Abstract
Vårt mål var å vurdere sammenhengen mellom uttrykk og polymorfisme av TLR4 /NF-kB trasé og tykktarmskreft. TLR4 (
rs4986790
,
rs10759932
,
rs10759931 Hotell og
rs2770150
) ble genotypet i blodprøver av kolorektal pasienter og friske kontroller. TLR4 og cytokiner provoserende uttrykk ble evaluert av real time PCR på 40 matchende normale og tykktarm vev og proteinnivået ved Immunohistochemistry. Det høye nivået av ekspresjon TLR4 i colon cancer vev er hovedsakelig på grunn av infeksjoner av bakterier i human kolon og fører til induksjon av en akutt sekresjon av inflammatoriske cytokiner mediert av NF-kB. Også rapporterer vi her et klart bevis for en sammenheng mellom TLR4
rs10759931
polymorfisme (OR = 0,086, KI: 0,04 til 0,18, P = 0,00001). Dette polymorfisme påvirker hele befolkningen uten å være spesifikk for begge kjønn eller til alle aldersgrupper. I kontrast til
rs2770150
er assosiert med tykktarmskreft hos kvinner i aldersgruppen over 50 år og er nært knyttet til redusert nivå av kvinnelige kjønnshormoner under menopausen periode (OR = 0,188, KI: 0,074 til 0,48 , P = 0,00084).
rs10759932 Hotell og
rs4986790
synes å ha noen tilknytning til tykktarmskreft. Våre data tyder på at TLR4 SNPs kunne tjene som biomarkører for beslutningstaking i tykktarm kreft behandling
Citation. Semlali A, Reddy Parine N, Arafah M, Mansour L, Azzi A, Al Shahrani O et al. (2016) uttrykk og Polymorphism av Toll-like receptor 4 og Effekt på NF-kB inflammasjon i Colon kreftpasienter. PLoS ONE 11 (1): e0146333. doi: 10,1371 /journal.pone.0146333
Redaktør: Shrikant Anant, University of Kansas School of Medicine, USA
mottatt: 29 april 2015; Godkjent: 20 november 2015; Publisert: 15 januar 2016
Copyright: © 2016 Semlali et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Grant antall fastlege-VPP-260, https://dsrs.ksu.edu.sa/en. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Forkortelser : TLR4, Toll-like receptor 4; CRC, tykktarmskreft; SNPs, enkelt-nukleotid polymorfismer; LRRs, leucine-rich gjentar; DAMP, Patogen-assosiert molekylær mønster; Demper, Skade-forbundet molekylær mønster molekyler; TNF, tumor nekrose faktorer; TIR, Toll-interleukin1 reseptor; NF-kB, nukleær faktor kappa-lettkjede-enhancer av aktiverte B-celler; MAP, Mycobacterium avium subsp. Para tuberkulose; QPCR, Kvantitativ PCR; CI-tallet, Konfidensintervallene
Innledning
Tykktarmskreft (CRC) er en kompleks sykdom, og en av de mest vanlige typer kreft. Risikofaktorer for tykktarmskreft ser ut til å bli bestemt av et samspill mellom genetikk og en rekke miljøeksponeringer. Flere linjer av bevis støtter den oppfatning at svekkelse av immunsystemet kan bidra til risikoen for utvikling av mange kreftformer, og at aktivering av immunsystemet er kraftig fulgt for kreftterapi. I denne forstand, er foreningen av medfødt immunitet med tykktarmskreft dukker opp. Videre ble pasienter med immunsvikt vist seg å ha en økt kreftrisiko [1], og nyere studier har vist at nedsatt signalisering av medfødt immunitet reseptorer kan bidra til kreft patogenesen [2-5]. Medfødt immunitet er hovedsakelig aktivert og regulert av Toll-lignende reseptorer (TLR) [6] funnet i membraner av immunceller, slik som nøytrofiler, dendrittiske celler og makrofager, så vel som på celler i huden overflate og urin og magetarmkanalen [7] . Toll-like receptor aktivering er ansvarlig for drapet på mikrobielle celler under infeksjon samtidig la vertsceller intakt [8-10]. I likhet med andre TLR’ene, er TLR4 består av tre domener: en ekstra-cellulær domene som omfatter residiene 24-631 og som inneholder leucine-rich gjentar (LRRs), en transmembran region med et enkelt transmembranskruelinje mellom restene 632-652, og et C-terminalt cytoplasmatisk domene signale [11, 12]. TLR’ene utgjør en særlig viktig gruppe av mønstergjenkjennings reseptorer (PRRS) [13], og er lokalisert på celleoverflaten