Abstract
Signal unormalt i menneskeceller vanligvis forårsake uventede konsekvenser for den enkeltes helse. Vi fokuserer på slike hendelser som er involvert i JAK-STAT signalveier, spesielt de som er utløst av avvikende aktivert STAT3, et oncoprotein som deltar i viktige prosesser i celle overlevelse, vekst og spredning i mange typer svulster, samt immunsykdommer. Ved å etablere en STAT3 signal basert high-throughput narkotika screening system i human lunge kreft A549 celler, har vi vist et bibliotek fra naturlige produkter som inneholdt rensede forbindelser fra medisinske urter. En forbindelse, kalt Brevilin A, oppviste både sterk STAT3 signal inhibering og STAT3 signalavhengig hemming av cellevekst. Videre undersøkelser viste at Brevilin A ikke bare inhiberer STAT3 signalering, men også STAT1 signalering for cytokiner indusert fosforylering av STAT3 og STAT1, så vel som ekspresjon av deres målgener. I tillegg fant vi Brevilin En kunne dempe Jaks aktivitet ved å blokkere Jaks tyrosinkinasedomene JH1. Nivåene av cytokin indusert fosforylering av statistikk og andre substrater ble dramatisk redusert ved behandling av Brevilin A. roller Brevilin En målretting på Jaks aktivitet indikerer at Brevilin En kan ikke bare brukes som en STAT3 inhibitor men også et sammensatt blokkerer andre JAK- STAT hyperaktive. Dermed disse funnene ga en sterk drivkraft for utvikling av selektive JAK-STAT-hemmere og terapeutiske legemidler for å forbedre overlevelse av pasienter med hyperactivated Jåks og statistikk
Citation. Chen X, Du Y, Nan J, Zhang X, Qin X, Y Wang, et al. (2013) Brevilin A, en Novel naturlig produkt, Hemmer Janus kinase aktivitet og blokker STAT3 signale i kreftceller. PLoS ONE 8 (5): e63697. doi: 10,1371 /journal.pone.0063697
Redaktør: Mark Jackson, Case Western Reserve University, USA
mottatt: 09.11.2012; Godkjent: 05.04.2013; Publisert: 21. mai, 2013
Copyright: © 2013 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd 1104FK CA123 fra The Science and Technology Support prosjekt Gansu Providence til QW; 2009DFA30990 fra departementet for vitenskap og teknologi av Folkerepublikken Kina, 0708WCGA149 fra Gansu Provincial Science and Technology og 2009AA01A130 fra National Natural Science Foundation i Kina for å J.Y. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
omrisset av JAK-STAT signalveien har blitt ferdig nesten 20 år siden [1]. Flere studier ble deretter fortsatte for signal detaljer inkludert protein interaksjoner, post-modifikasjoner, transkripsjons forskrifter og fysiologiske effekter. Janus kinase (JAK) familie inneholder fire tyrosinkinase medlemmer, inkludert JAK1, JAK2, JAK3 og Tyk2, som transduce cytokin-indusert signaler via Signal Givere og aktivatorer av transkripsjon (statistikk). Vanligvis ble reseptor forbundet Jåks aktivert ved reseptor-dimerisering i nærvær av cytokiner. I mellomtiden statistikk i cytoplasma ble rekruttert til reseptorene og fosforylert av Jaks. Tyrosin fosforylerte statistikk dannet homo- eller heterodimerer gjennom fosfotyrosin-SH2 interaksjoner, og translocated inn i kjernen for å initiere transkripsjoner av målrettede gener [2]. Unormal aktivitet av JAK-STAT signaler har vært ansett for å være adresse til mange sykdommer, inkludert kreft og immunforstyrrelser. Aberrert stats aktivitet korrelerer vanligvis med forskjellige typer av tumorvekst og progresjon av forskjellige kreft maligniteter, både som respons på cytokiner og av mutante protein tyrosin-kinaser. Av de syv STAT familiemedlemmer (STAT1-STAT6, med to uavhengige gener kodet STAT5A og STAT5B), Stat3, samt STAT5 til en viss grad, er oftest aktivert i ganske mange menneskelige solide svulster og leukemi [3] – [5 ].
