Abstract
Prostatakreft (PCA) er den nest største årsaken til kreftdød i USA. Døden fra PCa resulterer i hovedsak fra metastaser. Mitogen-aktivert protein kinase kinase 4 (MAP2K4) er overuttrykt i invasive PCA lesjoner hos mennesker, og kan inhiberes av lavmolekylære terapeutiske midler som demonstrerer gunstig aktivitet i fase II-studier. Men MAP2K4 rolle i regulering av metastatisk atferd er kontroversielt og ukjent. For å undersøke, utviklet vi menneskelige PCA cellelinjer som overuttrykker enten villtype eller konstituerende aktiv MAP2K4. Orthotopic implantering i mus viste MAP2K4 øker dannelsen av fjernmetastaser. Konstitutiv aktiv MAP2K4, skjønt ikke villtype, øker tumorstørrelse og sirkulerende tumorceller i blod og benmarg. Komplementær
in vitro
studier etablere stabile MAP2K4 overekspresjon fremmer celle invasjon, men påvirker ikke cellevekst eller migrasjon. MAP2K4 overekspresjon øker ekspresjonen av varmesjokkprotein 27 (HSP27) protein og protease produksjon, med den største kraft ved matriks-metalloproteinase-2 (MMP-2), begge
in vitro
og i musetumorprøver. Videre MAP2K4-medierte økning i celle invasjon er avhengig av varmesjokkprotein 27 (HSP27) og MMP-2, men ikke ved MAP2K4 nærmeste nedstrøms mål, p38 MAPK eller JNK. Vi viser at MAP2K4 øker menneskelig PCa metastaser, og forlenget i løpet uttrykk induserer langsiktige endringer i cellesignalveier som fører til uavhengighet fra p38 MAPK og JNK. Disse funnene gir en mekanistisk forklaring på menneskelige studier knytter økninger i HSP27 og MMP-2 til progresjon til metastatisk sykdom. MAP2K4 er validert som en viktig terapeutisk mål for å hemme menneskelig PCa metastase
Citation. Pavese JM, Ogden IM, Voll EA, Huang X, Xu L, Jovanovic B, et al. (2014) mitogenaktiverte Protein kinase kinase 4 (MAP2K4) Fremmer Menneskelig Prostate Cancer metastasering. PLoS ONE 9 (7): e102289. doi: 10,1371 /journal.pone.0102289
Redaktør: Chih-Hsin Tang, Kina Medical University, Taiwan
mottatt: May 1, 2013, Godkjent: 17 juni 2014; Publisert: 14.07.2014
Copyright: © 2014 Pavese et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health (NIH) for å RCB, CA122985 og prostata SPORE CA90386, og til JMP, NIH T32 AG000260 «Drug Discovery Opplæring i Age-Related Disorders», og ved Walter S. og Lucienne Driskill Graduate program i Life Sciences ved Northwestern University. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den vanligste diagnosen kreft i USA menn, og den nest vanligste formen for kreft død [1]. Mens over 90% av personer med lokal PCa ikke vil dø av sin sykdom, de med metastatisk sykdom har en terminal diagnose og de aller fleste vil dø av PCa [2]. Forstå hvordan metastatisk spredning av menneskelig PCa er regulert er av avgjørende biologisk betydning. Denne kunnskapen vil gi oss mulighet til å identifisere pasienter med risiko, og dermed behov for intervensjon, og vil gi grunnlag for utvikling av målrettede terapeutiske strategier.
Mitogen-aktivert protein kinase kinase 4 (MAP2K4, også kjent som MKK4, MEK4, eller SEK1) er en dual-spesifisitet proteinkinase som fosforylerer serin og treonin, samt tyrosinrester. MAP2K4 er et medlem av mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) signalveien og aktiverer typisk to nedstrøms mål, p38-mitogen-aktivert proteinkinase (p38 MAPK) og c-Jun N-terminal kinase (JNK) [3]. Rollen MAP2K4 i menneskelig PCa kreft progresjon, og utvikling av metastaser i særdeleshet, er kontroversielt. MAP2K4 ligger på kromosomal segment 17p11.2, som kan gå tapt ved en hastighet på ca 7-10% i humane epitel-kreftformer, særlig i ovarier og brystkreft [4], [5] Av denne grunn ble det i første omgang antas å være en tumor suppressor. I en rottemodell PCa, ved bruk av celler som mangler en kromosomal segment inneholdende MAP2K4, spesifikk restaurering av MAP2K4 protein redusert PCa metastasering til lungen følgende flanke injeksjon av disse cellene [6]. I denne modellen, økt MAP2K4 også forsinket vekst av metastatiske celler ankommer lungene, sannsynligvis på grunn av G1 cellesyklus arrest [7].
