Abstract
Avvikende glykolyseringsmetoder endringer normale cellefunksjoner, og representerer et spesifikt kjennetegn på kreft. Lewis
y (Le
y) karbohydrat oppregulering har blitt rapportert i en rekke kreftformer, herunder muntlig plateepitelkarsinom (OSCC). Et høyt nivå av Le
y uttrykk er relatert til dårlig prognose for pasienter med kreft i munnhulen. Det er imidlertid uklart hvordan Le
y formidler oral cancer progresjon. I denne studien ble rollen som Le
yi OSCC utforsket. Våre data viser at Le
y ble oppregulert i HSC-3 og OC-2 OSCC cellelinjer. Spesielt glykosylering av epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR) med Le
y ble funnet i OC-2-celler, og denne modifikasjon var fraværende ved inhibering av Le
y-syntese. Fraværet av Le
y glykosylering av EGFR svekket fosforylering av AKT og ERK i respons til epidermal vekstfaktor (EGF). I tillegg ble EGF-utløst cellemigrasjon redusert, men celleproliferasjon ble ikke påvirket. Le
y modifikasjon stabilisert EGFR på ligandaktivering. Motsatt, fravær av Le
y glykosylering akselerert EGFR degradering. Oppsummert indikerer disse resultatene at økt ekspresjon av Le
y i OSCC-celler er i stand til å fremme cellemigrasjon ved å modifisere EGFR som igjen stabiliserer EGFR-ekspresjon og nedstrøms signalisering. Målrette Le
y på EGFR kan ha en potensiell terapeutisk effekt på kreft i munnhulen
Citation. Lin WL, Lin YS, Shi GY, Chang CF, Wu HL (2015) Lewis
y Fremmer Migration av oral cancer celler ved glykosylering av epidermal vekstfaktor reseptor. PLoS ONE 10 (3): e0120162. doi: 10,1371 /journal.pone.0120162
Academic Redaktør: Karl X. Chai, University of Central Florida, USA
mottatt: 13 oktober 2014; Godkjent: 23 januar 2015; Publisert: 23 mars 2015
Copyright: © 2015 Lin et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Science Council, Taiwan [(NSC 99-2320-B-006-008-My3 (mottatt av HLW), NSC 99 -2628-B-006-003-My3 (mottatt av GYS), og NSC 100-2325-B-006-003-My3 (mottatt av GYS)] (URL: https://www.most.gov.tw/.) de organer hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
oral kreft er en type hode og nakke kreft som kan oppstå fra alle deler av munnhulen. Tobacco [1] og alkohol [2] bruk er de viktigste risikofaktorene for kreft i munnhulen, som er en ledende dødsårsaken blant middelaldrende mennesker. Oral cancer kan være herdbar med tidlig diagnose og behandling; imidlertid er overlevelse redusert i de avanserte-stadier. [3] Avhengig av opprinnelses vev, er det flere typer av oral cancer. Oral squamous cell carcinoma (OSCC), som forekommer i slimhinnen slimhinnene i munn og lepper, er den vanligste og er blitt en epidemiologisk problem over hele verden. [4]
tumorprogresjon er ofte forbundet med atypisk glykosylering av celleoverflateproteiner. [5] Lewis
y (Le
y, Fucα1-2Galβ1-4 (Fucα1-3) GlcNAcβ1-R) er en difucosylated oligosakkarid som har blitt funnet å være overuttrykt i mange tumorer, spesielt i epithelium- avledet kreft. [6] Dessuten er Le
y uttrykk forbundet med klinisk stadium og progresjon av svulster. [7,8] Den oppregulering av Le
y i tumorer fremmer celle adhesjon [9,10], spredning [11,12], migrasjon [13], og motstand mot cellegift. [13-15] Hemming av Le
y med antistoffer [13,16] eller undertrykkelse av Le
y syntese kan effektivt å inhibere vekst og migrering av tumorceller. [17] rikelig ekspresjon av Le
y forløper i utvekst av epitel ble funnet i human oral mucosa sammen med en tre-dagers sår [18], hvor den økede ekspresjon av Le
y forløper er relatert til økt cellemotilitet. I tillegg økte Le
y uttrykk er signifikant relatert til dårlig prognose i orale kreftpasienter. [19] Men funksjonen av Le
y i munnhulekreft er ikke helt forstått.
epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), et medlem av ErbB familien, regulerer mange cellulære funksjoner gjennom aktivering og fosforylering av sin iboende tyrosinkinase-domene og nedstrøms signaliseringsmolekyler. [20] EGFR overekspresjon er blitt observert i munnhulen [21], hvor det kan fremme kreft progresjon. Derfor er EGFR foreslått å være et mål for anticancerterapi i munnhulen. [22] Videre er glykosylering av EGFR essensiell for de normale funksjoner, slik som ligandbindende, dimerisering, signaltransduksjon, og intern-resirkuleringsveien. [23] Le
y glykosylering av EGFR har blitt funnet å modulere funksjonen til EGFR. [12,16,24] Men om uttrykket av Le
y i munnhulekreft ville regulere EGFR funksjoner ved glykosylering er ukjent. Dermed Hensikten med studien var å undersøke den funksjonelle rollen som Le
y og foreningen av Le
y med EGFR i oral cancer. Heri, viser vi at Le
y modifisering av EGFR stabiliserer EGFR uttrykk og nedstrøms signalering og fremmer migrasjon i OSCC celler. Våre resultater gir innsikt i hvordan Le
y glykosylering manipulerer EGFR-signalering i kreft i munnhulen, og tyder på at Le
y er en potensielt viktig biomarkør og behandling mål i Le
y-overekspresjon oral cancer.
Materialer og metoder
Cell Culture
Tre menneske OSCC cellelinjer, OC-2, OEC-M1, og HSC-3, og ett udødelig menneskelig gingiva keratinocytter, SG, ble brukt i denne studien. Alle disse cellene ble vennlig levert av professor Dar-Bin Shieh og Yuh-Ling Chen (National Cheng Kung University). OC-2, som er utledet fra en primær svulst i munnslimhinnen av en kinesisk mann med en historie med røyking og betel-nøtt å tygge [25], og OEC-M1, som er utledet fra en primær svulst i gingiva av en voksen mann OSCC pasient fra Taiwan med en historie med betel-pund tygging [26], ble dyrket i RPMI 1640. HSC-3, som er avledet fra humane tunge karsinom med lymfeknutemetastase [27], ble dyrket i MEM. SG, en immortalisert human gingivale epitel cellelinje avledet fra klinisk normal voksen human gingiva, ble dyrket i DMEM. Alle dyrkningsmedium (GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA) ble supplert med 10% (v /v) føtalt bovint serum (FBS, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 2 mmol /L L -glutamine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 500 U /ml penicillin og 100 mikrogram /ml streptomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Celler ble dyrket i en fuktet inkubator ved 37 ° C med 5% CO
2.
Western blotting
celler ble vasket med iskald fosfatbufret saltløsning (PBS) tre ganger og behandlet med cellelyseringsbuffer (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Total proteinkonsentrasjon av cellelysat ble kvantifisert ved anvendelse av en syre bicinchoninic proteinanalyse. Prøvene ble likt lastet og underkastet elektroforese. Etter elektroforese ble SDS-PAGE-gel blottet på en nitrocellulosemembran (Millipore Merck, Darmstadt, Tyskland) og inkubert med primære antistoffer, som ble detektert ved bruk av peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer. Signaler ble visualisert ved hjelp av forbedret chemiluminescence.
Kvantitativ Real-Time PCR
Totalt celle RNA ble ekstrahert ved hjelp av en Total RNA mini utvinning kit (RBC Bioscience, Taiwan) i henhold til produsentens instruksjoner. To mikrogram isolert RNA ble revers-transkribert til cDNA. Reaksjonene for real-time PCR ble utført ved bruk av en ABI 7500-sekvens deteksjonssystem (Life Technologies, Grand Island, NY, USA), som beskrevet tidligere. [28] Det relative mRNA-ekspresjon nivået ble beregnet ved hjelp av to
-ΔCT metode. [29] glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (
GAPDH
) ble anvendt som referanse-genet. Grunning sekvenser er oppført i Tabell 1.