I mange Stat3 konstituerende aktivert kreftceller, enten dyrkede humane tumorceller eller genererte mus modeller, blokkering STAT3 signale vil hemme cellevekst, indusere apoptose og redusere celle metastasering. I glioma eller glioblastom-celler [6], [7], bryst carcinoma celler [8], coloncancere [9], squamous cell avledet svulster [10], prostatakreftceller [11] – [13] og melanomer [14], [15], målretting forstyrrelse av STAT3 aktivitet ved å forstyrre RNA, uttrykker dominerende negative Stat3 skjemaer eller bruke spesifikke signalhemmere ville bemerkelsesverdig ned regulere STAT3 induserte gener, inkludert CyclinD1, BCL-XL, c-myc, survivin og andre gener som regulerer cellesykluser og celleproliferasjon, og deretter senere redusere cellevekst og øke celle apoptose [16], [17]. Metastase er den viktigste årsaken til dårlig prognose og Caner relaterte dødsfall sammenlignet med svulst opprinnelse og svulst vekst. STAT3 nå har vært ansett som en av de kritiske oncoproteiner som medierer regulering av celle invasjon og tumor mikromiljøet. I menneskelige kolorektal kreft, ble STAT3 aktivert i de som fikk dårlig prognose [18]. Proteiner involvert i migrering og invasjon av kreftceller, slik som matriks-metalloproteinaser (. MMP-1, MMP-2, MMP-10,
el
) og Twist, ble regulert ved aktivering STAT3 [19] – [21] . Et IL-6 indusert JAK /STAT3 signale var avgjørende for infiltrering av sirkulerende kreftceller. Tumor-avledet IL-6 hjelper sirkulerende brystcancer og melanom for å re-etablere
in situ
eller ved fjernmetastaser regioner [22]. Nylig har det blitt rapportert at vedvarende aktivert STAT3 opprettholdt NF-kB aktivitet gjennom P300 mediert trasé. NF-kB aktivitet dramatisk redusert med STAT3 RNAi i mange Stat3 konstituerende aktiverte kreftceller [23], noe som tyder på at Stat3 hemmere kan også spille potensielle roller i blokkering NF-kB aktivitet og styrke veksthemming i disse kreftcellene.
utforske JAK-STAT signal hemmere spesielt Stat3 hemmere av høy gjennomstrømming narkotika screening (HTS) er en effektiv måte å oppdage potensielle bestemte legemidler rettet mot på STAT3 eller oppstrøms JAK kinaser.
Min N. Chau Hotell og kolleger utviklet en prostatakreft cellelinje som inneholdt en STAT3 reporter konstruere for høy gjennomstrømming screening av Stat3 aktivatorer og hemmere [24]. Her har vi etablert en lignende STAT3 signalering basert luciferase reporter screeningssystem i en human cancercellelinje lunge A549, som viser konstitutive aktivert STAT3 aktivitet og kan bli ytterligere indusert av cytokiner som IL-6, EGF, og HGF [25]. Ved screening, Brevilin A, en roman naturlig produkt, viste signifikant JAK-STAT signale hemming uten umiddelbar direkte celle toksisitet fra 1.400 flere forbindelser som opprinnelig ble isolert fra planter, hvorav de fleste var kjent som urtemedisiner. Brevilin En har foretrukket cellevekst inhibering av DU145 og MDA-MB-468, disse vekster er avhengig av STAT3 signalering [17], [26]. Videre undersøkelser viste at Brevilin En blokkert aktivitet av Janus kinase Tyrosin kinase JH1 domene, og deretter redusert fosforylering av nedstrøms effektorer. Brevilin En kan fungere som en potensiell narkotika målretting på sykdommer forårsaket av JAK-STAT unormalt.
Materialer og metoder
Antistoffer og reagenser
Antistoffer mot STAT3, JAK2, pTyr705- STAT3, pTyr701-STAT1, pSer473-AKT, pSer9-GSK-3β, c-myc, CyclinD1, PARP, pTyr1007 /1008-JAK2, pTyr1054 /1055-TYK2, pSer536-p65 og p65 ble hentet fra Cell Signaling Technology; Antistoffer mot c-Src, pTyr (PY99), GAPDH og Hans-tag ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology, Inc .; pGL4.20 vektor og luciferase underlaget Steady Glo ble oppnådd fra Promega; M-MLV første tråd cDNA syntese kit ble oppnådd fra Invitrogen, Life Technologies Corporation; PD180970, AG490, Staurosporin, doxorubicin, ATP og EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity perler ble kjøpt fra Sigma-Aldrich; Interleukin-6 (IL-6), interferon α (IFNα) og interferon γ (IFNy) var fra Peprotech. Ni
+ affinitetskromatografiske perler ble hentet fra GE Healthcare og biovitenskap. 10 × PK kinasebuffer ble oppnådd fra New England Biolabs (NEB).