Men andre studier tyder på at MAP2K4 formidler en pro-metastatisk fenotype, og støtte forestillingen om at det ville øke metastaser. MAP2K4 aktiverer p38 MAPK, som driver mange trinn av metastatisk cascade, inkludert epitelial til mesenchymale overgang (EMT), cellulær invasjon, og metastatisk kolonisering (anmeldt i [8]). MAP2K4 ekspresjon økes i høy grad prostatisk intraepitelial neoplasi (HGPIN) lesjoner i både det murine basert TRAMP modell av spontan PCa, så vel som i humane prøver [9]. Dessuten er MAP2K4 ekspresjon økes i tidlig invasiv, dvs. PCa, lesjoner hos mennesker, og øket MAP2K4 ekspresjon korrelerte signifikant med høyere patologisk trinn [9]. Interessant, i disse studiene og andre nivåer av MAP2K4 ble deretter redusert i sent stadium metastaser, og indikerer at MAP2K4 økningen er kritisk for tidlig trinn i den metastatisk kaskade [10]. Denne innflytelsen på tidlige trinn er bekreftet i
in vitro
studier. Ved hjelp av flere forskjellige humane normale og kreft prostata cellelinjer og forbigående ekspresjon av konstruerte MAP2K4, vår gruppe viste at MAP2K4 øker celle invasjon, en kritisk indikasjon på metastatisk progresjon
in vitro product: [11]. Vi identifiserte også MAP2K4 som en viktig terapeutisk mål av små sammensatte hemmere. Vi har nærmere bestemt vist at MAP2K4 var den terapeutiske målet for den lille forbindelsen, 4 «, 5,7-trihydroxyisoflavone (genistein), for sine effekter på invasjon hemming [11], [12], og som genistein hemmer human PCa metastase i en ortotopisk murine modell [13]. Gjennom en rekke relaterte studier, identifiserte vi veien, transformerende vekstfaktor (TGF) β → MAP2K4 → p38 MAPK → heat shock protein 27 (HSP27) → matriksmetalloproteinase type 2 (MMP-2) → human PCa celle invasjon, og at den hemmes av genistein [11] – [16]. Vi har også vist at potensielle genistein administrering til mennesker med lokalisert PCa senker MMP-2-ekspresjon i prostatavev [11]. Ved hjelp av
in vivo
dyremodeller, endret MAP2K4 uttrykk kan endre metastaser i andre menneskelige epiteliale kreftformer. Spesielt har andre grupper vist MAP2K4 knockdown avtar metastatisk tumorvekst i musemodeller av brystkreft og kreft i bukspyttkjertelen [17], [18].
Gitt MAP2K4 er endret uttrykk og prognostisk betydning i mennesker, sin
in vitro
virkninger på humane prostataceller, og varierte responser hos rotte og humane epiteliale kreftcellelinjer, er det viktig å spesifikt bestemme MAP2K4 rolle i regulering av metastaserende oppførsel av menneskelig PCa. Selv om MAP2K4 er et terapeutisk mål av genistein, utøver genistein mange forskjellige effekter. Derfor tross genistein hemming av menneskelig PCa metastaser, rollen MAP2K4 i regulering metastasedannelse kan ikke bestemmes fra disse funnene. Usikkerheten MAP2K4 rolle i å regulere menneskelige prostata kreft metastasering er ytterligere økt med studier over flere ulike krefttyper som støtter enten en metastase demper [6], [7], [19] – [21], eller stimulerende rolle [9], [11], [17], [18]. Viktigere, ingen har undersøkt MAP2K4 rolle i regulering metastatisk oppførsel av menneskelig PCa.