eller i endosomer. Disse er hovedsakelig uttrykt i vev som er involvert i immunforsvaret og har viktige roller i vertens forsvar mot patogene organismer. Hittil har 10 funksjonelle TLRs blitt beskrevet hos mennesker; TLR’ene 11-13 er funnet på gnagere (rotter og mus) [14] .TLRs spille en avgjørende rolle i aktivering av immunsystemet ved å regulere produksjonen av antivirale peptider og inflammatoriske cytokiner [15-19] gjennom høyt konserverte strukturelle motiver kjent som patogen-forbundet molekylære mønstre (PAMPs) .TLRs har vært innblandet i medfødt immunitet [5, 12, 20, 21], og endringer av TLR reaksjoner kan resultere i alvorlige virus og bakterieinfeksjoner eller en høyere risiko for kreft [4, 5, 20]; de har også vært innblandet i den inflammatoriske respons av intestinale epitelceller [22].
Signal domener av TLRs er kjent som Toll IL-1 reseptor (TIR) domener fordi de deler homologi med signal domenet IL -1R familiemedlemmer [23], som induserer NF-kB og IRF3 translokasjon og trans-aktivering [24] og aktivering av forskjellige inflammatoriske cytokin-gener [25, 26] av en MyD88-avhengige reaksjonsveien er felles for alle TLR’ene, bortsett TLR3 [ ,,,0],27, 28]. En annen TLR aliserte mekanisme er kjent som den MyD88-uavhengig reaksjonsvei er forbundet med stimulering av IFN-β og modning av dendritiske celler gjennom adapteren TRIF /TICAM-1 [29] eller gjennom trikk /TICAM-2, som er begrenset til TLR4 vei [30].
TLR4 genet ligger på kromosom 9 og koder for et protein som fungerer i immunrespons ved å aktivere kjernefysiske faktor kappa-light-chain-enhancer av aktiverte B-celler (NF-kB) [ ,,,0],18]. Nedskrivningen av TLR signale
in vivo
blir tydelig gjennom tilstedeværelsen av enkelt-nukleotid polymorfismer (SNPs), som har vært forbundet med reseptor hypo-respons og mottakelighet for bakterier, sopp og virusinfeksjoner [31]. En tidligere studie fremhevet involvering av TLR aktivering og TLR polymorfismer i mange sykdommer, slik som prostata cancer [32]. Derfor kan en reduksjon i funksjonen av TLR’ene være knyttet til en økt risiko for kreft. Det har nylig blitt vist at en polymorfisme i promotorsekvens av TLR2 og en TLR4 variant allel er involvert i
Helicobacter pylori product: (
H
.
pylori
) -associated mage kreft [33, 34] .I tillegg en polymorfisme i TLR10-TLR1-TLR6 clusteret er assosiert med økt risiko for prostatakreft [35], og funksjonell TLR4 uttrykk in vivo er kjent for å være ansvarlig for LPS-indusert trombocytopeni [36]. TLR-2 polymorfismer er også involvert i areduced respons etter utfordring med mykobakterier, whereasTLR4 polymorfismer er kjent for å være forbundet med en redusert respons på lipopolysakkarid og utvikling av magekreft [37, 38]. En TLR4 SNP (
rs11536898
) er også forbundet med tykktarmskreft [39] .Recently, et menneske TLR4 (Asp299Gly) SNP har blitt foreslått å være mer spesifikt knyttet LPS hypo-respons og en økt risiko for å utvikle prostatakreft blant en nord indiske befolkningen [40]. I tillegg TLR’ene er blitt demonstrert å spille en rolle i progresjon av polypper i tumorer, og redusert TLR4 ekspresjon har vært assosiert med økt metastasepotensialet av tykktarmskreft (CRC) [41, 42]. En syntetisk meta-analyse basert på data fra 22 studier bekreftet også foreningen av TLR4 SNP Asp299Gly med økt gastrointestinal kreftrisiko, men med redusert prostatakreft risiko [43]. Men en motstridende rapport av en multi-etnisk studie utført i Malaysia viste ingen sammenheng mellom en TLR4 polymorphism (Asp299Gly) og risiko for CRC [44]. Således er det klart at ytterligere studier er nødvendig for å validere disse funnene. Den aktuelle studien tar sikte på å behandle uttrykket av TLR4 i CRC og å undersøke potensialet implikasjon av fire SNPs av menneskelig TLR4 (
rs32770150
,
rs310759931
,
rs10759932and rs4986790
) med risiko for tykktarmskreft i Saudi Arabia befolkningen.
