Abstract
Bakgrunn
For å undersøke potensialet av serum mirnas som biomarkører for tidlig deteksjon av magekreft (GC), ble en populasjonsbasert studie utført i Linqu, en høy-risiko område av GC i Kina.
metodikk /hovedfunnene
Alle forsøkspersonene ble valgt fra to store kohortstudier. Differensial mirnas ble identifisert i serum bassenger av GC og kontroll ved hjelp av TaqMan lav tetthet array, og validert i enkelte fra 82 par av GC og kontroll, og 46 par av dysplasi og kontroll av sanntids kvantitativ revers transkripsjon-polymerase chain reaction. Den tidsmessige trender identifisert serum miRNA uttrykk ble videre undersøkt i en retrospektiv studie på 58 GC pasienter som hadde minst en pre-GC diagnose serumprøve basert på langsiktig oppfølging befolkningen. De miRNA profilering Resultatene viste at 16 mirnas ble markert oppregulert i GC pasienter sammenlignet med kontroller. Ytterligere validering identifisert et panel av tre serum mirnas (MIR-221, MIR-744, og MIR-376c) som potensielle biomarkører for GC deteksjon og mottaker drift karakteristikk (ROC) kurve-basert risikovurdering analyse viste at dette panelet kan skille GCer fra kontroller med 82,4% sensitivitet og 58,8% spesifisitet. MiR-221 og MIR-376c viste signifikant positiv sammenheng med dårlig differensiering av GC, og MIR-221 vises høyere nivå i dysplasi enn i kontroll. Videre retrospektiv studie viste en økende trend av disse tre miRNA nivåer under GC utvikling (
P
for trend 0,05), og dette panelet kan klassifisere serumprøver samlet opp til 5 år forut for klinisk GC diagnose med 79,3 % samlet nøyaktighet.
Konklusjon /Betydning
Disse dataene tyder på at serum MIR-221, MIR-376c og MIR-744 har stort potensial som nye ikke-invasive biomarkører for tidlig deteksjon av GC.
Citation: Song Min Pan Kf, Su Hj, Zhang L, Ma Jl, Li Jy, et al. (2012) Identifisering av Serum microRNAs som Novel ikke-invasive biomarkører for tidlig deteksjon av magekreft. PLoS ONE 7 (3): e33608. doi: 10,1371 /journal.pone.0033608
Redaktør: Joseph Califano, John Hopkins Medical School, USA
mottatt: 15 november 2011; Godkjent: 13 februar 2012; Publisert: 14 mars 2012
Copyright: © 2012 Song et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Basic Research Program of China (973 Program: 2010CB529303), A3 Foresight sight~~POS=HEADCOMP Program fra Science Foundation Natural of China (30921140311) og Natural Science Foundation National of China (81041012 og 81171989). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP (GC) er den nest største årsaken til kreft dødsfall i verden, med nesten halvparten skjer i Kina [1], [2]. Prognosen for GC varierer bemerkelsesverdig ved stadium av kreft med 5-års relativ overlevelsesrate nådde 90% i fase I, men mindre enn 5% i Stage IV [3]. Dermed er tidlig deteksjon av GC et sentralt mål å redusere dødeligheten og bedre prognosen for GC.
Selv gastroscopic screening for GC er svært pålitelig, er det invasiv og kostbar, særlig for utviklingslandene. Derfor har mye arbeid blitt gjort for å utvikle rimeligere innledende screeningtester på lett tilgjengelige prøver. Men mange tidligere undersøkt analytter, så som pepsinogen (PG) I /II-forhold, carcinoembryonic antigen (CEA) og karbohydratantigenet 19-9 (CA 19-9), ble ikke sensitiv og spesifikk nok til GC screening [3], [ ,,,0],4]. Dermed er det et presserende behov for nye ikke-invasive biomarkører for å forbedre tidlig deteksjon av GC.