Lentiviral Levering av Short hårnål RNA
Alle lentiviral vektorer og viral leveringssystemet ble etablert av og hentet fra National RNAi Kjerne Facility (Academia Sinica, Taipei, Taiwan). I korte trekk, ble rekombinante lentiviruses produsert ved kotransfeksjon av HEK293T celler med pMD.G, pCMVΔR8.91, og pLKO.1-puro vektorer som inneholder respektive kort hårnål RNA. Til knockdown av fucosyltransferase 1 (FUT1) uttrykk, FUT1 spesifikke kort hårnål RNA (shFUT1) med targeting sekvensen av 5′-ACTTGAGAGATCCTTT-3 «ble brukt. Luciferase-spesifikk kort hårnål RNA (shLuc) med den målsøkende sekvensen av 5»-TCACAGAATCGTCGTATGCAG-3 «ble anvendt som en negativ kontroll. De rekombinante virusinneholdende medium ble høstet 24- og 48-timer etter transfeksjon, og den virusmengde ble titrert ved infisering av A549-celler med seriefortynninger. For infeksjon, OC-2-celler ble sådd og dyrket i 24 timer, etterfulgt av erstatning av kulturmediet med det rekombinante virus inneholdende medium (multiplisitet for infeksjon på 10) og dyrking over natten. Infiserte celler ble valgt ved hjelp av puromycin (2 ug /ml) og klargjort for videre forsøk.
Immunoutfelling
Totale cellelysater (500 ug) ble inkubert med primære antistoffer (1 pg) ved 4 ° C i 8-12 timer, etterfulgt av utfelling med protein-G-agarosekuler (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ved 4 ° C i 4 timer. Etter vasking, ble bunnfallet separert ved SDS-PAGE og overført på nitrocellulosemembraner. Membranene ble blokkert ved hjelp av 5% melk i PBS /0,01% Tween 20 og utslettet med relevante antistoffer.
Analyse av AKT og ERK Fosforylering
Celler ble sultet i 24 timer og behandlet med EGF (ProSpec, Ness-Ziona, Israel) under de angitte betingelser. Cellelysater var forberedt på Western blotting for fosforylert AKT (klone sc-7985-R, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) eller fosforylert ERK (klone sc-7383, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA).
Cell Proliferation Assay
Celler (3 x 10
3 /brønn) ble sådd ut i medium inneholdende 2% FBS på en 96-brønns plate og dyrket i 24 timer. Deretter ble cellene behandlet med EGF som indikert ved 37 ° C, etterfulgt av inkubasjon med WST-1 reagens (Roche, Indianapolis, IN, USA). Etter 2 timers inkubering, ble celleproliferasjon bestemt ved å måle absorbansen ved 450 nm.
Scratch sårheling Assay
Celler (2 x 10
6 /brønn) ble sådd ut på en 6-brønns plate og dyrket til konfluens i medium inneholdende 10% FBS. En ripe ble introdusert til konfluent celle ark med en 200-mL pipette tips. Etter vasking med PBS, ble cellene behandlet med EGF under de angitte betingelser, og tillatt å migrere i 10 timer. Migrasjon av celler ble registrert hvert 30 min med time-lapse mikroskopi.
Utarbeidelse av cellemembranen Proteiner
EGF-behandlede celler ble høstet i homogenisering buffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,5 ), 2 mM EDTA (pH 8,0), 5 mM EGTA (pH 8,0), 10% glycerol, og protease-inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)] og lysert på is ved hjelp av en ultralydhomogenisator. Celleavfall ble fjernet ved sentrifugering (2500 x
g
, 10 min). Supernatanten ble oppsamlet og sentrifugert ved 15.000 x
g
i 30 minutter. Pelleten ble oppsamlet og suspendert i 100 ul av homogeniseringsbuffer inneholdende 1% NP-40. Proteinkonsentrasjonen ble kvantifisert ved hjelp bicinchoninic syre protein assay.
EGF bindingsanalyse
Celler ble inkubert med serumfritt medium som inneholder Alexa Fluor 488 konjugert EGF (Molecular Probes, Grand Island, NY, USA ) i 1 time ved 4 ° C for å forhindre EGF /EGFR-komplekset internalisering. Etter vasking med iskald PBS, ble cellene høstet i celledissosiasjon buffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ved forsiktig å skrape på is. Celler ble deretter fiksert i 4% formaldehyd i 15 minutter, og den overflatebundet Alexa Fluor 488 konjugerte EGF ble analysert ved hjelp av FACS Calibur (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). Fluorescens intensitet ble analysert ved hjelp FlowJo programvare (FlowJo LLC, Inc., Ashland, OR, USA). For å bestemme spesifisiteten EGF-binding, ble en 10 x konsentrasjon av umerket EGF tilsatt for å konkurrere med merket EGF.