Resultater
Analyse av kliniske data parametere
totalt 115 tykktarm kreft-tilfeller og 102 friske kontroller ble inkludert i studien. De kliniske kjennetegn ved pasientene, inkludert alder, nasjonalitet, familiehistorie, røykevaner, og stadium av tykktarmskreft, ble samlet og sammenlignet med de av kontrollpasienter (tabell 1). Studiepopulasjonen alder varierte mellom 45 og 88years, med en gjennomsnittsalder på 56,04 ± 14,37 for tykktarm kreft tilfeller og 52,84 ± 15,88 for kontrollene. Det var ingen signifikant forskjell i gjennomsnittlig alder mellom de to gruppene. Den mann til kvinne ratio var ikke signifikant forskjellig i de tilfeller og kontroller (66/49 for pasienter og 60/42 for kontroller).
Økt TLR4 genuttrykk i tykktarm kreft vev sammenlignet med matchende normalt vev
De vevsprøver som brukes for RNA-analyse (n = 40 matching vev) ble umiddelbart lagret i RNA-senere-løsning. Etter RNA ekstraksjon, en kvantitativ real-time revers transkripsjon PCR ble utført for å sammenligne mRNA differensial uttrykk for TLR4. Som vist i figur 1A, ble TLR4 sterkt uttrykt (p 0,001), koloncancer vev sammenlignet med normale vev kolon (2,53 ± 0,32) og (1,01 ± 0,01) henholdsvis (figur 1A)
Total cellulær. RNA ekstrahert fra ferskt samsvarende normale og tykktarmskreft vev ble reverstranskribert inn i cDNA og deretter brukt til å måle den TLR4mRNA uttrykket (panel A). Vev ble immunostained med bestemte TLR4 antistoff (panel B).
For å bekrefte mRNA uttrykket data, vi bestemt TLR4 protein uttrykk ved immunhistokjemi. Som vist i (fig 1B), ble positive immunofarging for TLR4 generelt observert i kolon epitelceller og også i noen stromal avdelinger celler. Men intensiteten i farging var høyere i de adenokarsinom kolon tumorvev.
Sammenheng mellom TLR4 polymorfismer og mottakelighet for tykktarmskreft utvikling i Saudi Arabian pasienter
Fordelingen av alleler og genotyper og foreningen analysen er beskrevet i tabell 2. Alle SNP genotypet ble testet for Hardy-Weinberg likevekt (HWE). DNA-prøver fra blod av 115 pasienter og 102 friske kontroller ble genotypet for tilstedeværelse av fire TLR4 SNPs (
rs2770150
T /C,
rs10759931
A /G,
rs10759932
T /C og
rs4986790
A /G). De fenotypiske og genotypiske karakteristikker av pasientgruppen og kontrollgruppen er oppsummert i tabell 3.
All data for tre TLR4 SNPs,
rs2770150
,
rs10759932
og
rs4986790
, som ligger i promoter, viste ingen sammenheng med tykktarmskreft i Saudi befolkningen. Men for SNP
rs10759931
, noe som resulterer i Asp299Gly, fordelingen av alleler og genotyper var signifikant forskjellig mellom pasienter og kontroller. G allelet ble funnet å være betydelig mer svært hyppig blant pasientene (0,87) sammenlignet med kontrollgruppen (0,3). En homozygot GG av den samme SNP var også meget hyppig i pasientgruppen sammenlignet med kontrollgruppen (0,81
vs
. 0,1), og var sterkt assosiert med utvikling av tykktarmskreft blant Saudi befolkningen. Men tilstedeværelsen av allel A i tilfelle av heterozygoter og homozygot (AA) ser ut til å gi beskyttelse mot tykktarmskreft (OR 0,026; 95% CI 0,011 til 0,058; p ≤0.00001).
