Abstract
Bakgrunn
Tykktarmskreft (CRC) er en viktig dødsårsak i verden . Sensitive, ikke-invasive diagnostiske skjerm metoder er sterkt behov for å forbedre sin overlevelse. Stabil sirkulerende mikroRNA tilbyr unike muligheter for tidlig diagnostisering av flere sykdommer, inkludert kreft. Vårt mål har vært å finne nye plasma mirnas som kan brukes som biomarkører for påvisning av CRC.
metodikk /hovedfunnene
Ifølge resultatene av miRNA profilering utført på pooling plasmaprøver danne 10 CRC pasienter eller 10 friske kontroller, et panel av miRNAs (HSA-MIR-10a, -19a, -22 *, -24, -92a, 125a-5p, -141, -150, -188-3p, -192, -210, -221, -224 *, -376a, -425 *, -495, -572, -601, -720, -760 og HSA-la-7a, -7e) ble deregulert i CRC plasma med fold endringer 5. Etter stor skala validering av QRT-PCR utføres på en annen 191 selvstendige individer (90 CRC, 43 avansert adenom og 58 friske deltakere), fant vi at nivåene av plasma MIR-601 og MIR-760 ble betydelig redusert i kolorektal neoplasi (karsinomer og avanserte adenomer) sammenlignet med friske kontroller. ROC kurven analyse viste at plasma MIR-601 og MIR-760 var av betydelig diagnostisk verdi for avansert neoplasi. Disse to mirnas sammen gi en AUC på 0,792 med 83,3% sensitivitet og 69,1% spesifisitet for å skille CRC fra normale kontroller, og gir en AUC på 0,683 med 72,1% sensitivitet og 62,1% spesifisitet i diskriminerende avanserte adenomer fra normale kontroller.
Konklusjoner /Betydning
Plasma MIR-601 og MIR-760 kan potensielt tjene som lovende ikke-invasive biomarkører for tidlig deteksjon av CRC
Citation. Wang Q, Huang Z, Ni S, Xiao X, Xu Q, Wang L, et al. (2012) Plasma MIR-601 og MIR-760 er nye biomarkører for tidlig deteksjon av tykktarmskreft. PLoS ONE 7 (9): e44398. doi: 10,1371 /journal.pone.0044398
Redaktør: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, USA
mottatt: 23 februar 2012; Godkjent: 06.08.2012; Publisert: 06.09.2012
Copyright: © Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble delvis støttet med tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (Grant nr. 81000867 og 81071791), Vitenskap og TechnologyCommission av Shanghai kommune (Grant No. 09JC1403700 og 10XD1401300), og starter Merieux stipend. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
CRC kontoer over hele verden for 600 tusen dødsfall per år. I Kina er fortsatt CRC den fjerde vanligste årsaken til kreftrelaterte dødsfall hittil [1], [2]. Stadium ved diagnose er den viktigste prognostiske faktoren i CRC, noe som gjør tidlig deteksjon av avgjørende betydning for å redusere dødelighet og bedre etterlevelse priser. Nye biomarkører for tidlig deteksjon er sterkt behov. Avanserte adenomer blir vanligvis definert som adenomer på 1 cm eller mer, og de med villous komponenter (tubulovillous eller villous) eller høygradig dysplasi [3], [4]. Avanserte adenomer tydelig kobling opp kjeden fra godartet adenom til avansert CRC. Dermed fleste CRC screening strategier fokus på oppklaringsprosenten av både CRC og avanserte adenomer.
mirnas er små ikke-kodende RNA (18-22 nt i lengde) som regulerer uttrykket av målgener ved post- transkripsjonsnivået ved å binde seg til mål-mRNA. Siden deres oppdagelse i 1993, har endret uttrykk for mirnas vært forbundet med mange typer svulster, inkludert CRC [5], [6]. Deres tilknytning svulst genesis viser sitt potensial som diagnostiske markører og terapeutiske mål [7], [8].
Sirkulasjons mirnas er stabilt påvist i plasma /serum og tjene som biomarkører for flere sykdommer [9], [10 ], [11], [12], [13], [14], noe som gjør dem potensielt nyttige ikke-invasive markører for tidlig diagnose eller overvåkning i progresjon av kreft. Vi har tidligere funnet at forhøyede nivåer av MIR-29a og MIR-92a i plasma har betydelig diagnostisk verdi for CRC [15]. For å styrke den diagnostiske effektivitet av sirkulerende miRNA, er det nødvendig å identifisere nye mål. I denne studien fant vi at plasma MIR-601 og MIR-760 konsentrasjoner kan bidra til tidlig påvisning av CRC i henhold til chip profilering og påfølgende stor skala godkjenning ved QRT-PCR.