Plasmider og cellelinjer
En sekvens som inneholder 16 × SIE pluss med en TATA-boksen ble satt inn pGL4.20 mellom KpnI og Hindlll. Den SIE-luc-puro konstruksjonen ble transfektert inn i A549-cellelinjen. Førti-åtte timer etter transfeksjon ble cellene valgt med 5 mikrogram /ml puromycin i 2 uker, deretter 2,5 mg /ml for en annen 2 uker. Kloner ble plukket opp og analyseres hver for seg. Sekvenser som koder for human JAK1-JH1 domene, JAK2-JH1 domene, JAK3-JH1 domene, Tyk2-JH1 domene og c-Src ble klonet inn i PLV-SV40-puro lentivirus ekspresjonsvektor separat. Andre sekvenser av Flag-Hans to tags ble smeltet ved C-terminalen av hver Jaks-JH1 domene. c-Src ble smeltet sammen med ett flagg signal ved C-terminalen. Hver av ovennevnte konstruksjoner ble transfektert inn HEK293T kombinert med PMD-2.G og pCMV-dr8.74 hjelpe vektorer for virus emballasje. Supernatant medium ble samlet opp etter 48 timer og anvendt for å infisere HEK293T over natten, deretter erstattet med friskt medium i ytterligere 24 timer. Stabile celleforråd ble utvalgt i nærvær av puromycin (2,5 ug /ml) i 7 dager.
Cell Culture
Cellene ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle medium supplementert med 10% føtalt bovint serum ( FBS), penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 mikrogram /ml).
Drug screening
Naturlige produkter for narkotika screening var fra det opprinnelige biblioteket leverandør for (National forbindelse Resource Center dette instituttet var BioBioPha Co., Ltd.). Forbindelser fra naturprodukter (10 mM) ble fortynnet med DMEM (10% FBS) til 100 mikrometer (Fortynnede Compounds). A549R celler for legemiddelscreening ble sådd ut i 96-brønners plater i en tetthet på 1 x 10
4 (100 ul /brønn i DMEM med 10% FBS). Tolv timer senere ble 25 ul fortynnede forbindelser med 75 ul frisk DMEM (10% FBS) ble tilsatt til hver separert godt i ytterligere 24 timer for 1
st runde screening ved en konsentrasjon på 25 uM. 12,5 ul Fortynnede Forbindelser med 87,5 ul frisk DMEM ble tilsatt til 2
nd runde screening ved en konsentrasjon på 12,5 uM. DMSO ble brukt som kjøretøy (0,25% i en
st rundt screening og 0,125% i 2
nd rundt screening). IL-6 (250 ng /ml) og PD-180970 (250 nM) ble anvendt som kjent stimulator og inhibitor for å kontrollere systemresponsen for hver runde med screening i en enkelt plate. Systemet svaret ville bli betraktet som normalt når IL-6 induserer mer enn 2,5 ganger fluorescens og PD-180970 viser 40% -50% fluorescens hemming i hver runde screening. Vi brukte en counterscreen ved å anta at den kjente inhibitor PD-180970 har betydelig signal inhibering, og potensielle inhibitorer vil alltid ha bedre ytelser enn PD-180970. Siden den positive kontrollen PD-180 970 (250 nM) alltid viste en fluorescens ratio omtrentlig på 50% og kan hemme STAT3 fosforylering betraktelig når bedømt av Western-Blot analyse, valgte vi 50% som en «cut off» verdi, så enhver forbindelse som viser en fluorescens forholdet mellom kontrollceller ≤50% (
dvs.
fluorescence hemming ≥50%) vil bli plukket ut. Detaljene er som følger: Trinn 1, 1
st rundt screening, One godt One sammensatte, 25 mikrometer, luciferase assay bare. Forbindelser ble plukket ut når SV (fluorescens Ratio) er ≤50%. Etter dette trinnet, kan de plukket forbindelser inkluderer noen altfor giftige seg. For å utelukke fluorescens hemming forårsaket av cytotoksisitet, ble Step2 brukt. Trinn 2, 2
nd rund screening, 12,5 pM av hver forbindelse fra trinn 1, og to gjentakelser for luciferase og MTT-analyser ble anvendt. Hvis FR% er ≤50% Δ (CV% – FR%) er ≥30%, vil forbindelsene bli plukket ut for videre analyser. De altfor giftige forbindelser ble utelatt av dette trinnet. Avviket «30%» er en empirisk verdi som var i stand til å skille altfor giftige forbindelser og spesifikke forbindelser. Her, FR, Fluorescens Ratio = fluorescens verdien av behandlet godt dividert med fluorescens verdi av kontroll i tillegg; CV, celleviabilitet = Cell overlevelsesverdi for behandlet godt delt Cell overlevelsesverdi av kontroll i tillegg; Luciferase-analysen ble utført i Fluorescence verdi; MTT-analysen ble utført i celleoverlevelsesverdi. (Prosent av fluorescens hemming = 100% – FR%, Andel Cell veksthemming = 100% – CV%).