microRNAs (mirnas) er en rikelig klasse av små ikke-kodende RNA som negativt regulerer genuttrykk ved baseparing med 3′-ikke-translaterte området av mål-mRNA, noe som resulterer i enten mRNA spalting eller translasjonsbevegelse undertrykkelse [5], [6]. Økende bevis har vist at mirnas er involvert i ulike biologiske prosesser, herunder utvikling, celledifferensiering, spredning og apoptose [7], og delta i menneskelige kreft som onkogener eller tumor suppressors [8]. Studier har indikert at miRNA ekspresjonsprofilen varierer mellom tumortyper og kan skille kreft og normalt vev [9], [10]. Nylig har sirkulert mirnas blitt foreslått et stort potensial som biomarkører for mange kreftformer, inkludert GC [11] – [16]. Imidlertid har verdien av sirkulerende miRNAs i tidlig deteksjon av GC ikke blitt rapportert ennå.
Siden 1989 har vi gjennomført en rekke studier i Linqu County, en høy risikoområde for GC i Shandong-provinsen i Kina , inkludert en populasjonsbasert kohortstudie av forstadier mage lesjoner [17], [18], og en randomisert studie for å hemme utviklingen av helsefare [19]. Denne kohorten tillater oss å undersøke dynamiske endringer i sirkulerende miRNA nivåer under GC utvikling, og gir oss en unik mulighet til å undersøke mulighetene for sirkulerende miRNAs i tidlig deteksjon av GC.
Heri, rapporterer vi resultatene av differensial mirnas i serum av GC og dysplasi (DYS), og en retrospektiv studie designet for å evaluere de dynamiske endringene under GC utvikling.
Materialer og metoder
studie~~POS=TRUNC og befolkningen
detaljene for studiepopulasjonen, prosedyrer for endoskopisk undersøkelse, kriterier for gastrisk histopatologi og oppfølging har blitt beskrevet andre steder [17] – [19]. Kort fortalt ble en endoskopisk screening undersøkelse lansert i 1989 blant 3399 innbyggere i alderen 35-64 år i Linqu County, en høy risikoområde for GC, og fagene uten GC diagnose ble senere fulgt opp med gjentatte endoskopisk undersøkelse gjennomført i 1994 [17 ], [18]. I 1995 ble en randomisert, placebokontrollert intervensjonsstudie initiert i denne populasjonen til 2003, da gjentatt endoskopisk undersøkelse ble utført [19]. Alle fag gjennomgikk blodprøvetaking i både baseline og endepunkts undersøkelser av hver studie, og noen med avanserte helsefare, for eksempel intestinal metaplasi (IM) eller DYS, også gitt blod og fikk endoskopisk undersøkelse i 1992 og 1999.
i denne studien ble en flertrinns, nestet case-control studie fra to store kohorter utformet for å identifisere og validere differensial serum mirnas i GC og DYS, og en retrospektiv studie ble utført for å undersøke potensialet for kandidaten serum mirnas i tidlig deteksjon av GC (figur 1).
Denne studien ble delt inn i fire trinnvise faser. I fase I, serum bassengene fra 14 GC pasienter og 14 alders- og kjønns matchet kontroller med diagnostisering av overfladisk gastritt (SG) eller mild kronisk atrofisk gastritt (CAG) ble brukt til å generere miRNA profiler etter rekke analyse. Differensial mirnas ble identifisert, og de ekstremt oppregulert mirnas eller moderat oppregulert mirnas har funksjonelle eller biomarkør relaterte rapporter ble valgt ut for videre analyse. I fase II, ble identifisert mirnas validert ved hjelp av kvantitativ revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (QRT-PCR) på de enkelte serumprøver av 14 GCer og kontroller som ble brukt for matrisen test i fase I. I fase III, de betydelig endrede mirnas ble senere validert i 68 GC og 46 dys pasienter samt deres alders- og kjønns matchet kontroller. Mottaker opererer karakteristikk (ROC) kurve-basert risikovurdering analyse ble deretter utført blant 68 GC-kontroll par for å evaluere diskriminerende virkning av serum mirnas på GC. Hver gjenstand ble tildelt i enten høy- eller lav-risikogrupper ved å sammenligne uttrykket nivåer av miRNA biomarkører til de tilsvarende grenseverdier avledet fra ROC kurve. I fase IV, ble en retrospektiv studie utført på 58 GC pasienter, som ga minst én kvalifisert pre-diagnose serumprøve på lang sikt oppfølgingsstudie som beskrevet ovenfor, for å utforske den tidsmessige utviklingen av potensielle miRNA biomarkører og bestemme deres verdi i tidlig GC deteksjon. Hele studien ble godkjent av Institutional Review Board of Peking University Cancer Hospital Institute, og alle fag ga skriftlig informert samtykke.