Materialer og metoder
Studiepopulasjon
En gruppe på 10 CRC (inkludert fem trinn II og 5 trinns III pasienter) og 10 normale kontroller ble først fremstilt for miRNA profilering (tabell S1). Uavhengig 191 alders- og kjønns matchet personer ble rekruttert i for stor-skala QRT-PCR validering, herunder 90 CRC pasienter (Stadium I-IV), 43 avanserte adenom pasienter og 58 friske deltakere (tabell S2, S3). Parvise vevsprøver som benyttes for analyse av valgte mirnas ekspresjon ble levert av en annen 19 CRC-pasienter (Tabell S4). Pasienter med en tidligere historie av ondartede svulster, arvelig non-polypose CRC eller familiær adenomatøs polypose ble ekskludert fra denne studien. Blodprøver ble tatt før operasjonen og vevsprøver ble oppsamlet etter operasjonen. Tumor ble iscenesatt i henhold til International Union mot Kreft (UICC) retningslinjer. Klinisk forskningsetiske komité for Fudan University Cancer Hospital godkjent forskningsprotokoller og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra deltakerne.
RNA Isolation
Et beløp på 5 til 10 milliliter fullblod ble oppnådd fra hver deltaker. Plasmaet ble oppnådd ved sentrifugering ved 1200 g i 10 min ved 4 ° C. For å fullføre fjerning av gjenværende cellulære komponenter, plasmaprøver ble på nytt sentrifugert ved 12 000 g i ytterligere 10 minutter ved 4 ° C. Supernatanten plasma ble frosset som separate alikvoter ved -80 ° C inntil bruk. Denne fremgangsmåte ble utført i løpet av 2 timer etter venepunksjon. Et volum på 600 ul opptint plasma ble oppvarmet ved 65 ° C i 10 min og deretter inkubert ved 42 ° C i 1 time for å denaturere proteinet. Total RNA ble ekstrahert fra den forvarmingen plasma ved hjelp Mirvana PARIS sett (Ambion, USA) og ble eluert den inn i 60 pl (95 ° C) RNase-fritt vann. Deretter plasma RNA ble konsentrert i et sluttvolum på 20 pl ved bruk av en Eppendorf-konsentrator Plus 5301 (Eppendorf, Tyskland). For normalisering av prøve-to-sample variasjon i løpet av RNA isolering og som intern kontroll, samme beløp (25 fmol) av syntetisk C. elegans miRNA-39 (cel-MIR-39) ble lagt inn i hver denaturert prøve. Total RNA fra CRC vev ble ekstrahert ved bruk av TRIzol reagens (Invitrogen, USA) i henhold til den angitte protokoll. Konsentrasjonen av RNA prøver ble kvantifisert ved Nanodrop ND-1000 (Nanodrop, USA).
miRNA profilering
miRNA profilering ble gjort med en miRCURY LNA ™ Universal RT mikroRNA PCR system (Exiqon, Demark ) på 2 sammenslåtte plasmaprøver fra 10 CRC (inkludert fem trinn II og 5 trinns III pasienter) og 10 normale kontroller. Metoden er basert på universell revers transkripsjon (RT), etterfulgt av kvantitativ real-time PCR amplifikasjon med LNA ™ forbedrede primere ved hjelp av SYBR Green. Forhånds porsjonert LNA ™ PCR primere ble satt i 384-brønnen PCR-plater for hver reaksjon per brønn [16]. Et volum på 600 ul av hver plasmaprøver ble plukket ut og blandet homogent. Totalt RNA ble fremstilt som beskrevet ovenfor og en mengde på 500 ng ble anvendt for neste profilering. Totalt 742 mål miRNAs ble oppdaget og brett endringer i hver miRNA uttrykket ble beregnet.
Kvantifisering av miRNAs av QRT-PCR
Om 30 ng beriket RNA ble revers transkribert med en TaqMan mikroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, USA) i en 10 ul reaksjonsvolum. RT produkter ble brukt som maler for neste PCR prosessen etter en 1:10 fortynning. Ekspresjonsnivåene av mirnas ble kvantifisert i triplikat ved QRT-PCR ved anvendelse av humant TaqMan mikroRNA undersøkelseskit (Applied Biosystems, USA) på en ABI 7900 HT QRT-PCR instrument (Applied Biosystems, USA). Både piggete i cel-MIR-39 og endogent MIR-16 ble brukt som normalizers Plasma miRNA kvantifisering, mens RNU6B for vevsprøver.