For luciferase assay, 50 pl luciferase underlaget Steady Glo ble tilsatt (50 ul /brønn) . Etter 10 minutter inkubasjon ble fluorescens målt ved Vector3 Multilevel Plate Counter (Perkin Elmer). For MTT-analysen celleviabilitet, 20 ul MTT-løsning (5 mg /ml i PBS) ble tilsatt i 4 timer inkubasjon. De resulterende krystaller ble oppløst i 100 ul DMSO og absorbansen ble målt intensitet ved Vector3 ved 490 nm bølgelengde.
Western-Blot, Immunoutfellingsunder og cellefarging
Cellene ble vasket med iskald PBS tre ganger og lysert med RIPA-lysebuffer i 30 minutter ved 4 ° C (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% natriumdeoksycholat, 0,1% SDS, 50 mM Tris, pH 7,5, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA 1 × proteasehemmer cocktail (Roche), 1 × fosfatase inhibitor cocktail (Roche)). Lysatene ble sentrifugert ved 12.000 x rpm i 10 minutter ved 4 ° C. Like mengder proteiner, bestemt ved BCA-metoden (Pierce, Thermo), ble deretter separert ved SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner (Millipore, Merck). Proteiner ble påvist med angitte antistoffer.
HEK293T-celler som uttrykker Flag merket Src ble forbehandlet med DMSO, PD180970 (500 nM) og Brevilin A (15 uM) i 4 timer separat. Cellene ble vasket med iskald PBS tre ganger og lysert med 500 ul lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, pH 7,4) i nærvær av protease inhibitor cocktail og fosfatase inhibitor cocktail. Lysatene ble sentrifugert ved 12.000 x rpm i 10 minutter ved 4 ° C. Like mengder proteiner ved BCA metoder, ble deretter inkubert med ANTI-FLAG M2 Affinity perler i 8 timer ved 4 ° C. Src-protein prøver ble eluert med 0,1 M glycin-HCl, pH 3,5 og nøytralisert med Tris-HCl (0,5 M, pH 7,4).
For apoptose-analysen ble cellene sådd ut i 24-brønners plater. Tolv timer senere ble mediet fjernet og erstattet med friskt medium i nærvær av 10 uM Brevilin A i 24 timer. Cellene ble deretter underkastet en Annexin-V-PI dobbel fargeprosess som i protokollen av Annexin V-FITC Apoptose Detection Kit (Beyotime Institute of Biotechnology).
Protein Purification og kinaseanalyse
C-terminal His-tagget hSTAT3 rekombinant protein ble uttrykt i
E.coli
,
Rosetta Hotell og renset ved Ni
+ affinitetskromatografi.
hstat3
CDS ble klonet inn i pET28b, og indusert med 0,5 mM isopropyltio-β-galaktosid ved 37 ° C i 6 timer. Inklusjonslegemer ble sentrifugert ved 12 000 x rpm i 10 minutter ved 4 ° C etter ultralydbehandling på hele
E.coli
celler. Deretter inklusjonslegemer ble lysert med lyseringsbuffer (0,5 M NaCl, 20 mM natriumfosfat, 20 mM imidazol, 8 M urea, pH 7,5). Ni
+ affinitet kromatografi perler ble deretter brukt for utfoldet His-tagget hSTAT3 bindende. On-kolonnen ble Refolding valgt og til slutt refoldet STAT3 proteinet ble eluert med elueringsbuffer (0,5 M NaCl, 20 mM natriumfosfat, 250 mM imidazol, pH 7,5). Etter en ionebytter-prosess, ble den renset hSTAT3 protein i PBS (10% glycerol) frosset for videre analyse.
Tilnærmet 5 x 10
8 HEK293T celler som uttrykker Flag-tagged His Tyk2-JH1 ble høstet og lyseres med lyseringsbuffer (0,5 M NaCl, 20 mM natriumfosfat, 20 mM imidazol, pH 7,5). Ni
+ affinitet kromatografi perler ble deretter brukt for Flag-His-tagget Tyk2-JH1 bindende. Protein ble eluert med 250 mM imidazol og fortynnet med ANTI-FLAG M2 Affinity perler bindingsbuffer og inkubert med M2 Affinity perler i 2 timer ved romtemperatur. Tyk2-JH1 protein ble til slutt eluert med PBS inneholdende 3 x FLAG-peptid (500 ng /ml, 30 minutter ved romtemperatur) for videre kinaseanalyse.