EGFR Dimerisasjon Assay
Cellene ble sultet med serumfritt medium i 24 timer og behandlet med EGF i 1,5 min. Etter vasking med iskald PBS, ble 3 ml av BS3 forbindelse (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) tilsatt og inkubert med cellene på is i 2 timer for å tverrbinde med EGFR. Reaksjonen ble stoppet ved RT i 15 min ved behandling med Tris-HCl (50 mM, pH 7,5). Etter vasking med iskald PBS, ble cellene høstet og lysert for western blotting for EGFR. Den dimeriserte EGFR viste en omtrentlig molekylvekt på 340 kDa.
statistikker
Data er representert som gjennomsnitt ± SEM. Statistisk signifikans mellom to grupper ble analysert ved hjelp av en uparet Student
t
-test. Sammenligning av gruppe på tre eller flere ble gjort ved hjelp av enveis ANOVA med en post test av Tukey korreksjon. En P-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Le
y Expression i Human OSCC cellelinjer
Vi bestemte uttrykk for Le
y syntese enzymer, FUT1 , 2, 4 og [30], i tre humane OSCC cellelinjer, HSC-3, OC-2, og OEC-M1, og en udødeliggjorte humane keratinocyter gingivale, SG, ved hjelp av sanntids-PCR. Resultatene viste at mRNA-nivået av FUTs var høyere i HSC-3 og OC-2 enn i OEC-M1 og SG-celler (Fig. 1A). I tillegg Le
y-ekspresjon ble undersøkt ved Western blotting, og den mest rikelig ekspresjonsnivået av Le
y ble observert i OC-2-cellelinje (Fig. 1B).
(A) Analyse av FUT1, FUT2, og FUT4 mRNA uttrykk i fire muntlige cellelinjer som bestemmes ved hjelp av real-time PCR. Den relative overflod av transkripsjoner ble oppnådd ved normalisering til GAPDH. Data representerer gjennomsnittet ± SEM (n = 3). Den relative overflod er vist på y-aksen var 100 ganger resultatene. n.s .: ikke signifikant, #
P
0,05 og
P
0.001 sammenlignet med HSC-3. *
P
0.05, *
P
0,01 og ***
P
0,001. (B) Representant Western blot av Le
y og α-tubulin i fire muntlige cellelinjer.
Le
y er glykosylert av EGFR i OC-2 celler
Overuttrykte av EGFR i OSCC pasienter har blitt rapportert. [21] Tilsvarende, i den foreliggende studie har vi funnet at OSCC cellelinjer, HSC-3 og OC-2, viste høyere EGFR-ekspresjon enn de to andre orale cellelinjer (Fig. 2A). For ytterligere å undersøke om Le
y kan glykosylert av EGFR, vi utførte immunoprecipitation i HSC-3 og OC-2 celler. Som vist på fig. 2B, Le
y ble uttrykt på EGFR i OC-2-celler, men ikke i HSC-3. Vi undertrykt Le
y uttrykk ved hjelp shRNA uttømming av FUT1, som er nøkkelen enzym for Le
y syntese i OC-2 celler. Etter transduksjon med lentiviral shRNA vektorer, ble uttrykket nivået av Le
y og ombygging av EGFR vellykket trykt. Det var ingen endringer i Le
y og modifikasjons av EGFR kontroll (shLuc) transduced celler (Fig. 2C, D).
(A) Representant Western blot av EGFR og α-tubulin i fire p-cellelinjer. (B) Total cellelysater ble anvendt for immunopresipitering (IP) med anti-EGFR og isotypekontrollantistoffer og immunoblottet (IB) ved anvendelse av anti-Le
y og anti-EGFR-antistoffer. (C) Representant Western blot av Le
y og α-tubulin i OC-2 celler transduced med FUT1 (shFUT1) og kontroll shRNA (shLuc). (D) Totale cellelysater fremstilt fra OC-2-celler med FUT1 (shFUT1) og styre shRNA (shLuc) transduksjon ble anvendt for immunopresipitering (IP) med anti-EGFR og isotype kontroll-antistoff, etterfulgt av immunoblotting (IB) med anti-Le
y og anti-EGFR-antistoffer.