Utvalgets behandling og RNA ekstraksjon
Opp til 5 ml fullblod fra hvert faste deltaker ble samlet inn med saker og kontroller gjort på samme år. Blodprøver ble tillatt å stå i 30-40 min og serum separering ble oppnådd ved sentrifugering ved 965 g i 15 min. Supernatanten serum ble gjenvunnet og lagret ved -80 ° C inntil analyse. RNA ble isolert fra 100 mL serum med miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Tyskland) etter produsentens protokoll med mindre endring [20]. For miRNA profilering, ble to bassenger skapt ved å kombinere blandinger av øvre vannfasen etter faseseparasjon og etanol fra 14 GC pasienter (12 menn, to kvinner, alder, 62 (SD 6,4) år) og 14 sex-og alders matchet kontroller (age, 61 (SD 5,9) år), henholdsvis. Etter binding til membranen av RNeasy Mini spinnkolonne og etterfølgende vasking, ble RNA eluert med 40 ul RNase-fritt vann. For alle QRT-PCR-eksperimenter, RNA ble ekstrahert fra 100 ul av serum ble eluert med 100 ul RNase-fritt vann. Å normalisere sample-til-prøve variasjon i RNA isolering trinn ble syntetisk ath-MIR-159a lagt til hver serumprøve for miRNA profilering mens cel-MIR-39 ble lagt for QRT-PCR-analyse som beskrevet av Mitchell
et al product: [11].
miRNA profilering
miRNA profilering ble utført ved bruk av TaqMan lav tetthet matrise A (v2.0) i henhold til produsentens anbefalte protokoll (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Dette QRT-PCR profilering plattform består av en 384-brønners mikrofluid kortet der 377 mirnas kan analyseres sammen med tre endogene kontroller (U6, RNU44 og RNU48) og en negativ kontroll som ikke er relatert til human (ATH-MIR-159a). I korte trekk, RNA samles separat fra 14 GC pasienter og kontrollpersoner som beskrevet ovenfor var revers transkribert ved bruk av TaqMan miRNA revers transkripsjon kit og TaqMan miRNA multipleks RT-analyser (human bassenget, Applied Biosystems). For hvert RNA pool, ble 3 pl av totalt RNA tilsatt til hver av multipleks revers transkripsjon reaksjoner.
For å øke mengden av cDNA som er tilgjengelig for analyse, anrikning av målgener ble utført med en preamplification trinn. Den 25-ul reaksjonsblanding bestod av 2,5 pl ufortynnet cDNA kombinert med 12,5 ul av TaqMan PreAmp Master Mix (2 x), 2,5 ul av megaplex forforsterker Grunning (10 x), og 7,5 ul av nuklease-fritt vann. Den preamplification trinnet ble utført på en GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) etter produsentens protokoll.
For real-time PCR-analyse, produktet ble fortynnet ved å tilsette 75 mL av nukleasefritt vann og 9 mL av den fortynnede blanding ble deretter kombinert med 450 mL TaqMan 2 × Universal PCR Master Mix uten uracil-N-glykosylase og 441 mL av nukleasefritt vann. Etter lasting av 100 ul av hver multipleks basseng blanding ble sentrifugert matrisen og forseglet. Amplification ble utført på et Applied Biosystems 7900 HT termosykler (Applied Biosystems) ved hjelp av produsentens anbefalte sykkelforhold. Data ble analysert ved hjelp av RQ Manager Software versjon 1.2 og DataAssist ™ Software versjon 2.0 (Applied Biosystems). Etter normalisering ved hjelp av den piggete-in ath-MIR-159a, fold endring av mirnas nivåer i GC sammenlignet med kontrollen ble beregnet ved hjelp av metoden.