ca. 150 ng hSTAT3 protein og 20 ng Tyk2-kinase var JH1 pre-inkubert med 1 x kinase-buffer, i nærvær av konsentrasjonsrekke ved 10, 20, 40, og 80 uM, i 10 min. ATP ble tilsatt til reaksjonsblandingen ved en konsentrasjon på 200 uM til 50 ul endelig volum. Kinasereaksjonen ble deretter fortsatt ved 37 ° C i 2 timer, og den ble stoppet ved 5 x proteinprøve ladningsbuffer (95 ° C, 5 min). 20 mL av hver prøve ble lastet for SDS-PAGE og Western-blot analyse.
RT-PCR og kvantitativ real-time PCR
Totalt mRNA ble ekstrahert fra dyrkede celler med TianGen DNA rensing kit . Revers transkripsjon ble utført med M-MLV revers transkripsjon kit (Invitrogen, Life Technologies Corporation). Kvantitativ real-time PCR ble ferdig med Roche Cyber Grønn PCR miks kit på Biorad C1000 termosykler. Primerene for RT-PCR var som følger:
GAPDH
fremover 5′-TGGCAAATTCCATGGCAC-3 «, revers 5′-CCATGGTGGTGAAGACGC-3»;
socs3
fremover 5′-CCATGGTGGTGAAGACGC-3 «, revers 5′-CCTGTCCAGCCCAATACCTGA-3» [27];
IRF-en
forward5′-CGATACAAAGCAGGGGAAAA-3 «, reverse 5′-TAGCTGCTGTGGTCATCAGG-3» [28].
Dataanalyse og statistiske metoder
Hver analyse ble gjentatt som angitt. Relativ cellelevedyktighet ble uttrykt som en prosentandel (%) i forhold til de ubehandlede kontrollceller. Feilfelt representert standardavvik (± SD). Data ble analysert ved hjelp av ANOVA metoden for hver to-gruppe sammenligningstester. Blot og bildesignalintensitet ble kvantifisert ved hjelp ImageJ2X programvare. P-Stat3 og p-P65 fold endringer ble normalisert til henholdsvis total STAT3 og p65, mens p-AKT og p-GSK-3P endringene var normalisert til GAPDH.
socs3 Hotell og
IRF-en
mRNA nivå endringer ble normalisert til total
GAPDH
mRNA. Kvantifisering tall er representert i bunnen av blottene. Brett endringer av Annexin-V fluorescens ble normalisert ved celletelling. IC
50 (GI
50) ble beregnet ved SPSS19 programvare (regresjon-probit-metoden). Histogrammer og diagrammer ble trukket med Origin 8 programvare.
Resultater
Etablering av STAT3 signale baserte high-throughput narkotika screening system.
A549 cellene transfektert med luciferase reporter vektor, SIE-luc-puro, som inneholder gjentatte STAT3 responselementer (16 × SIE, sis-induserbar element,5′-TTTCCCGTAAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAAGCTCGCTAGCATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAATTCCTGTAAGCTCGAGGATATCAAGATCTAGACACTAGAGGGTATATAATGGAAGCTCGACTTCCAGCTT-3′) (Fig. S1). Stabile cellelinje A549R fra en enkelt klon ble valgt deretter. Denne klonen var i stand til reaksjon på både cytokiner og inhibitorer som er involvert i STAT3 signalering (fig. 1A). IL-6 indusert tilnærmet 5 x ganger fluorescens, og PD-180970 behandling viste ca. 50% inhibering av luciferaseaktivitet. konsentrasjonen av IL-6 og PD-180970 for behandlinger ikke påvirket cellevekst signifikant (fig. 1B). PD180970, den kjente Src kinase inhibitor, var i stand til å inhibere STAT3 aktivitet delvis i A549-cellelinjen som rapportert [25] (fig. 1C).
Luciferase (A) og MTT (B) analyser av A549R celler behandlet med PD-180970 (250 nM) og IL-6 (250 ng /ml), henholdsvis. A549R-celler ble sådd ut i 96-brønners plater i en tetthet på 1 x 10
4 (100 ul /brønn i DMEM med 10% FBS). Tolv timer senere ble mediene fjernet og erstattet . med frisk media i nærvær av IL-6 eller PD-180 970 linjer viser standardavvik (± SD) (tre uavhengige rapporter, n = 5 i hver rapport) *** p. 0,001, ** p 0,01, * p 0,05, vesentlig i forhold til kjøretøykontroll. NS, ingen statistisk signifikans. (C) PD-180970 inhiberer STAT3 aktivitet i A549R celler. A549R celler ble sådd og dyrket i 100 mm-retter på 70% samløpet. Da celler ble behandlet med PD-180970 (250 nM) i 24 timer. DMSO ble brukt som kontroll.