I denne studien, viser vi flere nye funn. Først økte MAP2K4 menneskelig PCa metastasering. MAP2K4 økt tumorvekst
in vivo
, men ikke
in vitro
. Under press fra kronisk uttrykk, som emulerer den kliniske situasjonen, MAP2K4 førte til en omkobling av cellesignalveier. Dette resulterte i en bypass umiddelbare nedstrøms signalproteiner, p38 MAPK og JNK. Vi identifiserte en unik mekanisme for kompensasjon der MAP2K4 ført til en oppregulering i uttrykket av HSP27 total protein. Dette i sin tur ført til høyere absolutte nivåer av fosforylert HSP27, og økning i nedstrøms MMP-2. Den MAP2K4-drevet metastatiske fenotype ble vist å være avhengig av HSP27 og dens nedstrøms effektor, MMP-2. Disse funnene viser at MAP2K4 er en viktig drivkraft for menneskelig PCa metastaser, og de dermed validere det som et terapeutisk mål for å hemme PCa metastaser. De gir også en mekanistisk forklaring på kliniske studier knytter økninger i MAP2K4, HSP27 og MMP-2 uttrykk for den fremtidige utviklingen av metastaser.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
alle dyrestudier ble utført i henhold til anbefalingene i guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Northwestern University (PHS Assurance # A3283-01). Alle operasjoner ble utført under isoflurananestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
Cell Kultur og Transfeksjon
PC3-M og LNCaP celler ble holdt i RPMI 1640 medium supplert med 2 mM L -glutamine, 10 mM HEPES-buffer, 50units /ml penicillin, 50 ug /ml streptomycin og 10% føtalt bovint serum (Life Technologies) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% karbondioksid. 1542CPTX celler ble opprettholdt i keratinocytt SFM media supplert med 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES-buffer, 50units /ml penicillin, 50 ug /ml streptomycin, 10% føtalt bovint serum, 5 ng /ml EGF human rekombinant, 50 ug /ml bovint hypofyseekstrakt (Life Technologies) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% karbondioksid.
MAP2K4 stabilt transfekterte celler ble laget ved å transfektere PC3-M, LNCaP, eller 1542CPTX celler, hvis opprinnelse er beskrevet tidligere [22], med transitt-LT1 Transfeksjon Reagens (Mirus Bio LLC), og plasmid DNA henhold til produsentens anvisninger. Celler ble dyrket under G418-seleksjon betingelser, individuelle kolonier høstet og utvidet, som tidligere beskrevet av oss [23]. I angitte forsøk ble de resulterende individuelle klonale cellelinjer transfektert i tillegg, som angitt ovenfor, med GFP ekspresjonsplasmid, valgt under blasticidin vekstbetingelser, og deretter renset ved anvendelse av steril cellesortering basert på GFP status. Cellelinjer ble autentisert i henhold til metoder som er beskrevet i American Type Culture Collection (ATCC) Technical Bulletin No. 8, cellelinje verifikasjonstesten Anbefalinger [24]. Spesielt celler fra lav passasje (dvs. 15 passasjer) frosset aksjer ble brukt og var opp igjen etter 20 passasjer, celler gikk rutine mikroskopisk undersøkelse for å bekrefte uniform og standard mobil arkitektur og ingen mikrobiell infeksjon, og cellene ble testet og funnet negativ for mykoplasmainfeksjon.
For knockdown eksperimenter, Dharmacon ON-Targetplus SMARTpool siRNA rettet mot MAP2K4 (L-003574-00-0005), HSP27 (L-005269-00-0005), MMP-2 (L-005959- 00-0005), eller ikke-måls siRNA (D-001810-10-05) ble transfektert inn i cellene ved hjelp Dharmafect Duo (T-2010, alt fra Thermo Scientific), sammen med pCMV-β-galaktosidase (Agilent Technologies), og brukes etter 48 timer, som beskrevet av oss [11]
reagenser og Plasmider
følgende var kjøpt. antistoffer, SEK1 /MKK4 (# 9152), fosfor-p38 MAPK (T180 /Y182) (# 4631), p38 MAPK (# 9212), fosfor-SAPK /JNK (T183 /Y185) (# 4668), SAPK /JNK (# 9258), fosfor-HSP27 (# 2401), HSP27 (# 2402) og GAPDH (# 2118), alle fra Cell Signaling Technology, og pepperrot peroksidase-konjugert anti-mus og anti-kanin, fra GE Healthcare Biosciences; plasmider, villtype og konstituerende aktiv MAP2K4 (# 14615 og # 14813; Addgene) og GFP (levende farger pcDNA 6,2 /N-EmGFP-GW /TOPO, Invitrogen); kjemiske inhibitorer, p38 MAPK-inhibitor, SB203580 (Sigma-Aldrich) og tilhørende negativ kontroll, SB202474, og JNK inhibitor II (SP600125), og JNK inhibitor II negativ kontroll (N
1-metyl-1,9-pyrazoloanthrone), alt fra EMD Millipore.