EGF-indusert fosforylering og migrasjon dempes ved bekjempelse av Le
y Expression
for å karakterisere virkningene av EGFR-aktivering i OC-2-celler, stimulert vi cellene med EGF og analysert fosforyleringen av nedstrøms signalmolekyler AKT og ERK. Dataene viste at AKT og ERK ble fosforylert av EGF stimulering på en tidsavhengig måte (fig. 3A), mens forbehandling med tyrosin kinase inhibitor, AG1478, doseavhengig redusert signaloverføring (fig. 3B). Deretter utførte vi spredning og migrasjon analyser for å undersøke funksjoner av EGFR i OC-2 celler. Resultatene viste at det var ingen åpenbare forskjeller i spredning av EGF-behandlede OC-2-celler sammenlignet med det i kontrollgruppen (S1A fig.). På samme måte, forbehandling med AG1478 hadde ingen signifikant effekt på celleformering (S1B fig.). I motsetning til dette ble cellemigrasjon forsterket av EGF stimulering, som ble inhibert med AG1478 (Fig. 3C). Disse observasjonene indikerer at overekspresjon av EGFR i OC-2 celler kan øke cellemigrering.
(A) Celler ble stimulert med EGF for den angitte varighet, og de totale cellelysatene ble benyttet for Western blotting ved å bruke de angitte antistoffer. (B) Celler ble stimulert med (+) eller uten (-) EGF i 5 minutter i nærvær av forskjellige doser av AG1478 (EGFR-inhibitor), og de totale cellelysatene ble benyttet for Western blotting ved å bruke de angitte antistoffer. (C) Etter preinkubering av forskjellige doseringer av AG1478 (EGFR inhibitor) i 30 minutter, ble cellene såret og stimulert med EGF. Fremdriften av cellemigrasjon ble registrert ved hjelp av time-lapse mikroskopi, og andelen for sårheling ble beregnet. Representative bilder demonstrere sårheling med EGF og EGFR-hemmer behandling som angitt. Kvantitative data er vist. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM (n = 3). *
P
0,05 og ***
P
0,001 versus EGF bare. #
P
0,001.
glykosylering fører til konformasjonsendring endring, noe som er avgjørende for aktiviteten til EGFR. [23] Vi har fastslått at virkningene av Le
y modifikasjon på funksjonen av EGFR i OC-2-celler ved behandling av kontroll og FUT1 knockdown OC-2-celler med serie ganger eller flere doser med EGF, og analysering av fosforylering av AKT og ERK. Dataene viste at 5 min fra EGF stimulering i kontrollceller resulterte i ~80% og -50% økning i Pakt og perk nivåer, henholdsvis. Den samme behandlingen resulterte i 50% og 10% økning i pakt og ekstra fordel nivåer i FUT1 knockdown-celler, henholdsvis (fig. 4a). Tilsvarende gjennomsnitts fold endringer av Pakt og perk nivåene var lavere i knockdown celler enn i kontroll (~ 20% versus -60% økning i Pakt og ~ 30% versus ~150% økning i perk) på den ultimate dose av EGF (Fig . 4B). Dessuten ble EGF-mediert cellemigrering ble redusert i Le
y-manglende celler (Fig. 4C), mens celleproliferasjon viste ingen signifikant forskjell sammenlignet med den i kontrollcellene (fig. 4D). Derfor, Le
y kan være involvert i EGFR-mediert signaltransduksjon og cellemigrasjon.
Celler ble stimulert med EGF for de angitte varigheter (A) eller med forskjellige doser av EGF i 1,5 min (B) . Totale cellelysater ble anvendt for Western blotting ved å bruke de angitte antistoffer. Western blot fra tre uavhengige eksperimenter ble analysert ved densitometri. De angitte brette endringene representerer tetthet i forhold til kontroll (-). (C) Etter preinkubering av AG1478 (EGFR inhibitor) i 30 minutter, ble hver cellene såret og stimulert med EGF. Forløpet av cellemigrering ble registrert ved hjelp av time-lapse mikroskopi, og det område for sårheling ble beregnet. Representative bilder demonstrere sårheling med EGF og EGFR-hemmer behandling som angitt. Kvantitative data er vist. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM (n = 3). *
P
0,05, **
P
0,01 og ***
P
0,001. (D) OC-2-celler transdusert med shLuc eller shFUT1 ble stimulert med EGF i nærvær eller fravær av AG1478 (EGFR-inhibitor), og cellevekst ble analysert hver 24 timer under anvendelse av WST-1 reagens. Data representerer gjennomsnitt ± SEM (n = 3).