Identifikasjon av Brevilin A som en STAT3 Signa Inhibitor
Forbindelser (1440 totalt) fra naturlige produkter (tabell S1) ble screenet som beskrevet i
Materialer og metoder
. I en
st rund screening, også betraktes som en grov sikting, ble en forbindelse-en vel strategi ved en konsentrasjon på 25 uM anvendt. Ni forbindelser viste mer enn 50% fluorescens inhibering (tabell S2, verdier i rød). I 2
nd rund screening, ble 12,5 uM forbindelser valgt for ytterligere luciferase-analysen, samt for ytterligere MTT-cellelevedyktighet analyse. Bare én forbindelse, oppkalt Brevilin A (Fig. 2A, en pseudoguaiane sesquiterpene fra
Litsea glutinosa
, informasjon fra den opprinnelige leverandøren) viste fortsatt mer enn 50% fluorescens hemming, mens utstilt et avvik (mer enn 30% ) mellom celle-levedyktighet (CV) og fluorescens-forhold (FR). Vi spekulerer i at signal spesifikke hemmere bør utvise mer signal hemming enn hemming av cellevekst i løpet av 24 timer, og i to
nd runde screening, hvis FR% er ≤50% andΔ (CV% – FR%) er ≥30%, forbindelsene vil bli plukket ut for videre analyser (Tabell S3). Av de 9 forbindelser fra en
st rundt screening, bare Brevilin A møtte disse kriteriene (fig. S2). Det virket som vi kunne få samme resultat ved å evaluere Z score i en
st rundt screening (tabell S4). Western-Blot ytterligere bevist at Brevilin A blokkert STAT3 tyrosin 705 fosforylering i en konsentrasjon på referert 12,5 og 25 uM i 24 timer behandling i A549R celler (Fig. 2B). Signal-inhibering og cellelevedyktigheten ble deretter analysert ved hjelp av luciferase og MTT-assay ved serie konsentrasjoner av Brevilin En behandling etter 2C (Fig.) 24 timer. Brevilin En utstilt bedre STAT3 signaliserer hemming på en doseavhengig måte (IC
50 = 10,6 mm) enn celleviabilitet hemming innen 24 timer (GI
50 20 mm), noe som indikerer at det er et signal spesifikk hemmer mer enn en forbindelse som direkte dreper dyrkede celler basert på celletoksisitet. Vi valgte da konsentrasjoner rundt 10 mm for videre analyser.
(A) Oppbygging av Brevilin A. (B) Brevilin A hemmer STAT3 fosforylering i A549R celler. A549R celler ble sådd og dyrket i 100 mm skåler ved 70% samløpet. Cellene ble deretter behandlet med Brevilin A (12,5 uM og 25 uM) i 24 timer. DMSO ble anvendt som kontroll. (C) STAT3 signalering ble inhibert med Brevilin A på en doseavhengig måte. A549R celler ble sådd ut i 96-brønners plater i en tetthet på 1 x 10
4 (100 ul /brønn i DMEM med 10% FBS). Tolv timer senere ble mediet fjernet og erstattet med friskt medium i nærvær av Brevilin A ved forskjellige konsentrasjoner i ytterligere 24 h (20 uM, 17,5 uM, 15 uM, 12,5 uM, 10 uM, 7,5 uM, 5 uM, 2,5 uM og 1 mm). Luciferase og MTT-analyser ble utført da. Linjer viser standardavvik (± SD) (3 uavhengige rapporter, n = 5 i hver rapport).
Brevilin A hemmer konstitutivt Aktivert-STAT3 Driven DU145 og MDA-MB-468 celler
Menneskelig prostatakarsinom DU145 og brystkreft MDA-MB-468 cellelinjer viste konstituerende STAT3 aktivitet. Så spør vi om Brevilin En kan hemme STAT3 aktivitet i disse to cellelinjer. Figur 3A og B indikerte at Brevilin A inhiberer STAT3 signalisering i dose- og tidsavhengig måte i både DU145 (Fig. 3A) og MDA-MB-468 (fig. 3B). For å teste signal spesifikk hemming, var nivået på fosforylering av p65-Ser536, AKT-Ser473 og GSK-3β-Ser9 analysert. Interessant, gjorde Brevilin A ikke viser tilsvarende effekt på fosforylering av disse proteinene (Fig. 3A, 3B og 3C), noe som indikerer at Brevilin A ikke kan påvirke eller har mindre effekt på andre cellesignaler. Inhibering av STAT3 aktivitet vanligvis fører til nedregulering av målgener,
f.eks.