Murine Model of human Prostate Cancer Metastase
Celler ble implantert og fjernmetastaser kvantifisert som tidligere beskrevet av oss, med modifikasjoner [13], [25]. Kort, 2,5 × 10
5 celler ble implantert i ventral prostata på 6-8 uker gamle Balb /c athymiske mus matet Harlan Teklad 2016S chow og vann
ad libitum
, og ligger i en barriere anlegg med 12 timers lys /mørke sykluser. Etter 6 uker, ble svulstvevet hurtigfrosset, lungene ble formalinfiksert /parafin innebygd, og blod og benmarg ble dyrket i komplett RPMI 1640 medium med G418 i 10 dager, og tilstedeværelse av CTCs registrert.
Med 45 micron step-seksjoner, tilstøtende 4-mikron lunge vevssnitt ble immunostained for GFP og med hematoxylin og eosin (H E). Metastaser ble scoret i en blindet mote, som grupper av ≥5 GFP positive celler.
Cell Invasion Analyser
Cell invasjonen ble målt som beskrevet av oss, med modifikasjoner [26]. Etter tilsetning av 1 x 10
5-celler, i RPMI 1640 med 0,1% BSA, for å BD BioCoat Growth Factor Redusert Matrigel kamre med 8 um membraner, celler invaderte i 24 timer mot det nedre kammer, inneholdende serumfritt NIH 3T3 kondisjonerte mediet . Analysene ble utført på minst 3 separate ganger, hver gang i replikater på N = 3. I noen eksperimenter ble celler behandlet med 10 uM inhibitor 48 timer før, og i løpet av invasjon.
Invaderende celler, det vil si, på den bunnmembran, ble metanol fast, krystallfiolett flekkete, og avbildes og tellet under lysmikroskopi. I parallelle brønner ble celler på toppen membranen ikke er fjernet, slik bekreftelse av like antall av totale celler lastet. For siRNA eksperimenter, ble cellene farget med
In Situ
β-galaktosidase Farging Kit (Agilent Technologies), etterfulgt av bildebehandling og teller invaderte og ikke-invaderte β-gal positive celler per brønn.
celle migrasjon Analyser
Cellular migrasjon ble målt som beskrevet av oss, med modifikasjoner [26]. Hver BD Falcon godt, med 8 um membraner, ble lastet med 2,5 x 10
4 celler, og tillatt å migrere i 8 timer mot kondisjonerte mediet i det nedre kammeret. Celler ble farget med krystallfiolett, som ovenfor. Analysene ble utført 3 separate ganger, hver gang i replikater på N = 3.
kvantitativ revers transkriptase-polymerase kjedereaksjon
kvantitativ revers transkriptase-polymerase kjedereaksjon (QRT /PCR) ble utført som beskrevet av oss [27]. Kort, RNA ble isolert med RNeasy Mini Kit (Qiagen) for celler og med Trizol (Invitrogen) etterfulgt av RNeasy Mini Kit rensing for svulstvev, cDNA syntetisert ved hjelp av TaqMan Reverse Transcription reagenser, og qPCR utføres ved hjelp av TaqMan Universal PCR Master Mix og primer- probe par på en 7500 ABI real Time PCR System (alle fra Life Technologies). Primer-prober var: GAPDH (Hs99999905_m1), MMP-2 (HS00234422_m1), MMP-9 (Hs00234579_m1), MMP-10 (Hs00233987_m1), MMP-13 (Hs00233992_m1). Minst to separate analyser ble utført, hver i replikater på N = 2, resulterende midlere terskel sykluser ble normalisert til GAPDH og relativ genekspresjon beregnet ved hjelp av to
-ΔΔCt metoden [28].
Cell vekstanalyse
Fem dagers cellevekstanalyser ble utført som beskrevet av oss [23]. I korthet, etter fem dager med ikke-sammenflytende eksponensiell vekst i 96 brønners plater, dimethylthiazoldiphenytetrazolium-bromid (MTT) ble tilsatt, og OD
540 bestemt. Analyser ble gjentatt tre ganger, hver gang i replikater på N = 3.