Le
y glykosylering Stabiliserer EGFR Expression, men har ingen effekt på ligandbindende og EGFR Dimerisasjon
For ytterligere å undersøke Slik Le
y modifikasjon påvirket av aktiviteten av EGFR, ligandbinding og dimerisering av EGFR ved aktivering ble testet. Verken hendelser ble endret av FUT1 knockdown (S2 fig.). Etter EGF-EGFR-binding, gjennomgår kompleks internalisering og degradering. [31] Denne prosessen fører til klarering av de aktiverte reseptorer fra celleoverflaten, for derved å terminere signaltransduksjon. Således, ved utspurt vi hvorvidt knockdown av FUT1 vil påvirke degradering av komplekset. Etter EGF behandling, ble EGFR stabilt uttrykt i 120 minutter i kontrollceller. I celler transdusert med shFUT1, ble nivåene av total og overflate EGFR betydelig redusert på samme tidspunkt (Fig. 5). Dette tyder på at ekspresjon av Le
y i OC-2-celler modifisert EGFR å opprettholde sin aktivitet, som fører til forbedret cellemigrering.
Etter 24 timer av serum-sult,-celler ble behandlet med 40 ng /ml EGF i de angitte varigheter, og totale cellelysatene (A) eller cellemembranfraksjoner (B) ble anvendt for Western blotting ved anvendelse av anti-EGFR-antistoff.
diskusjon
Forhøyede Le
y uttrykk har blitt rapportert i mange typer svulster, og det har vært forbundet med aggressivitet av kreftceller. I denne studien, viste vi at Le
y er sterkt uttrykt i HSC-3 og OC-2 OSCC cellelinjer (Fig. 1). Le
y modifikasjon er gjennomført av EGFR i OC-2 celler (Fig. 2B). For å undersøke hvilken rolle Le
y glykosylering i EGFR-medierte funksjoner og korrelasjonen med tumor malignitet, OC-2 celler med FUT1 knockdown ble produsert for analyser av signaloverføring, celleproliferasjon og migrasjon. Våre resultater viste at EGFR-aktivering fremmer cellemigrering, men ikke proliferasjon, i OC-2-celler (Fig. 3), i hvilken Le
y er nødvendig for vedlikehold av EGFR funksjonene. Tap av Le
y demper fosforylering av AKT og ERK i nedstrøms EGFR-signalveien og resulterer i reduksjon av cellevandring (Fig. 4). Vi ytterligere belyst at Le
y kan stabilisere EGFR uttrykk (Fig. 5). Dette funnet innebærer at overekspresjon av Le
y er assosiert med malignitet ved å endre EGFR, og dermed styrke kreft celle migrasjon.
Overuttrykte EGFR er oppdaget i ulike svulster og utvidet aktivering av EGFR utløser flere cellulære effekter som fremmer tumorprogresjon. [32] Le
y-regulert EGFR signalveien har blitt vist i andre typer kreft, inkludert kreft i eggstokkene [12], brystkreft [16,24], og epidermoid carcinoma. Ved manipulering av ekspresjon og aktivitet av Le
y, disse studiene beskrevet at modifiseringen av Le
y i EGFR forsterker aktiveringen av nedstrøms signaler for å formidle celle-proliferasjon. I denne studien fant vi at Le
y ble glykosylert av EGFR i OC-2 celler, og det modulert AKT og ERK signalveier for å lette cellemigrasjon. Dette funnet gir et annet bevis som støtter den pro-tumor rollen som Le
y. Spesielt, Le
y ikke kan være i stand til å kontrollere veksten av OC-2-celler via regulerings EGFR, siden vi har funnet at spredning av OC-2-celler ikke ble forandret som respons på EGF eller AG1478 behandling. Tidligere studier viser at den endogene fosforylering av aurora kinaser, som er mitose regulatorer, er oppdaget i OC-2 celler. [33] Det tyder på at OC-2-celler er i stand til å øke celle-syklusprogresjon i fravær av ytterligere vekstfaktorbehandling, og som kan forklare hvorfor EGF ikke utløste høyere celleproliferasjon sammenlignet med den til kontrollbehandling.