Mirna kvantifisering av real-time QRT-PCR
revers transkripsjon ble utført ved hjelp av TaqMan miRNA revers transkripsjon kit og miRNA-spesifikke stilk-løkke primere (Applied Biosystems). Den 7,5-pl reaksjonsblanding besto av 0,75 mL av 10 × Reverse-transkripsjon buffer, 0,095 mL av RNase inhibitor (20 enheter /ul) 0,075 mL 100 mM dNTP med dTTP, 0,5 mL av MultiScribe revers-transkriptase (50 enheter /ul), 1,5 ul primer, 2,5 pl av RNA, og 2,08 pl RNase-fritt vann. Revers transkripsjon ble utført på en T profesjonell PCR System (Biometra, Tyskland) etter produsentens protokoll.
Real-time PCR ble utført i duplikat og inkluderte ingen mal negative kontroller. For 20-ul reaksjon, ble cDNA (3 mL) kombinert med 10 ul 2 x TaqMan PCR Universal Master Mix uten uracil-N-glykosylase, 1 ul av den TaqMan® miRNA analyseblanding, og 6 pl av vann. Amplification ble utført på en 7500 Real-Time PCR system (Applied Biosystems) etter produsentens protokoll. Uttrykket nivåer av miRNAs ble normalisert til nagler i cel-MIR-39, og ble beregnet ved hjelp av metoden.
Statistisk analyse
Det parede
t
test ble brukes til å undersøke forskjellen i gjennomsnittlig alder mellom gruppene. Den Wilcoxon test eller Mann-Whitney U-test ble brukt for å sammenligne serum miRNA nivåer av ulike grupper der det er hensiktsmessig. ROC-kurver ble etablert for å vurdere diagnostiske effekter av mirnas, og generalisert lineær modell med gjentatte målinger ble benyttet for å analysere de time trender av serum miRNA nivåer under GC utvikling etter logaritmisk transformasjon. Alle
P
verdiene var tosidig og mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av statistikkprogrammet for samfunnsvitenskap (SPSS 13.0, Chicago, IL).
Resultater
emne egenskaper
Totalt 82 GC pasienter, 46 forsøkspersoner med DYS, og 128 kontroller med SG eller mild CAG ble inkludert i denne studien. Som vist i tabell 1, var det ingen signifikant forskjell i alder mellom pasienter med GC eller DYS og tilhørende kontroller (
P
= 0,329 og 0,214, henholdsvis).
miRNA profilering
De forskjellig uttrykt mirnas ble identifisert i serum bassenger av 14 GCer og 14 kontroller ved hjelp av TaqMan lav tetthet array. Blant 377 mirnas analysert, 99 viste 2-ganger oppregulert og 40 viste 0,5 ganger downregulated endringer i GC serum (tabell S1). Seksten oppregulert mirnas (MIR-221, MIR-744, MIR-376c, MIR-191, MIR-27a, la-7e, MIR-27b, MIR-222, MIR-21, MIR-18a, MIR-19a, speil 17, MIR-106b, MIR-106a, MIR-20a, og MIR-155) som viser bemerkelsesverdige uttrykk endringer i GC serum og har funksjonelle eller differensial uttrykk rapporter i GC vev ble valgt som kandidater til knyttneve-scenen validering [21] – [28]
Første etappe validering
uttrykk for 16 kandidat mirnas ble målt i individuelle serumprøver av 14 GCer og kontroller som ble brukt for utvalg test.. Konsekvent med profilering resultater, alle 16 mirnas viste høyere serumnivåer i GC-gruppen enn i kontrollgruppen (figur S1). Blant dem, 9 serum mirnas (MIR-221, MIR-744, MIR-376c, MIR-191, MIR-27a, la-7e, MIR-27b, MIR-222, og MIR-21) hadde 2 gjennomsnittlig fold endring i GC gruppen sammenlignet med kontrollgruppen (
P
0,05), og ble dermed valgt for ytterligere validering
Second-trinns validering
Vi har undersøkt ni miRNA. uttrykk på et stort sett med serum fra 68 par av GC og kontroll. Som vist i figur 2, 8 av de 9 mirnas (MIR-221, MIR-744, MIR-376c, MIR-191, MIR-27a, la-7e, MIR-27b, og MIR-222) viste signifikant forhøyede nivåer i GC gruppen med mer enn 2 ganger endring (
P
0,05)., og disse mirnas ble valgt for de følgende analysene
median økning endringer av miRNA nivåer sammenligne GC med kontroll ble gitt og Wilcoxon tester ble utført for å undersøke forskjellen mellom to grupper. De relative nivåer av mirnas (log10 skala på Y-aksen) ble normalisert til den piggete-in cel-MIR-39.