Soft Agar Growth Assay
I en 6 brønners plateformat, 1 x 10
4 celler /0,5 ml 0,3% DNA-grade basis agar (Sigma Aldrich) ble lagt på 1 ml 0,5% agar, alt tatt opp med og til slutt toppet med 0,5 ml RPMI 1640 cellekulturmedier. Etter 14 dager ble kolonier farget krystallfiolett og tellet under lysmikroskopi. Analyser ble gjennomført tre ganger, hver gang i replikater på N = 2.
Western blot
Western blots ble utført som tidligere beskrevet av oss [15]. Antistoffkonsentrasjoner var i henhold til produsentens instruksjoner.
Statistisk analyse
Grupper ble ansett som statistisk signifikant dersom tosidig t-test p-verdien var ≤0.05.
Resultater
MAP2K4 Øker Menneskelig Prostate Cancer Metastase
Vi utviklet stabil uttrykk for villtype MAP2K4 (WT-MAP2K4), konstituerende aktiv MAP2K4 (CA-MAP2K4), eller tom vektor, for kontroller (VC), i PC3-M-celler. CA-MAP2K4 konstruksjonen har Ser220Glu og Thr224Glu punktmutasjoner i sin aktivering motiv [29]. Som bestemmes av Western blot, Fig 1A, CA-MAP2K4 og WT-MAP2K4 cellelinjer uttrykke MAP2K4 2,9 og 4,3 ganger høyere nivåer i gjennomsnitt, sammenlignet med gjennomsnittet for VC cellelinjer. Hver enkelt CA- eller WT-MAP2K4 cellelinje uttrykker nivåer ≥2.6 ganger høyere. Disse funnene viser at det er mulig å konstruere MAP2K4 overekspresjon cellelinjer.
A) MAP2K4 protein uttrykk i MAP2K4 variant cellelinjer. Ekspresjon av MAP2K4 protein ble målt i vill-type, WT1, WT2, og konstitutiv aktiv, CA1, CA2, CA3, MAP2K4 spissen uttrykkende cellelinjer, og vektorkontroll, VC1, VC2, cellelinjer ved hjelp av Western blot. En representant Western blot er avbildet, med kvantifisering av MAP2K4 /GAPDH nivåer, normalisert til VC1 celler, vist ovenfor hvert kjørefelt. B) Invasjonen av MAP2K4 variant cellelinjer. Boyden kammer Matrigel celle invasjon analyser ble utført som beskrevet i Metoder. Dataene er fra 5 uavhengige forsøk, hvert i replikater på N = 3. Data fra de respektive villtype, konstitutive aktive og vektorkontrollcellelinjer ble kombinert til oppnåelse av en gjennomsnittlig lest ut for WT-MAP2K4, CA-MAP2K4 og VC-celler, respektivt . Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM prosentandel av VC-celler. C-E) Virkningen av MAP2K4 uttrykk på metastatisk spredning og tumorvekst. Like mange mus ble orthotopically implantert med VC1 eller VC2 celler (som danner VC kohort), WT1 eller WT2 celler (WT kohort), eller med CA1, CA2 eller CA3 celler (CA kohort). I (C) det resulterende antallet fjernmetastaser er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM prosentandel av VC mus, i (E) antallet mus som utvikler sirkulerende tumorceller er vist, og i (F) tumorvolumet fremstilles grafisk som gjennomsnitt ± SEM andel av VC mus. Et representativt bilde av en distinkt metastase er vist i (D). * Angir p≤0.05 mellom VC og en eksperimentgruppe.
For å evaluere den funksjonelle relevansen av MAP2K4 overekspresjon, vurdert vi evnen til cellelinjer til å invadere i en Matrigel Boyden kammer analysen, fig 1B. Overekspresjon av MAP2K4 økt betydelig invasjon til et gjennomsnitt på 328% for WT-MAP2K4 cellelinjer og til 490% for CA-MAP2K4 cellelinjer, sammenlignet med VC cellelinjer. For individuelle cellelinjer, det vil si, to av to WT-MAP2K4 og tre av tre CA-MAP2K4, invasjonsnivået var statistisk signifikant, sammenlignet med kontrollceller (data ikke vist). Parallelt med prosjektering MAP2K4 overekspresjon cellelinjer, har vi også utviklet en serie med stabile MAP2K4 knockdown cellelinjer med to forskjellige kort hårnål shRNA uttrykker vektorer, og bekreftet knockdown var spesifikke for MAP2K4 (data ikke vist). Men når teste funksjonen av disse cellelinjer i invasjons analyser vi ikke observere en konsekvent fenotype. Nærmere bestemt, halvparten av de klonale cellelinjene utviste redusert invasjon, mens halvparten viste ingen endring. Dette funnet er sammenfallende med en terskelverdi for uttrykk som kreves for effekter ved MAP2K4 ved regulering av invasjonen. På grunn av manglende samsvar fenotype med knockdown av MAP2K4, valgt vi å ikke forfølge dette videre. I kontrast med MAP2K4 overekspresjon klart at resultatene er i samsvar med fenotype av økt invasjon og er i samsvar med observasjoner hos mennesker, der økt MAP2K4 uttrykk oppstår i invasive lesjoner i prostata.