, C-Myc og CyclinD1 [17]. Her, etter behandling med Brevilin A i 24 timer og 48 timer, både c-Myc og CyclinD1 ekspresjon redusert i DU145 og MDA-MB-468-celler (Fig. 3D). Økt spaltet PARP ble også observert (fig. 3E), noe som indikerer at Brevilin A indusert DU145 og MDA-MB-468 apoptose etter 24 timers behandling [29]. Det er i samsvar med de rapporter som blokkerer STAT3 aktivitet førte til hemming av cellevekst i DU145 [30] og MDA-MB-468-celler [31]. Deretter cellelevedyktighet ble målt for DU145 og MDA-MB-468-celler, så vel som humane ikke-transformerte telomerase-udødelig fibroblaster BJ-celler (hTERT-BJ, en udødeliggjort normal cellelinje). hTERT-BJ-celler hadde lavere STAT3 aktivitet (Fig. 4A), og således ble anvendt som negative kontroll-celler. Etter behandling med Brevilin A i 24 h, 48 h og 72 h, Brevilin A viste mer signifikant hemming av cellevekst på DU145 og MDA-MB-468 enn hTERT-BJ både 5 uM og 10 uM konsentrasjon (fig. 4B, venstre og midten). Flere andre forbindelser, de mekanismene som var kjent på celle-levedyktighet, ble valgt som kontroller. AG490, en JAK-hemmer, kan hemme JAK-STAT signale avhengige cellevekst (
f.eks
, DU145 og MDA-MB-468.); Staurosporin, som er en kjent pan-tyrosinkinase-inhibitor [32], hemmer mange celleprosesser, og vanligvis viser ingen celletype spesifisitet; Doxorubicin, en vill brukt forbindelse, er i stand til å indusere celle apoptose og blokk cellevekst [33]. Ved å sammenligne effekter på cellelevedyktigheten blant DU145, MDA-MB-468 og hTERT-BJ celler etter 24 timer medikamentell behandling (Fig. 4B, rett histogrammet) viser AG490 lignende effekter (med Brevilin A) på disse cellene, mens Doxorubicin og Staurosporin hadde ingen spesifisitet på celle levedyktighet eller vekst blant disse cellene. Videre undersøkelser av Annexin-V flekker avdekket at Brevilin A viste en sterkere induksjon av apoptose for DU145 og MDA-MB-468 (ca 2,2 og 4,4 ganger i henholdsvis) enn hTERT-BJ (~1.3 fold) etter 24 timer behandling (fig. 4C).
STAT3 tyrosin-705-fosforylering ble inhibert med Brevilin A i dose (5 uM, 10 uM og 15 uM i 2 timer) og tiden (10 uM i 30 min, 60 min og 120 min) avhengige oppførsel i begge DU145 (A) og MDA-MB-468 (B) celler, mens fosforylering av p65-Ser536 (A og B), AKT-Ser473 og GSK-3β-Ser9 (C) ikke ble påvirket tilsvarende (10 uM, 2 h). (D) c-myc og CyclinD1 redusert etter 24 timer og 48 timer behandling med Brevilin A (10 uM). Celler ble sådd ut og dyrket i 100 mm skåler i 12 timer, deretter ble behandlet med Brevilin A som beskrevet. (E) Spaltet PARP økt i DU145 og MDA-MB-468 celler med Brevilin A (10 uM) behandling i 24 timer. DMSO ble brukt som kontroll.
(A) STAT3 tyrosin 705 fosforylering ble oppdaget i hTERT-BJ, DU145 og MDA-MB-468 celler. (B) venstre og midtre diagrammer, hTERT-BJ, DU145 og MDA-MB-468-celler ble platet i 96-brønners plater i en tetthet på 8 x 10
3 (100 ul /brønn i DMEM med 10% FBS) . Tolv timer senere ble mediene fjernet og erstattet med friskt medium i nærvær av Brevilin A (5 uM og 10 uM) i 24 timer, 48 timer og 72 timer, ble cellenes levedyktighet målt ved MTT-analyse. Høyre histogram og 12 timer senere ble cellene sådd ut, media ble fjernet og erstattet med friskt medium i nærvær av Brevilin A (10 uM), AG490 (100 uM), doxorubicin (1 uM) og Staurosporin (100 nM og 500 nM) etter 24 timer. Dox, doxorubicin. Sta, Staurosporin. Linjer viser standardavvik (± SD) (3 uavhengige rapporter, n = 3 i hver rapport). *** P 0,001, ** p 0,01, * p 0,05. NS, ingen statistisk signifikans. (C) Cellene ble sådd ut i 24-brønners plater. Tolv timer senere ble mediet fjernet og erstattet med friskt medium i nærvær av 10 uM Brevilin A i 24 timer. DMSO ble anvendt som kontroll. Cellene ble deretter underkastet en Annexin-V-PI dobbel fargeprosessen. Samme eksponering program ble brukt ved hver bølgelengde.