Risikovurdering av GC tilfeller der et panel av miRNAs
for å evaluere den diskriminerende virkning av serum mirnas på GC, ble ROC-kurver for hvert av de 8 mirnas ved hjelp av 68 parene av GC og kontroll i det andre trinnet validerings (figur 3). Resultatene viste at MIR-744, MIR-376c, MIR-221 og la-7e gitt de største områdene under ROC-kurven (AUC) og kan ha potensial som biomarkører for GC deteksjon.
Serum (A ) MIR-744, (B) MIR-376c, (C) MIR-221 og (D) la-7e gitt de største områdene under ROC-kurven (AUC).
Risikovurdering basert på de fire mirnas ble brukt til å skille serumprøver fra GC tilfeller fra kontroller. For hver miRNA, vi først beregnet den optimale cut-off verdien av den relative uttrykket nivået (MIR-744: 5,49 × 10
-4, MIR-376c: 6.05 × 10
-4, MIR-221: 1,47 x 10
-3, la-7e: 1,61 x 10
-3), ved hvilken Youden indeks (sensitivitet + spesifisitet-1) for GC diagnose var størst ved ROC-kurven. Deretter delte vi temaet inn i en høyrisikogruppe, som representerer mulige GC fall, når serum nivået på noen av de fire mirnas var lik eller større enn den tilsvarende cut-off verdi, og en lav-risiko-gruppen, som representerer kontroll når serumnivåene av alle de fire mirnas var mindre enn de grenseverdier.
Ifølge denne vurderingskriterium, 56 GCer og 32 kontroller ble korrekt spådd som GC og ikke-GC tilfeller produsere følsomhet av 82,4% og spesifisiteten av 47,1%. Siden la-7e demonstrerte den minste verdien og bredeste konfidensintervall av AUC blant de fire mirnas i ROC-kurven analyse (figur 3), gjentas vi den ovenfor risikovurdering etter eksklusiv la-7e og oppnådde en høyere spesifisitet (40/68, 58.8 %), mens følsomheten forble uforandret, hvilket indikerer at bidraget fra la-7e for å skille GCer fra kontrollene var ubetydelig, og den tre-miRNA panel (MIR-221, MIR-376c og MIR-744) var en mer effektiv kombinasjon av biomarkører for GC diagnose.
for ytterligere å undersøke potensialet i dette panelet for tidlig deteksjon av GC, vurdert vi en undergruppe av 30 GC pasienter i tidlig stadium, og 22 ble korrekt spådd som GC tilfeller med følsomheten til 73,3% .
sammenhengen mellom serum miRNA uttrykk og differensierings graderinger av GC
i tillegg søkte vi å undersøke sammenhengen mellom uttrykk nivåer av MIR-221, MIR-744 og MIR-376c, og differensiering karakterer av GC. Som vist i figur 4A-C, alle tre mirnas viste høyere serumnivåer i dårlig differensiert GC gruppe (43 GCer inkludert 29 mannlige og 14 kvinnelige, alder, 60 (SD 8,3) år) enn i brønnen eller moderat differensiert GC gruppe (24 GCer inkludert 19 mannlige og fem kvinnelige, alder, 60 (SD 6,2) år). Blant dem, serum MIR-221 og MIR-376c viste signifikant positiv sammenheng med dårlig differensiering av GC (
P
= 0,006 og 0,004, henholdsvis).