Association mellom genotypefrekvensene av TLR4 genet polymorfismer og kjønn
for å vurdere sammenhengen mellom tykktarmskreft risiko og individuelle SNPs basert på pasientens kjønn, ble genotypen fordelinger etter kjønn i tykktarmskreft gruppen sammenlignet med de av kontrollpersoner (tabellene 3 og 4). Interessant, i den kvinnelige gruppen (35 pasienter og 31 kontroller), T-allelen av SNP rs2770150 presentert en frekvens som var signifikant høyere hos pasienter enn i kontrollene (0,78 versus 0,6) (OR 2,38; 95% CI 1.2 til 4.8 og p = 0,012). Motsatt genotyper TC og CC var fire ganger mindre hyppig i de tilfeller sammenlignet med kontrollene (OR 0,14; 95% KI 0,04 til 0,48 og p = 0,0009). Allel (C) var signifikant svært hyppig blant kontrollene (0,40) sammenlignet med pasientgruppe (0,22) (p = 0,0002). Men fordelingen av CC genotype mellom berørte og uberørt kvinner var forskjellige (p = 0,019) (tabell 3). SNP
rs2770150
CC genotype ikke viste signifikant risiko hos kvinnelige pasienter etter søknad Bonferroni korreksjon. I kontrast, SNP
rs2770150
var ikke assosiert med tykktarmskreft hos menn (40 pasienter og 34 kontroller (tabell 4).
SNP
rs10759931
, som viste en høy assosiasjon med tykktarmskreft risiko i den generelle befolkningen, også presentert en signifikant sammenheng i den kvinnelige (46 pasienter og 38 kontroller) og mannlige (62 pasienter og 48 kontroller) undergrupper. Men genotyper GA og AA i den kvinnelige gruppen var hyppig i kontrollprøvene sammenlignet med tykktarmskreftpasienter (OR = 0,025 95% KI 0,007 til 0,090 og p 0,00001, tabell 3) Den samme observasjonen ble gjort på mannlige pasienter sammenlignet med friske menn. GA + AA var 0,2 og 0,87, henholdsvis (p 0,00001, tabell 4) for SNPs
rs10759932 Hotell og r
s4986790
, ingen signifikant forskjell i fordelingen av genotyper mellom berørte og ikke-rammede kvinner og menn. ble observert (p 0,05). (tabell 3 og 4)
Association mellom genotypefrekvensene av TLR4 genet polymorfismer og alder
Videre analyser av TLR4 genotype fordeling etter korrelasjon med alder avdekket at median debutalder for nåværende tykktarmskreft prøver er 56 år og i kontrollgruppene er 52 år. Å vurdere sammenhengen mellom TLR4 SNPs med en yngre alder ved diagnose av kreft i tykktarmen, stratifisert vi pasientene som ≤50 eller 50 år. Genotypen fordelingen for de enkelte SNPs sammen med den statistiske analysen er vist i tabell 5 og 6. Den T-allelet av SNP rs2770150 presentert en frekvens som var signifikant høyere hos pasienter over 50 år enn i kontrollene. Omvendt, C-allel var signifikant mindre hyppig i de tilfeller i forhold til kontrollene (0,24 versus 0,36) (OR 0,57; 95% CI 0,3 til 0,9 og p = 0,038) (Tabell 6), mens ingen forskjell ble observert for denne SNP for en undergruppe av pasienter som er yngre enn 50 (tabell 5). Men etter å ha påført Bonferroni korreksjon SNP rs2770150 CC genotype ikke viste signifikant risiko i 50 år gammel patients.rs10759931, som viste en signifikant sammenheng i den totale studie, også indikert en betydelig risiko i begge subpopulasjoner av pasienter (p 0,00001) (tabell 5 og 6). Det ble ikke observert noen signifikant forskjell i fordelingen av genotyper mellom berørte og ikke-berørte enkeltpersoner for både subpopulasjoner (p 0,05) for de to andre SNPs (
rs10759932 Hotell og
rs4986790
; Tables 5 og 6).