ved EGF binding til EGFR, er endocytoseveien aktivert for å nedregulere EGFR uttrykk gjennom nedbrytning eller resirkulering. [31] Antistoffer direkte mot Le
y er blitt karakterisert til å ha hemmende effekt på ErbB1 (EGFR) og ErbB2 signalveier gjennom påvirker den intracellulære ruting av ErbB-reseptorer, men ikke ved lertid EGF-binding til reseptorene. [16] Her viste vi at mengden av EGFR-ekspresjon som reaksjon på EGF ble redusert i fravær av Le
y modifikasjon. Disse observasjonene tyder på at Le
y struktur på EGFR opprettholder i hovedsak reseptoren stabilitet ved aktivering, og om Le
y ville vise den tilsvarende funksjon på andre kinase reseptorer bør utredes videre.
HSC-3 celler er hentet fra metastatisk tungen kreft vev og anses som meget inngripende. [27] Men til tross for den foreslåtte teorien om at Le
y ville korrelerer positivt med malignitet av kreft i munnhulen, HSC-tre uttrykte mindre Le
y enn OC-2 celler, og EGFR ble ikke endret med Le
y i disse celler. I tillegg var nivået av FUT2 var høyere i HSC-3 enn i andre orale celler, mens OC-2 uttrykte den mest FUT1 av alle cellelinjene som ble testet. Variansen til Le
y og FUT uttrykk observert her tyder på at det er aner glykolyseringsmetoder profiler blant typer OSCC. Denne observasjonen krever videre bekreftelse av stor-skala analyse. Som nevnt tidligere, Le
y korrelerer signifikant med dårlig prognose i orale kreftpasienter. Her har vi videre identifisert at Le
y uttrykk er celletype avhengig. Således, Le
y kan tjene som en markør glykan anvendelse for diagnose og behandling
Anti-EGFR-terapi er blitt en standard strategi for kreftterapi.; Det er imidlertid noen bivirkninger forårsaket av anti-EGFR-midler på grunn av skade på EGFR som uttrykker normale vev. [34] Motsatt Le
y er ofte overuttrykt på epitel-avledet kreft [6] med begrenset eller ingen uttrykk hos voksne friskt vev. [35] Derfor Le
y kan være et alternativ mål å avskaffe EGFR funksjon i tumorvev spesielt. Viktigst, ble ingen signifikante bivirkninger observert i studier med anti-Le
y antistoff behandling. [36]
Samlet utgjør disse studiene understreker at orale kreftceller med Le
y overekspresjon utstillingen forbedret celle mobilitet. Rollen til Le
y er å stabil EGFR og vedlikeholde EGFR-utløst signalveier. Våre resultater gir også innsikt i hvordan Le
y glykosylering manipulerer EGFR-signalering i kreft i munnhulen. Følgelig Le
y kan bli en biomarkør eller behandling mål i Le
y-overekspresjon oral cancer.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. EGF Behandlingen har ingen virkning på OC-2-proliferasjon.
Celler ble stimulert med forskjellige doser av EGF (A) eller 20 ng /ml EGF i nærvær av forskjellige doser av AG1478 (EGFR inhibitor) (B), og celle vekst ble analysert hver 24. time ved hjelp av WST-1 reagens. Data representerer gjennomsnitt ± SEM (n = 3)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0120162.s001 plakater (TIF)
S2 Fig. Virkningene av Le
y modifikasjon på ligandbinding og Ligand-induserte Dimerisasjon EGFR. Product: (A) Binding av Alexa-EGF på celleoverflaten ble analysert ved hjelp av strømningscytometri. Umerket EGF (2 ug /ml) ble anvendt for å konkurrere med Alexa-EGF for å bestemme bindingen spesifisitet. Midlere fluorescensintensitet (MFI) av Alexa-EGF-binding er vist. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM (n = 3). (B) Cellene ble sultet og stimulert med EGF (40 ng /ml) i 1,5 min, og dimerisering av EGFR ble analysert. De kvantitative data viser forholdet mellom dimer og monomer dannelse etter de angitte varigheten av EGF (40 ng /ml) behandling. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM (n = 3). n.s .: ikke signifikant
doi:. 10,1371 /journal.pone.0120162.s002 plakater (TIF)