(A-C) Boksplott av serum MIR-221, MIR-376c og MIR-744 nivåer i 24 godt eller moderat differensiert og 43 dårlig differensierte GC pasienter. (D-F) Boksplott av serum MIR-221, MIR-376c og MIR-744 nivåer i 46 dys fag og matchet kontroller. Mann-Whitney U-test (A-C) og Wilcoxon testene (D-F) ble utført for å undersøke forskjellen mellom to grupper, henholdsvis. De relative nivåer av mirnas (log10 skala på Y-aksen) ble normalisert til den piggete-in cel-MIR-39 (A-F).
Expression nivåer av serum miRNA biomarkører hos personer med DYS
for ytterligere å belyse relevansen av disse tre mirnas med premaligne gastrisk lesjon, undersøkte vi deres uttrykk i 46 par av DYS og kontroll. Som vist på figur 4D-F, ble et signifikant høyere nivå av MIR-221 som finnes i DYS gruppe sammenlignet med kontroller (
P
= 0,027), mens ingen signifikant forskjell ble funnet for MIR-376c eller speil 744. Videre risikovurdering analyse følgende tidligere etablerte prosedyrer avdekket at denne tre-miRNA panel kunne skille DYS fra kontroll med sensitivitet på 56,5% og spesifisitet på 47,8%.
Dynamiske endringer i serum miRNA biomarkører under GC utvikling
i retrospektiv studie, ble de dynamiske endringene i de tre serum miRNA biomarkører oppdaget på 58 GC pasienter som ble delt inn i fire grupper i henhold til tidsintervallet fra blodprøvetaking til GC diagnose: pre-diagnose 2-5 år , 6-9 år, 10-14 år og ≥15 år grupper (tabell 2). Noen fag kan samtidig finnes i to eller flere enn to grupper siden de ga serumprøver i flere tidspunkter i oppfølgingsperioden.
Som vist i figur 5A, alle tre serum mirnas vises markert økende ekspresjon i løpet av GC utvikling, bortsett fra svak økning av serum MIR-744 i pre-diagnose ≥15-år gruppe. Videre trend testen viste en statistisk signifikant lineær trend i de tre miRNA nivåer mellom 20 GC pasienter som har bidratt tre serumprøver på ulike tidspunkter i løpet av oppfølgingsperioden (figur 5B).
(A) I den retrospektive studien, miRNA nivåer ble undersøkt i pre-diagnose serumprøver av 58 saker som ble klassifisert i fire grupper i henhold til tidsintervallet mellom blodprøvetaking og GC diagnose. (B) Trend tester av miRNA nivåer over tid ble utført i 20 GC tilfeller som har gitt tre serumprøver på tre tidspunkter for oppfølging (i årene 1989, 1992 og 1999, eller i årene 1989, 1994 og 2003). De gjennomsnittlige verdier av relative miRNA nivåer som var normalisert til piggete-in cel-MIR-39 og forvandlet på en logaritmisk skala ble vist med feil bar som representerer 95% KI (A-B).
til slutt, evaluert vi potensialet av miRNA biomarkører for tidlig prediksjon av GC i 29 pasienter, som hadde gitt serumprøver tatt 2-5 år før GC diagnose. Ifølge risikovurdering kriterium etablert før, ble 23 av de 29 GC pasienter (79,3%) riktig klassifisert som de representerte GC tilfeller av denne tre-serum miRNA panel.
Diskusjoner
Målet med denne studien var å identifisere differensial mirnas i serum hos GC og DYS, og undersøke potensialet av serum mirnas som biomarkør for tidlig deteksjon av GC. Vi fant signifikant forhøyede nivåer av serum MIR-221, MIR-376c og MIR-744 i GC pasienter gjennom systematisk microarray-basert screening og to-trinns validering. Denne tre-serum miRNA panel kunne skille GCer fra kontroller og viste en økende trend i løpet av GC utvikling. Så langt vi kjenner til, er dette den første populasjonsbasert studie i å utforske de dynamiske endringer i serum mirnas forbundet med GC og dets forløpere i en høy risikoområde for GC.