inflammatorisk Medfødt molekyler Response i forhold til tykktarmskreftutvikling
Formålet med denne studien var å evaluere forskjeller og sammenhenger mellom uttrykket av TLR4 og cytokiner, spesielt variasjoner i uttrykket av inflammatoriske cytokiner interleukin (IL1β1, IL6, IL-8 og IL-17. tilstedeværelsen av inflammatoriske celler og ekspresjonsnivåer av nøkkel cytokiner som er involvert i kreft i tykktarmen inflammasjonsprosessen ble kvantifisert ved hjelp av sanntids-revers transkriptase (RT) -PCR fra 40 tykktarmskreft vev og 40 normale samsvarende vev. mRNA av cytokiner var vesentlig høyere nivåer (10 til 22 gangers forskjell) i tykktarmskreft vev sammenlignet med normale tykktarm prøver, som vist i figur 2, noe som indikerer høyere pro-inflammatoriske responser i CRC prøver. Dette er på grunn av overekspresjon av TLR4 aktivitet i kolon kreftpasienter.
Cytokinproduksjon ble vurdert ved QRT-PCR på kolon kreft vev og samsvarende normale vev (gjennomsnitt ± SD, n = 40 pasienter, normalisert til data
GAPDH
, kontroll (åpne søyler), kreft (solid barer), * P 0,00 t-test)
Økt NF-kB p65 uttrykk i tykktarm kreft vev
for å bekrefte vår hypotese at den høyt nivå av TLR4 i kolon kreftpasienter som fører til induksjon av en inflammatorisk respons mediert av flere veier spesifikt NF-kB og induserer en akutt sekresjon av inflammatoriske cytokiner så som IL-6, en sammenlignende studie av NF-kB uttrykk ble utført ved immunhistokjemi på kreft kolon vev og normal matchende vev. Immunhistokjemi analyse viste at NF-kB p65 ekspresjon i colon cancer vev økt betydelig i forhold til normal tykktarm vev (figur 3) Våre resultater tyder på en avgjørende rolle av NF-kB som en signalmolekyl i inflammasjonsprosessen, noe som letter ekspresjon og sekresjon av proinflammatoriske cytokiner, som fører til en rekke betennelsesreaksjoner ved TLR4 aktivering.
Vev ble immunostained med bestemte NF-kB antistoff (p65) på 1/100 (n = 10).
Diskusjoner
Sammenhengen mellom betennelser og kreftutvikling ble først beskrevet for 10 år siden [45-47] .Siden da betennelsen har blitt rapportert å øke spredning og migrasjon /invasjon i ulike typer kreftceller [47 ], og koblingen mellom commensal mikroorganisme-indusert betennelser i slimhinnene har nylig blitt mistenkt som er knyttet til barnekonvensjonen. Omvendt er vår hypotese at TLR4 spiller en viktig rolle i det medfødte immunsystemet, og at forandring av den strukturelle funksjonen av dette protein, som til slutt hindrer immunovervåkning i kolon mukosa, kan føre til svulstutvikling [48]. Det er dokumentert at TLR4 aktivering fremmer karsinogenese og motstand mot kjemiske behandlinger ved brystkreft [49, 50], mens blokkering TLR4 aktivering kan bremse kreftvekst bryst og forlenge overlevelsen [2]. Derfor må vi først undersøkte sammenhengen mellom mottakelighet for å utvikle CRC i Saudi befolkningen og TLR4 uttrykk og TLR4 polymorfisme. Våre resultater viser at TLR4 er over-uttrykt i tykktarm kreft svulst epitelceller, som utgjør den første forsvarslinje mot utenlandske agenter. Videre vår analyse viste også at TLR4 uttrykk er betydelig økt i tykktarm tumorvev sammenlignet med tilsvarende normale kolon vev. Disse resultatene er i overensstemmelse med tidligere arbeid rapporten om over-ekspresjon av TLR4in forskjellige kreftformer, slik som magekreft progresjon [51], brystkreft [49, 50, 52], tykktarmskreft [52], og eggstokk-kreft [53]. Jo høyere nivå i TLR4 ekspresjon i tykktarmskreft vev sammenlignet med normale vev er hovedsakelig på grunn av infeksjoner av bakterier i den humane kolon, som forklarer en mulig opprinnelse av tykktarmskreft. Disse funn antyder at aktiveringen av TLR4 ekspresjon i kolon cancervev kan fremme tumorvekst og resistens mot apoptose, en konklusjon som er støttet av den tidligere undersøkelse som viser at blokkering av TLR4 aliserte forsinkelser tumorvekst og forlenger overlevelsen av dyr [41 , 54]. TLR4 signalering i kreft er ansett som et tveegget sverd: hvis TLR4 er aktivert på immunceller, kan det forbedre anti-tumor immunforsvar, og således TLR4 kan brukes som en markør for påvisning av en predisposisjon for kreft; men kronisk inflammasjon indusert av TLR4 aktivering er en viktig risikofaktor for utvikling av kreft [55] .TLR4 kan være en betydelig aktør i tykktarmskreft utvikling og nedskrivninger inTLR4 signalering in vivo blir tydelig gjennom tilstedeværelsen av enkelt-nukleotid polymorfismer (SNPs).