For å finne ut om økt MAP2K4 uttrykk øker metastatisk potensial, undersøkte vi effekten av MAP2K4 på tumorvekst og metastasedannelse
in vivo
ved hjelp av en orthotopic murine modell av menneskelig PCa metastase spesielt utviklet av oss for å kvantifisere disse parametrene [13], [25]. Denne modellen gir respons på anti-motilitet terapeutiske midler, så vel som av endringer i ekspresjon av gener som regulerer metastatisk progresjon. I denne modellen blir humane PCA-celler direkte implantert i prostata, slik at for måling av primær tumorstørrelsen, PCA-celler som kommer inn i blodstrømmen som i transitt sirkulerende tumorceller (CTCs), PCA-celler i benmargen, og av fjern lunge metastasering. Metastasering til lungene er et primært endepunkt funksjon i denne modellen, slik at nøyaktig kvantifisering av individuelle metastatiske innskudd, og derfor et nøyaktig mål på evnen av primærceller for å metastasere ut av sitt organ av opprinnelse, emulere situasjonen hos mennesker.
Tre årskull av mus ble implantert med enten VC celler (hvor like mange mus ble implantert med enten VC1 eller VC2 celler), WT-MAP2K4 celler (like mange implantert med WT1 eller WT2 celler), eller med CA-MAP2K4 celler (like mange implantert med enten CA1, CA2 eller CA3-celler), hvilket gav 21, 26 og 28 mus levedyktig mus etter operasjonen i VC, WT-MAP2K4 og CA-MAP2K4 kullene, respektivt. Seks uker etter operasjonen, primær tumor størrelse, metastase, og CTCs ble målt i hver mus. Øket ekspresjon av enten WT-MAP2K4 eller CA-MAP2K4 betydelig øket fjernmetastaser ved 16,2 og 17,4-ganger, sammenlignet til VC mus og ingen signifikant forskjell mellom WT-MAP2K4 og CA-MAP2K4 mus, Fig 1C. Et representativt bilde av en distinkt metastase er vist i figur 1D. Disse funnene demonstrerer økt MAP2K4 øker menneskelig PCa metastasering. Interessant, CTCs ble bare observert i CA-MAP2K4 mus, ble detektert i blodet til 11% (3/28) og benmarg på 7% (2/28), figur 1E, og viser at CTCs er relativt uvanlig i MAP2K4- drevet metastase.
tross WT-MAP2K4 mus som oppviser betydelig øket metastaser sammenlignet med VC, størrelsen av primær tumor i WT-MAP2K4 mus var gjennomsnittlig 24% mindre, selv om det ikke er statistisk signifikant, fig 1F. Som økt tumorstørrelse i-og-av-seg selv kan påvirke metastatisk spredning, viser dette MAP2K4 har en primær effekt på regulering av metastatisk atferd. Interessant, svulster i CA-MAP2K4 mus signifikant økt med 2,04 og 2,67 ganger, sammenlignet med VC og WT-MAP2K4 mus, henholdsvis. Derfor ikke villtype MAP2K4 ikke øke tumorvekst, men konstituerende aktiv MAP2K4 gjør.
MAP2K4 endrer protease produksjon, men ikke cellemigrasjon eller cellevekst
in vitro
Å ha vist at MAP2K4 øker metastaser, forsøkte vi å utdype vår forståelse av de underliggende mekanismene. Kronisk MAP2K4 uttrykk økt celle invasjon (Fig 1B), og celle invasjon er veldig avgjørende for metastatisk atferd. Vi evaluerte neste om økt cellulær invasjon i MAP2K4 overekspresjon celler var avhengig MAP2K4 ved å slå ned MAP2K4 med siRNA. I figur 2A, for hver av cellelinjene, knockdown på 21-55% ble oppnådd. Vi neste demonstrert at MAP2K4 knockdown vesentlig tilbake den økte invasjonen fenotype observert i både WT-MAP2K4 og CA-MAP2K4 celler, Fig 2B. Derfor forblir avhengig av fortsatt MAP2K4 uttrykk celle invasjon.