Forekomsten av GC varierer mye over hele verden med de høyeste tallene forekommer i Øst-Asia, inkludert Japan, Korea og Kina [1], [2]. I Kina, er de fleste av GCer diagnostisert på avanserte stadier som resulterer i dårlig prognose med en gjennomsnittlig 5-års overlevelse 30%, mens i Japan og Korea over 60% av GCer er diagnostisert på et tidlig stadium av community-baserte endoskopisk screening med 5-års overlevelse 80% [29], [30]. Selv om effekten av tidlig deteksjon av GC ved endoskopisk screening er betydelig i Linqu, har det vært bare noen få populasjonsbasert screening for GC i Kina på grunn av høye kostnader og mangel på dyktige endoscopists.
GC er en ende resultatet av flertrinns helsefare med ulike biologiske funksjoner, som gir en mulighet til å oppdage GC i tidlig stadium ved hjelp av biomarkører. I vår tidligere studie har vi funnet at forholdet mellom serum PG I /II monotont falt med alvorlighetsgraden av gastriske lesjoner, men sensitivitet og spesifisitet for å forutsi avanserte gastriske lesjoner og GC var dårlig [31]. Nylig, samler bevis indikerte at mirnas spiller viktige roller i onkogenese, og tumor-avledede mirnas kan komme inn i sirkulasjonen i en bemerkelsesverdig stabil form [11], [32], [33], som tyder på at mirnas kunne brukes som nye ikke-invasiv biomarkører for tidlig deteksjon av GC.
Mer nylig en studie identifisert fire oppregulert GC-forbundet mirnas (MIR-17-5p, MIR-21, MIR-106a og MIR-106b) [34], som også vises høyere uttrykk nivåer i GC serum på vår rekke, mens slående nedregulering av la-7a i sin studie ikke ble observert av oss. En annen studie fant fem forhøyet serum mirnas (MIR-1, MIR-20a, MIR-27a, MIR-34 og MIR-423-5p) i GC pasienter [13], mens bare MIR-20a og MIR-27a ble oppregulert på vår array, og MIR-27a ble validert for å bli bemerkelsesverdig uttrykt i GC pasienter. De delvis inkonsekvente resultater kan reflektere forskjeller i prøvetyper, screening verktøy eller kvantifisering metoder [35].
Blant de tre serum mirnas identifisert i vår studie, MIR-221 er funnet unormalt oppregulert i vev av mange kreft typer, for eksempel gastrisk [24], kolorektal [21], prostata [36] og brystkreft [37]. MiR-221 kunne legge-transcriptionally undertrykke p27 og p57, og dermed tilrettelegge G1 /S faseovergangen og styrke celleproliferasjon og tumorvekst [24], [36], [38], [39]. Studier har vist at ekspresjonsnivået av MIR-221 i plasma ble forbundet med total overlevelse av kolorektal kreft [40] og progresjon av prostatacancer [41]. Bare noen få studier har utforsket den funksjonelle relevansen av MIR-376c, som MIR-376c kan forbedre spredning, overlevelse og chemoresistance av eggstokkreft celle ved å målrette ALK7 [42]. For MIR-744, dens uttrykk mønster, fysiologiske funksjon og forholdet til kreftutvikling er ukjent.
I vår nåværende studie, fant vi denne tre-miRNA panel kunne skille serumprøver av GC fra kontroller med en følsomhet på 82,4% og spesifisitet på 58,8%. I tillegg vår studie viste at blant 30 tidlig stadium GC pasienter, ble 22 (73,3%) riktig klassifisert, noe som tyder på dette panelet kan tjene som en biomarkør for tidlig deteksjon av GC. Det reiser også muligheten for at dette panelet av miRNAs kan være nyttig som en foreløpig screening metode for GC i befolkningen har høy risiko for GC.
Vi var også interessert i å utforske assosiasjoner mellom disse tre serum mirnas og differensiering graderinger av GC. Ved å sammenligne miRNA nivåer i serum av GC pasienter med ulike karakterer, fant vi en høyere serum miRNA uttrykket i dårlig differensiert GC. Dette resultatet viser at høyt uttrykk nivå av disse serum miRNAs i GC pasienter ble assosiert med avansert stadium av GC. Selv om mekanismen for dette fenomenet er uklart, kan det høye nivået av disse miRNAs i serum har noen verdi for å indikere progresjon og behandling utvalg av GC.