Dette er den første rapporten undersøker en mulig sammenslutning av flere commonTLR4 polymorfismer med tykktarmskreft i saudiarabere. Gitt den høyere frekvensen til
TLR4
G allel i CRC pasienter sammenlignet med friske kontroller, klare bevis er presentert for en ny forbindelse mellom TLR4
rs10759931
polymorfisme og mottakelighet for tykktarmskreft utvikling i Saudi- Arabian befolkningen.
TLR4
GG genotype er mest utbredt i Midtøsten, spesielt i Saudi Arabian befolkningen. Dette polymorfisme påvirker hele befolkningen uten å være spesifikk for begge kjønn eller aldersgruppe. AA genotype er vanligvis representert i andre populasjoner og er beskyttende mot kreft i tykktarmen og dermed GG genotype kan tjene som en genetisk markør for diagnostisering av tykktarmskreft i denne etniske befolkningen. I kontrast til
TLR4
polymorfisme
rs2770150
er assosiert med tykktarmskreft hos kvinner i aldersgruppen over 50 år og er nært knyttet til redusert nivå av kvinnelige kjønnshormoner i løpet av postmenopausal perioden. Tidligere studier har allerede beskrevne rollen til østrogen og progesteron i å beskytte mot koloncancer hos kvinner [56-59]. I denne forstand, undersøkte vi dette polymorfisme i pre- og postmenopausale kvinner til å bidra til å avklare dette fenomenet.
Den vanligste missense polymorfisme, D299G, som forekommer i ekson 4 av menneske TLR4 genet (A896G), ligger innenfor det ekstracellulære domene av reseptoren. X-ray strukturer av både villtype og mutert (D299G) reseptorer med LPS og MD-2 domener har blitt bestemt [60], som tydelig viser at dette polymorphism ikke påvirker dimerization men resulterer i en betydelig lokal konformasjonsendring på den D299G stedet [61]. Denne konformasjonsendring kan svekke ligandbinding og senke reseptorens signal respons på LPS, og svekket TLR4 signalering er blitt vist å interferere med rekruttering av MyD88 og TRIF [62], noe som ville føre til en deprimert immunrespons overfor en hvilken som helst kommensal bakterie aggresjon hos slimhinner celler. Dette polymorfisme sammen med TLR4rs2770150 viste ingen sammenheng med tykktarmskreft i denne etniske gruppen, selv om disse to SNPs viste en sterk sammenheng med prostatakreft [32] og magekreft [63] i andre studier og i andre populasjoner.
TLR4 Aktivering av ligander fører til cytokinproduksjon som fremmer en viktig rolle i patogenesen av samme kreft, spesielt i initiering og opprettholdelse av inflammasjon. Rollen til cytokiner, slik som IL-6 spiller viktige roller i med et bredt spekter av biologiske aktiviteter i immun hematopoies er regulering og onkogenese. De fleste av disse cytokiner er også blitt påvist i flere epiteliale tumorer [64], er involvert i proliferasjon og differensiering av forskjellige maligne tumorceller [65]. Overekspresjon av IL-6 er funnet i prostatakreft [66, 67], brystkreft [68] og muntlig plateepitelkarsinom [69].