Studier ble gjennomført på MAP2K4 variant cellelinjer. A) knockdown av MAP2K4 protein av siRNA. Etter transfeksjon av celler med siRNA rettet mot MAP2K4 (siMAP2K4) eller ikke-måls kontroll (SICON), ble MAP2K4 uttrykk målt ved Western blot. Prosent knockdown betegnes over blot. B) Effekt av MAP2K4 knockdown på celle invasjon. MAP2K4 variant cellelinjer ble behandlet med siRNA, som angitt, og celle invasjon målt og vist som i figur 1. Dataene er fra fire eksperimenter, hvert i replikater på N = 2, og er uttrykt som prosentandel av invaderende celler. C) Effekter på cellemigrasjon. Cellemigrering ble målt som beskrevet i Metoder. Data fra individuelle typer av kloner ble slått sammen, er fra tre uavhengige eksperimenter, hvert i replikater på N = 3, og er uttrykt som prosentandel av migrerende celler, normalisert til VC. D) MMP transkripsjon uttrykk. Nivåene av MMP-2, MMP-9, MMP-10 og MMP-13 transkripsjonsnivåer ble målt ved QRT /PCR, normalisert til GAPDH, og uttrykt som prosentandelen av VC. Dataene er hentet fra fire uavhengige forsøk, hver i gjentak av N = 2. E) cellevekst. Celler ble sådd ut i de angitte konsentrasjoner, er tillatt å vokse i 5 dager, MTT tilsatt og optisk tetthet bestemt. Dataene er hentet fra tre uavhengige eksperimenter, hver N = 3. F) Colony formasjon. Kolonidannelse etter 14 dager ble bestemt i tre uavhengige forsøk, hvert N = 2, og uttrykt som prosent av VC. Verdier i alle grafer er gjennomsnitt ± SEM. * Angir p≤0.05 mellom de angitte gruppene.
Gitt den anerkjente rollen celle invasjon i metastatisk progresjon, vi videre undersøkte mekanistiske fundamentet for MAP2K4 effekt på celle invasjon. Cell invasjonen er primært drevet av cellevandring koblet til proteasenedbrytning. Verken WT-MAP2K4 eller CA-MAP2K4 overekspresjon økt celle migrasjon i en ubestrøket Boyden kammeret analysen, Fig 2C. I tillegg observerte vi ingen konsekvent effekt på cellemigrering målt ved enkeltcelle motilitet analyse (data ikke vist). Vi neste undersøkt MAP2K4 effekt på protease uttrykk. Fordi det er et bredt utvalg av kjente proteaser, vi først gjennomført en skjerm for relevante proteaser. Vi har tidligere etablert genistein binder seg til og hemmer MAP2K4 kinase, for derved å inhibere human PCa celle invasjon [11]. Vi undersøkte derfor effekten av genistein behandling på innfødte PC3-M celler ved hjelp av den ekstracellulære matriks og adhesjonsmolekyler RT
2 Profiler PCR Array system, som profilerer 84 menneskelige gener som regulerer celle-celle og celle-matrise interaksjoner (Figur S1). De følgende proteaser ble signifikant nedregulert ved minst to ganger ved genistein: MMP-2, MMP-10 og MMP-13, og ble bekreftet ved genspesifikke QRT /PCR (figur S1). Basert på disse funnene, undersøkte vi ekspresjon av disse tre proteaser i sammenheng med MAP2K4 overekspresjon. I tillegg, som MMP-2 og MMP-9 er nært relatert gelatinaser, ofte samtidig er regulert, og som genistein påvirker MMP-9 er noen cellelinjer, om enn episodisk og i liten grad, vi i tillegg målt MMP-9 [30]. Måling av transkripsjonsnivåer etter QRT /PCR avslørte at MMP-2 ble betydelig øket med gjennomsnittlig 15-ganger sammenlignet med VC, både i WT-MAP2K4 og CA-MAP2K4 celler. MMP-9 gjorde en betydelig økning to-fold, men bare i WT-MAP2K4 celler. MMP-10 og MMP-13 var upåvirket. Derfor MAP2K4-medierte økning i invasjon ikke skyldes endringer i cellemigrering, men er assosiert med endringer i ekspresjon protease, MMP-2 i særdeleshet. Dette er klinisk relevant som MMP-2 kan forringe kollagen IV, en viktig komponent av prostatavevet, og har vært assosiert med dårlig prognose, herunder utvikling av metastaser (anmeldt i [31]).