Vi videre vurdert om denne tre-miRNA panel kunne forutsi avansert mage lesjoner, slik som DYS. Vi fant bare MIR-221 vises en forhøyet uttrykk nivå i DYS, noe som tyder på dette panelet var mer spesifikke for GC. Til tross for den begrensede virkningen av dette panelet på DYS deteksjon, MIR-221, en av de tre serum mirnas, kan være nyttig for å identifisere de fagene dys ved ekstremt høy risiko for å utvikle GC. Interessant, ved prospektivt spore utviklingen av disse dys fag, vi fant den lavere prisen regresjon til de mindre alvorlige skader og en hendelse GC i spådd høyrisikogruppen som hadde høyere nivå av serum MIR-221 (data ikke vist).
etter retrospektivt å undersøke uttrykket av tre serum miRNAs i pre-diagnose prøver av GC pasienter, fant vi en økende trend i løpet av GC utvikling, og videre analyse indikerte at dette panelet kan forutsi GC opp til 5 år i forkant av klinisk GC diagnose. Disse resultatene støttes sterkt verdien av disse tre mirnas for å forutsi GC forekomst. Kombinere dette tre-serum miRNA signatur med patologisk diagnose kan forbedre tidlig deteksjon av GC hos pasienter med avansert helsefare, slik som IM og DYS.
For å utelukke muligheten for at økt alder og kortere lagringstid av serumprøver bidro til høyere nivå av miRNAs over tid, analyserte vi miRNA uttrykket i 82 kontroller som gjennomgikk blodprøvetaking på samme tidspunkt med GC pasienter. Ingen signifikant forskjell ble observert under oppfølgingsperioden (data ikke vist), noe som tyder på at den økende serum miRNA nivåer i hele GC utvikling ikke kunne tilskrives økende alder og støtte det mirnas var til stede i serum i en stabil form. Følgelig kan sirkulerende mirnas brukes som en biomarkør for å utvikle en ikke-invasiv test for GC deteksjon i fremtiden på grunn av sin enkle tilgjengelighet, høy stabilitet og lav analysen kostnader.
Vår studie har flere sterke sider. For det første, alle fag kom fra et høy-risiko populasjon av GC og gjennomgikk streng patologisk diagnose, som begrunnet vår hypotese om at den observerte forskjell i serumnivåer mellom miRNA GCer og kontroller kan tilskrives det meste, om ikke alt, til neoplastisk transformasjon. Dernest vår populasjonsbasert studie med en høy etterlevelse og mer enn 20 års oppfølging forbedret påliteligheten av studien, og gitt den første bevis på dynamiske endringer i serum mirnas under GC utvikling samt deres potensial som biomarkører for å identifisere høyrisiko individer av GC.
Denne studien har også noen begrensninger. Fordi svært få fag ble diagnostisert med normal mageslimhinnen hos denne pasientgruppen [17], brukte vi personer med SG /mild CAG som kontroller. Men sammenlignet med studier med generelt normale personer som kontroll, vår patologisk diagnose basert kontroll utvalg strategi utvannet misforholdet mellom saker og kontroller, og dermed kunne bare føre til undervurdering av resultater. I tillegg funnene i denne forstudie med liten utvalgsstørrelse kreve ytterligere bekreftelse i store prospektive studier og funksjonelle relevansen av den nylig identifiserte mirnas må videre avklares.
I konklusjonen, gjennom denne populasjonsbasert studie vi identifisert et sett av differensialserum mirnas (MIR-221, MIR-376c og MIR-744) i GC og foreslo sitt potensial som nye ikke-invasive biomarkører for tidlig deteksjon av GC.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Serumnivåer av de 16 utvalgte mirnas i 14 par av GC og kontrollpersoner i den første fasen validering. Median økning forandringer av miRNA nivåer sammenligner GC med kontroll ble gitt og Wilcoxon tester ble utført for å undersøke forskjellen mellom to grupper. De relative nivåer av mirnas (log10 skala på Y-aksen) ble normalisert til den piggete-in cel-MIR-39
doi:. 10,1371 /journal.pone.0033608.s001 plakater (JPG)
Table S1.
doi: 10,1371 /journal.pone.0033608.s002 plakater (XLS)