Her viser vi forbedret uttrykk for TLR-4 på tykktarmskreft vev og dens rolle i den inflammatoriske pathways spesielt via NF-kB vei, en grunnleggende molekyl nav bindings betennelse og kreft. Hemme aktivering av NF-kB ved å blokkere MyD88 signal vil redusere utslipp av proinflammatoriske cytokiner, lindre den inflammatoriske respons og oppnå en terapeutisk effekt.
I sammendraget, gir vi linker mellom TLR4 genekspresjon og TLR4 polymorfismer, som er en hypotese som viktig for kreftfremkallende prosessen med tykktarmskreft i Saudi Arabia befolkningen. Våre data tyder på at genetisk variasjon i TLR4 kan påvirke utviklingen av tykktarmskreft. Replication av disse funnene er hjemlet gitt biologisk plausibilitet av foreningen og samspillet med kosthold og livsstilsfaktorer som kan endre disse genetiske effekter. Videre tror vi at vår studie gir et viktig mekanistisk kobling som kan være utgangspunkt for videre studier, og viktige SNPs i denne gener kan muligens tjene som biomarkører for beslutninger i tykktarm kreft behandling.
Materialer og Metoder
studie~~POS=TRUNC populasjoner og prøvetaking
totalt 115 tykktarm kreft-tilfeller og 102 friske kontroller ble inkludert i denne studien, som ble godkjent av den lokale Institutional Review board. Prøvene ble rekruttert fra King Khalid universitetssykehus i Riyadh, Saudi Arabia. All spørreskjema data og (vev og blodprøver ble samlet) ved den innledende rekruttering av begge tilfellene og kontroller. Deltakerne ble bedt om å fylle ut et selvadministrert spørreskjema om deres sosio-demografiske karakteristika (for eksempel alder, familiehistorie med kreft), livsstil (f.eks, røykevaner og alkoholinntak), og personlig medisinsk historie. Sakene og kontroller ble frekvens-matchet etter alder og kjønn. De kliniske kjennetegn ved pasientene, herunder alder for valg av Saudi befolkningen (ikke-saudiske statsborger personer ble ekskludert), familiehistorie, røykevaner, stadium av tykktarmskreft, medisiner og tilstedeværelse av andre sykdommer ble samlet og sammenlignet. Studiepopulasjonen alder varierte mellom 45 og 88years, med en gjennomsnittsalder på 57,04 ± 14,37 for tykktarm kreft tilfeller og 56,51 ± 15,70 for kontrollene (tabell 1). Vevsprøvene ble anvendt for RNA-ekstraksjon. Blodprøvene ble lagret i EDTA-rør ved -80 ° C og brukt til genomisk DNA-ekstraksjon.
Generelle reagenser
DNA /primere og SNP ble erholdt fra Life Technologies /Invitrogen (Burlington, ON , Canada). Anti-TLR4 antistoffer ble innkjøpt fra Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA, USA) .RNA senere for RNA stabilisering ble innhentet fra Ambion /Life Technologies (Burlington, ON, Canada). RNA kits var fra Qiagen (Hilden, Tyskland). De høykapasitets cDNA revers transkripsjon kit var fra Applied Biosystems (Warrington, USA). SYBR Green ble hentet fra Bio-Rad (Mississauga, ON, Canada).
DNA-ekstraksjon
Genomisk DNA ble ekstrahert fra fullblod med QIAmp kit (QIAmp DNA Blood Mini Kit, Qiagen, Valencia, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. I korte trekk ble 200 til 300 ul blod som er lagret i EDTA-rør ved -80 ° C i likevekt ved romtemperatur, blandet med protease og lyseringsbuffer og inkubert ved 56 ° C i 10 minutter. Deretter ble 100% etanol tilsatt, og blandingen ble ført gjennom kolonnen ved hjelp av sentrifugering. Kolonnen Membranen ble vasket, og DNA ble eluert with100 ul elueringsbuffer (AE). Konsentrasjonen av ekstrahert DNA ble bestemt ved hjelp av en Nano-Drop8000spectrophotometer (Thermo Scientific) sikret renhet av DNA ble evaluert av standard A260 /A280 og A260 /A230-forhold.