Vi neste undersøkt økt tumorstørrelse observert i CA-MAP2K4 mus, fig 1E, for å avgjøre om veksten er endret
in vitro
, fig 2E-F. I et fem dagers
in vitro
MTT-analyse, ingen forskjeller i cellevekst mellom gruppene ble observert, Fig 2E. I et 14-dagers bløt agar-kolonidannelsesbestemmelsen, CA-MAP2K4 celler vokste noe langsommere enn VC og WT-MAP2K4 celler, men denne endringen var ikke signifikant, Fig 2F. Disse funnene viser at under
in vitro
vekstvilkår, verken WT-MAP2K4 eller CA-MAP2K4 påvirke cellevekst.
MAP2K4 overekspresjon endrer spesifikt HSP27 fosforylering og total protein uttrykk
oven~~POS=TRUNC nevnte~~POS=HEADCOMP funn viser at MAP2K4 øker relativt spesifikt MMP-2. Forbigående modifikasjon av MAP2K4 regulerer MMP-2 og celle invasjon ved fosforylering og aktivering av p38 MAPK [12]. I tillegg til p38 MAPK, kan MAP2K4 også enten aktiverer JNK, eller begge proteiner, avhengig av modellen system [32]. JNK er ofte knyttet til endringer i spredning og apoptose som svar på stress i menneskelig PCa [33] – [35], men også med endringer i cellemigrasjon og invasjonen [36], [37]. Vi antok derfor at kronisk MAP2K4 ekspresjon ville øke aktivering av p38 MAPK og /eller JNK. Vi testet denne teorien ved å undersøke fosfor-p38 MAPK, -JNK1 og -JNK2 nivåer ved Western blot i MAP2K4 enn å uttrykke cellelinjer, ved hjelp fosfoproteinet spesifikke antistoffer. Imidlertid gjorde våre funn ikke støtter vår hypotese som overekspresjon av MAP2K4 ikke øke enten fosfo eller totale proteinnivå enten p38 MAPK eller JNK, Figur S2.
Våre funn støtter hypotesen om at under forhold med vedvarende MAP2K4 overekspresjon, som forekommer i den kliniske situasjon, kompenserende veier kan bli forbi mål umiddelbart nedstrøms for MAP2K4, for derved å etterlate dem i en inaktivert tilstand. HSP27, en nedstrøms for p38 MAPK, øker både MMP-2-ekspresjon og celle invasjon i human PCa, under betingelser for forbigående transfeksjon [12], [15]. Vi undersøkte derfor status for HSP27, figur 3A-B. Samlet nivåer av både fosfo og total HSP27, sammenlignet GAPDH, økte. Fosfo og total HSP27 økte med 3,4 (signifikant) og 2,7 (bare en trend; to-sidig p-verdi = 0,065), henholdsvis for WT-MAP2K4 celler, og begge signifikant ved 3,1 og 3,0 ganger for CA-celler MAP2K4 . Den fosfor-HSP27 /totalt HSP27 forholdet økningen var liten, og signifikant bare for WT-MAP2K4 celler. Disse funnene demonstrerer MAP2K4 fører til økte nivåer av total og fosfor-HSP27 protein. Det var ingen forskjell i HSP27 genekspresjon mellom MAP2K4 overekspresjon og VC celler, Fig 3C, noe som indikerer at forskjeller i proteinuttrykk stammet fra endringer i oversettelse og /eller protein degradering. Samlet utgjør disse funnene fastslå at kronisk MAP2K4 overekspresjon fører til økt HSP27 protein uttrykk, mens omgåelsen aktivering av p38 MAPK og JNK.
uttrykk for total og fosforylerte formene for HSP27 proteiner ble vurdert av Western blot i indikerte cellelinjene, AB. Data fra tre separate blot er grafisk avbildet inb, som gjennomsnitt ± SEM. C), HSP27 transkripsjonsnivåer ble målt ved QRT /PCR, normalisert til GAPDH, og uttrykt som gjennomsnitt ± SEM prosentandel av VC.