Mirna Stabilitet i Plasma
Det samme plasmaprøve, fordelt i flere porsjoner, ble underkastet en rekke behandlinger, slik som inkubering ved romtemperatur i forskjellige tider (1, 2, 4, 8, 16, 24 timer), eller å utsette dem for forskjellige antall av fryse /tine-sykluser fra lagringstemperatur ( -80 ° C) til romtemperatur (22 ° C). For å vurdere stabiliteten av plasma MIR-601 og MIR-760, ble Ct verdier oppdaget av QRT-PCR reflekterer konsentrasjoner av forsøksprøver sammenlignet med de som gjennomgår standard protokoller.
Statistical Analysis
relative uttrykk for miRNAs ble analysert av 2
– △△ Ct metode. Mann-Whitney U-test ble brukt for å sammenligne uttrykket av plasma mirnas mellom de ulike gruppene. Mottaker-drifts karakteristiske (ROC) kurver og arealet under ROC-kurven (AUC) vurderte muligheten for å bruke plasma miRNA som et diagnostisk verktøy for CRC. Den Younden indeksen bestemmes terskelen for plasma miRNA konsentrasjoner. Korrelasjonen mellom clinicopathologic funksjoner og plasma miRNA nivåer ble bestemt av Mann-Whitney U test, t-test eller Χ2 test. Alle tester ble to-sidig og et signifikansnivå på P 0,05 (95% CI) ble betraktet som statistisk signifikant. Statistisk analyse avhengig av SPSS 16.0 programvare (SPSS Ltd, UK) og grafer ble generert med Graphpad Prism 5.0 (Graphpad Software Inc, USA).
Resultater
miRNA profilering
etter eksklusjon flere miRNA mål med Ct-verdiene 35 i kreftprøver for sin ekstremt lave uttrykk, ble 86 mirnas uttrykt forskjellig mellom CRC og kontroll med fold endringer 2 (tabell S5). Både MIR-29a og MIR-92A ble inkludert i oppregulert liste som vi tidligere rapportert [15]. Noen andre deregulerte mål, slik som har-MIR-95, -181b, -200c, -220 og -221, ble tidligere rapportert i CRC [13], [17]. Rådata av miRNA profilering har blitt lastet opp på GEO database (GSE38716). For å begrense omfanget av studien, et panel av 9 oppregulert mirnas (HSA-MIR-19a, -22 *, -24, -92a, -125a-5p, -210, -221, -376a og hsa- la-7e) og et panel av 13 nedregulert mirnas (HSA-MIR-10a, -141, -150, -188-3p, -192, -224 *, -425 *, -495, -572, -601 , -720, -760 og HSA-la-7a) ble valgt med fold endringer 5. I vurderingen av vårt mål om å finne nye plasma biomarkører, fem tidligere rapporterte mål (HSA-MIR-92a, -141, -210, -221 og HSA-la-7a) ble fjernet [13], [17], [18], [19], [20], [21], [22], og de resterende 17 mirnas ble valgt for videre storskala QRT-PCR validering.
diagnostisk verdi av MIR-601 og MIR-760 for CRC
for å identifisere de 17 forskjellig uttrykt plasma mirnas identifisert av uttrykk profilering, ble deres nivåer målt ved QRT-PCR i 90 CRC og 58 normale kontroller normalisert til piggete i cel-MIR-39. Både MIR-601 og MIR-760 ble betydelig redusert i CRC plasma sammenlignet med kontrollene (P 0,0001, figur 1). ROC kurven analyse indikerte deres potensielle diagnostiske verdi og AUC for MIR-601 og MIR-760 var 0,747 (95% KI: 0,666 til 0,828) og 0,788 (95% KI: 0,714 til 0,862), henholdsvis. På en terskel på -11,50 for MIR-601, den optimale sensitivitet og spesifisitet var 69,2% og 72,4% i å skille CRC fra normale kontroller. På en terskel på -8,09 for MIR-760, sensitivitet og spesifisitet var 80,0% og 72,4%, henholdsvis. Samtidig analyse av MIR-601 og MIR-760, hadde tilsvarende AUC av 0,792 (95% CI: 0,719 til 0,865) som MIR-760, med 83,3% sensitivitet og 69,1% spesifisitet, noe som indikerer en dårlig additiv effekt av de 2 miRNAs (figur 2). Vi har tidligere avdekket at plasma MIR-29a og MIR-92a har betydelig diagnostisk verdi for CRC [15]. For de fleste tilfellene i denne studien var den samme som i dette dokumentet, er