Total RNA isolering
Total vev RNA ble isolert ved hjelp av DNA /RNA Mini kit (Qiagen, Hilden, Tyskland), som beskrevet av Alanazi et al [70]. I korthet vev ble lysert i 350 μllysis buffer med 3,5 ul β-merkaptoetanol. Lysatet ble deretter filtrert og homogenisert med 70% etanol, og DNA ble applisert på kolonnen, og spaltet med DNase ved romtemperatur i 30 minutter. Deretter ble kolonnen vasket membranen, og RNA ble eluert med 40 pl RNase-fritt H
2O og lagret i nuklease-fri prøverør ved -80 ° C. Konsentrasjonen, renhet og kvalitet av den isolerte RNA ble bestemt ved bruk av Agilent 2100 Bio analysesystem og Agilent små RNA-analyse kit henhold til instruksjonene fra produsenten (Agilent Technologies, Waldbronn, Tyskland).
cDNA syntese
Som beskrevet av Semlali et al [71, 72], 1 ug RNA hver prøve ble revers transkribert til cDNA ved hjelp av en høy kapasitet cDNA revers transkripsjon kit (Applied Biosystems, Warrington, USA) .De vilkår for fremstilling av cDNA-templater for PCR-analyse var 10 min ved 25 ° C, 2 timer ved 37 ° C og 5 minutter ved 85 ° C. Det syntetiserte cDNA ble lagret ved -20 ° C eller 4 ° C for etterfølgende PCR-reaksjoner.
Kvantitativ real-time PCR
TLR4 mRNA-ekspresjon ble påvist ved RT-qPCR som tidligere beskrevet [71 , 72]. Ekspresjonen av huset bevarende genet GAPDH ble anvendt som en endogen kontroll for å normalisere den mengden av prøve RNA. Reaksjonene ble utført ved å bruke en PCR-SYBR grønn Supermix fra Applied Biosystems. Sekvensene av TLR4, cytokiner og GAPDH primere er vist i S1 tabell.
Real-time PCR ble utført ved hjelp a7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Primerne ble tilsatt til reaksjonsblandingen ved en sluttkonsentrasjon på 250 nM. Som tidligere beskrevet [72], 5μlof hver cDNA-prøve ble tilsatt til en 20-pl PCR-blanding inneholdende 12,5 pl av SYBR grønn Supermix, 0,5 mL av spesifikke primere og 7 ul av RNase- /DNase-fri vann. PCR-reaksjonen besto av med 50 ° C i 2 minutter og 95 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 sekunder, 62 ° Cfor30 minutter og 30 sekunder ved 72 ° C. Alle sanntid PCR-analyser ble utført i tre eksemplarer, og spesifisiteten av hvert primer-par ble bekreftet ved nærværet av et enkelt smeltetemperatur topp. GAPDH produsert ensartede uttrykk nivåer som varierer med mindre enn 0,5 CTs mellom prøvebetingelser, og ble derfor brukt som en referanse gen for denne studien. De amplifiserte produktene ble separert på en agarosegel for å bekrefte at det ikke var noen uønskede produkter forsterket. Resultatene ble analysert ved hjelp av 2
-ΔΔCt (Livak) relative uttrykk metode.
Immunohistochemistry (IHC) analyse
parafininnstøpte blokker av tykktarmskreft og prøver normale tykktarm vev ble kuttet i 3-mikrometer tykke seksjoner. Disse ble montert på saltvann-belagte objektglass og inkubert i 15 til 20 minutter i en varm luft ovn ved 60 ° C. Vevssnitt ble deparaffinized med EZ Prep (Ventana, Arizona, USA) ved 75 ° C, varme forbehandlet i Cell Conditioning 1 (CC1, Ventana, Arizona, USA) ved hjelp av en «standard celle condition» protokoll for antigen gjenfinning ved 100 ° C, og deretter inkubert med en dråpe av inhibitor-løsning i fire minutter ved 37 ° C. Platene ble deretter vasket og inkubert i 32 minutter ved 37 ° C med anti TLR4 og anti NF-kB (fortynnet 1: 100, Santa Cruz Biotechnology, California, USA) primære antistoffet og etterfulgt av en inkubasjon med det sekundære antistoff Ultra universell HRP-multimer . De immunolocalized TLR4 proteiner ble visualisert ved hjelp av en kobber-forbedret DAB reaksjon.