Brevilin A Blocks cytokin Induced STATISTIKK Signa
Cytokiner, som interleukiner og interferoner, vanligvis indusere STAT3 aktivisering gjennom kanoniske JAK-STAT veien. Det har blitt rapportert at STAT3 ble aktivert i DU145 og MDA-MB-468 gjennom IL-6 autokrine looper [34], [35]. Her, i nærvær av ytterligere IL-6-behandling, har vi funnet at Brevilin A kunne hemme STAT3 aktivering i respons til IL-6-induksjon i HEK293T, Hela og HepG2-celler (Fig. 5A). For å teste om dette hemming av Brevilin A ble involvert i andre cytokiner medierte STAT3 aktivisering, ble IFNy og IFNα brukt. I korthet, IL-6 indusert STAT3 aktivering gjennom IL6R-gp130-JAK veien [36], mens IFNy og IFNα indusert ved å aktivere den type II- og type I-interferon-reseptor-JAK veien henholdsvis [37]. Etter forbehandling av Hela med Brevilin A, ble Tyr705 fosforylering av STAT3 sterkt hemmet som forventet (fig. 5B). Transkripsjon av
socs3 plakater (suppressor cytokin signale protein 3) genet reguleres av STAT3 aktivering direkte svar på cytokiner som IL-6 [38], så mRNA nivået av
socs3
vanligvis gjenspeiler transkripsjonen aktivitet av STAT3. Vi målte mRNA-nivå på
socs3
i respons til IL-6 med eller uten Brevilin en forbehandling ved hjelp av RT-PCR i HEK293T, Hela og HepG2-celler. Brevilin En hemmet STAT3 mediert
socs3
transkripsjon i alle disse cellene dramatisk (Fig. 5C). Real-time PCR resultater viste omtrentlig 70% reduksjon av
socs3
mRNA etter behandling med Brevilin A i nærvær av IL-6 i HEK293T celler (fig. 5D).
Celler ble belagt og dyrket i 100 mm skåler i 12 timer, deretter media ble fjernet og erstattet med friskt medium uten serum for en annen 12 timer. Brevilin A (10 uM) ble tilsatt i 30 minutter forbehandling, deretter ble cellene behandlet med IL-6 (250 ng /ml), IFNα (5000 U /ml) og IFNy (1500 U /ml) i 2 timer. STAT3 fosforylering ble deretter analysert ved hjelp av Western-Blot (A og B). (C) Cellene ble sådd ut og dyrket i 100 mm skåler i 12 timer, deretter ble mediet fjernet og erstattet med friskt medium uten serum for en annen 12 timer. Brevilin A ble tilsatt i 30 minutter forbehandling (HEK293T, 10 uM, Hela og HepG2, 15 uM), og deretter ble cellene behandlet med IL-6 (250 ng /ml), IFNα (5000 U /ml) og IFNy (1500 U /ml) i 4 timer.
Socs3
mRNA ble analysert ved RT-PCR. (D) Real-time qPCR-analyse av
socs3
mRNA i HEK293T celler behandlet med Brevilin A i nærvær av IL-6 (250 ng /ml). (E) Brevilin A hemmer IFNα og IFNy-indusert Tyk2 og JAK2 fosforylering henholdsvis, samt STAT1 tyrosinfosforylering i HeLa-celler som ble behandlet i (B). (F)
IRF
mRNA ble analysert ved RT-PCR i HeLa-celler i nærvær av IFNα som behandlinger som er beskrevet ovenfor.
Brevilin A blokker Janus Kinase Activity
Siden Brevilin En kunne hemme JAK2 og Tyk2 fosforylering som svar på IFNy og IFNα (fig. 5E), vi så testet effekten av Brevilin A på STAT1 signalering. Resultatene indikerte at STAT1 fosforylering og dens målgenet
IRF1
ble redusert i nærvær av Brevilin A etter cytokininduksjon (fig. 5E og 5F). Disse funksjonene avslører at de potensielle direkte hemmende mål for Brevilin En kan finne oppstrøms STAT3 og STAT1 signalering.