disse to målene ble tilsatt for kombinert ROC-kurve analyse med MIR-760. Den resulterende AUC økte til 0,943 (95% CI: 0,908 til 0,979) med 83,3% sensitivitet og 93,1% spesifisitet i å skille CRC fra kontrollen, noe som tyder på at additiv effekt i den diagnostiske verdien av disse 3 mirnas (figur S1, S2). Tilsetting av MIR-601 til disse tre mirnas ikke forbedre deres differensiering makt mellom CRC pasienter og friske kontrollpersoner, og resulterte i en samme AUC av 0,943 (95% KI: 0,907 til 0,978). I tillegg ble ingen signifikant forskjell funnet mellom CRC pasienter og kontroller i de resterende 15 mirnas (
P
0,05, data ikke vist). Når QRT-PCR data ble normalisert til Mir-16 [15], plasma MIR-601 og MIR-760 var fortsatt betydelig nedregulert i CRC sammenlignet med normale kontroller (
P
= 0,002 for speil 601 og
P
. 0,0001 for MIR-760, figur S3)
Storstilt stilt~~POS=HEADCOMP validering av MIR-601 og MIR-760 i plasmaprøver (n = 191). Scatter plott av plasmanivået av MIR-601 (A) og Mir-760 (B) hos friske personer (n = 58), avanserte adenomer (n = 43) og CRC pasienter (n = 90). Expression nivåer av miRNAs ble normalisert til cel-MIR-39. Linjen representerer medianverdien. Mann-Whitney U-test ble benyttet for å bestemme statistisk signifikans.
diagnostisk verdi av MIR-601 og MIR-760 for Advanced Adenomer
For å fortsette etterforskningen av den diagnostiske verdien av MIR -601 og MIR-760 i CRC utvikling, målte vi deres plasma uttrykk i 43 avanserte adenomer, som ble definert som forstadier til kreft CRC. Plasmanivåer av MIR-601 og MIR-760 ble betydelig redusert i avanserte adenomer sammenlignet med normale kontroller (
P
= 0,018 for både MIR-601 og MIR-760, figur 1). Begge de 2 mirnas kunne svakt skille avanserte adenomer fra normale kontroller som vist ved ROC kurve analyse; og AUC var 0,638 (95% KI: 0,530 til 0,747) for MIR-601 og 0,682 (95% KI: 0,576 til 0,789) for MIR-760. Den optimale sensitivitet og spesifisitet av MIR-601 var 72,1% og 51,7% ved en cut-off verdi på -10,73; disse verdiene for MIR-760 var 69,8% og 62,1% ved en cut-off verdi på -7,63. Kombinert analyse av MIR-601 og MIR-760 ikke klarte å forbedre den diagnostiske effektiviteten av MIR-760 og viste en tilsvarende AUC av 0,683 (95% KI: 0,576 til 0,789), med 72,1% sensitivitet og 62,1% spesifisitet (figur 2). Videre uttrykk for plasma MIR-601 og MIR-760 i avanserte adenomer ble betydelig økt sammenlignet med CRC (
P
= 0,0174 for MIR-601,
P
= 0,0214 for MIR-760, Figur 1). Når normalisert til MIR-16, plasma MIR-601 og MIR-760 forble nedregulert i avanserte adenomer sammenlignet med normale kontroller (
P
= 0,0198 for MIR-601 og
P
= 0.0184 . for MIR-760, figur S3)
(A, B, C) MiR-601 gir en AUC på 0,747 (95% KI: 0,666 til 0,828) med 69,2% sensitivitet og 72,4% spesifisitet (kutt off-verdi = -11,50), og MIR-760 gir en AUC på 0,788 (95% KI: 0,714 til 0,862) med 80,0% sensitivitet og 72,4% spesifisitet (cut-off verdi = -8,09) for kresne CRC fra normale kontroller. Kombinert analyse av MIR-601 og MIR-760 avslørte en AUC på 0,792 (95% KI: 0,719 til 0,865), med 83,3% sensitivitet og 69,1% spesifisitet. (D, E, F) MiR-601 ga en AUC på 0,638 (95% KI: 0,530 til 0,747) med 72,1% sensitivitet og 51,7% spesifisitet (cut-off verdi = -10,73), og MIR-760 avslørte en AUC på 0,682 (95% KI: 0,576 til 0,789) med 69,8% sensitivitet og 62,1% spesifisitet (cut-off verdi = -7,63) for kresne avanserte adenomer fra kontroller. Kombinert analyse av MIR-601 og MIR-760 ble ikke bedre diagnose effektivitet, og ga en tilsvarende AUC av 0,683 (95% KI: 0,576 til 0,789). Med 72,1% sensitivitet og 62,1% spesifisitet som MIR-760
