortotopiske svulst hemming, PC-3 LG-celler (valgt for deres androgen receptor [AR] -negativ status og robust vekst i ortotopiske modeller) ble injisert inn i prostata av nakne mus og behandlet som beskrevet i metodedelen. Fire uker etter celleinjeksjon ble musene drept og tumorene skåret ut og veiet (fig. S3A). Representative svulster fra de 4 behandlingsgrupper (total n = 8 for hver gruppe) er vist i fig. S3b. Det var ingen signifikant forskjell i tumorvekt mellom styre, dasatinib, og BMS-754807 grupper i de anvendte konsentrasjoner (som forventet), men de mus som var behandlet med kombinasjonen av legemidler hadde signifikant mindre svulster (
P
0,03; fig S3 A, B)
Dasatinib og BMS-754807 sperre PC3-MM2-indusert ben ødeleggelse og redusere benomsetningsmarkører
in vivo
å.. undersøke om dasatinib og BMS-754807 redusert PCa-indusert ben omsetning, vi injisert PC3-mm2 celler intratibially inn nakne mus. To uker etter injeksjonen, ble musene behandlet i 4 uker med enten medikament alene eller i kombinasjon (kontroll, n = 10; dasatinib, n = 9, BMS-754807, n = 9, kombinasjon, n = 8). På denne tiden, ble røntgenbilder tatt og mus ble tappet for blod etter euthanization. De involverte bein ble høstet for computertomografi. PCa celle-indusert tumorvekst og bein ødeleggelse, målt på vanlig røntgen, ble scoret i blindet måte som beskrevet i metoder. Mens, som forventet, behandling med dasatinib alene utstilt noen hemming av bein ødeleggelse, kombinasjonen av dasatinib og BMS-754807 mer effektivt hemmet intratibial tumorvekst i benet (Fig. 4A, B). Imidlertid bare en kombinasjon av medikamenter betydelig redusert serumnivåene av benomsetningsmarkører (Fig. 4C, D), noe som indikerer modulering av både PCA-celler og deres ben mikromiljøet, og dermed forstyrrer den ond sirkel [10]. Mens den modifikasjon av murine N-telopeptid, et surrogat for osteoklast-aktivitet, er en indikasjon på inhibering av osteolytisk PC3-MM2 cellelinje, den observerte reduksjonen i murine alkalisk fosfatase (tilsvarende osteoblastaktivitet) fremhever den gjensidige avhengigheten av disse cellene i fremgangs bein omsetning. Dasatinib alene har vist seg å indusere osteoblast modning [38]; dermed muligens øke RANKL sekresjon, som igjen normalt aktiverer osteoklastene. Imidlertid, som vist på Src – /- mus [39], er Src også en viktig regulator av osteoclast funksjon, og dette bekreftes av benet bevaring i dasatinib stående behandlede celler (figur 4B.). Men i de modeller som brukes, er dasatinib som et enkelt middel til det laveste konsentrasjon som brukes er tilstrekkelig til å hemme tumorvekst, noe som tyder på at under disse betingelser, ekspresjon av RANKL aktiveres i det minste delvis osteoclast funksjon, men at tilsetningen av BMS-754807 av dasatinib.Til sannsynligvis hemmer osteoblast modning, mink osteoclastaktivitet videre. Dette resultatet ser ut til å skje i hver modell, og dermed er et gjennomgående trekk i denne legemiddelkombinasjonen.
Bone-destruktive PC3-mm2 celler ble injisert intratibially i nakne mus. Etter behandling med dasatinib, BMS-754807 alene og kombinert, ble musene avlivet, og røntgenbilder og computertomografi (CT) skanning av den lange bein ble gjort (kontroll, n = 10; dasatinib, n = 9; BMS-754807 , n = 9, kombinasjon, n = 8). Blod ble samlet for serum benomsetningsmarkører. (A) Graden av beinødeleggelse ble blindt gradert i en semikvantitativ måte basert på røntgenbilder fra alle mus. Grafen viser andelen av høyverdig lesjoner (dvs. 2 eller 3) i hver behandlingsgruppe. *
P
0,05 kombinasjon vs. dasatinib bare. (B) Representative CT-skanning (øverst) og røntgenbilder (nederst) fra mus i hver gruppe. Piler og tallene indikerer lesjon området og karakteren av bein ødeleggelse. (C og D) Serumnivåer av murine alkalisk phospatase (C) og N-telopeptid (D) ble bestemt ved hjelp av ELISA. Barer indikerer SEM. [45].