Association med kliniske karakteristika
for å demonstrere redusert trenden med plasma MIR-601 og Mir-760 uttrykk i CRC utvikling, ble CRC tilfeller ytterligere stratifisert etter sin TNM staging. Pasientene ble delt inn i 5 grupper, fra avansert adenom (minst avanserte lesjon) i Stage IV CRC (den mest avanserte lesjon). Sammenlignet med normale kontroller, ble nivåer av plasma MIR-601 og MIR-760 redusert i alle de 5 gruppene. Enda viktigere, dette var i tråd med nedregule trend av nivåene av de 2 mirnas blir lavest i stadium IV pasienter og høyest i stadium I pasienter. Både plasmanivået av MIR-601 og MIR-760 ble redusert i løpet av progresjon av CRC fra normal gjennom avansert adenom til CRC (figur 3). Det var ingen signifikant sammenheng mellom disse 2 mirnas og kjønn, alder, lymfeknutestatus, svulst stedet, tumorstørrelse eller histologi. (
P
0,05, data ikke vist)
Skap tomter plasmanivået av MIR-601 (A) og Mir-760 (B) i normale personer (n = 58), avanserte adenomer (n = 43) og CRC pasienter (n = 90) med forskjellig TNM stadium (26 med i, 25 med II, 29 III og med 10 med IV). Expression nivåer av mirnas er normalisert til cel-MIR-39. Linjene inne i boksene betegne medianverdier. Mann-Whitney U-test ble benyttet for å bestemme statistisk signifikans.
carcinoembryonic antigen (CEA) er en biomarkør brukes for å overvåke CRC tilbakefall og er ikke en gyldig diagnostisk biomarkør fra et klinisk ståsted for sin lave følsomhet og spesifisitet. Men det er ingen ideell potensielle biomarkører for CRC screening til dato og CEA serveres fortsatt som et foreløpig svulst indikator på helseundersøkelsen. For å vurdere mulig komplementering av plasma miRNA og CEA for tidlig deteksjon av CRC ble CEA data sammenlignet med MIR-601 og MIR-760 nivåer i 51 stadium I og stadium II pasienter. De cut-off verdier av MIR-601 og MIR-760 fra ROC kurven analyse var -11,50 og -8,09, henholdsvis. Cut-off verdi for CEA var 5,0 ng /ml (ln 5 = 1,609). MiR-601 eller MIR-760 identifisert ytterligere 26 eller 29 tilfeller savnet av CEA alene, viser større makt i å differensiere tidlig stadium CRC. Kombinert bruk av MIR-601 og MIR-760 kunne oppdages 30 CEA-tapte saker i det hele tatt. ROC kurven analyse viste at kombinasjonen av MIR-601 og MIR-760 kan forbedre den diagnostiske sensitiviteten av CEA fra 29,4% til 80,4% med en AUC på 0,805 (95% KI: 0,457 til 0,683). (Figur S4)
MiR-601 og Mir-760 uttrykk på CRC vev
i den hensikt å grave ut den indre forhold miRNA uttrykket mellom plasma og tilsvarende kreft vevsprøver, MIR-601 og MIR-760 ble målt i tumor vev fra en annen 19 CRC tilfeller. Ingen signifikante forskjeller ble funnet for begge 2 mirnas mellom kreft og noncancerous vev (
P
= 0,32 for MIR-601 og
P
= 0,43 for MIR-760, figur 4). Utgivelsen av miRNAs av kreftceller til sirkulasjonen blir påvirket av flere parametere kan forklare inkonsekvens. I tillegg er det ukjent om tumorceller kunne endre mirnas frigjørende inn i blodet av andre organer eller celler. Større prøver validering var nødvendig for å bekrefte MIR-601 og Mir-760 uttrykk i CRC vev.
Ingen signifikante forskjeller om MIR-601 (A) og Mir-760 (B) konsentrasjoner ble funnet mellom CRC vev og sammenkoblede ikke-cancerøse vev (NCT) (n = 19). Expression nivåer av miRNAs ble normalisert til RNU6B. Linjen representerer medianverdien. Mann-Whitney U-test ble benyttet for å bestemme statistisk signifikans.
MiR-601 og MIR-760 Stabilitet i Plasma
Plasmanivåer av MIR-601 og MIR-760 ble funnet å være stabile etter å ha blitt utsatt for langvarig inkubasjonstiden ved romtemperatur, og de Ct-verdiene viste ingen betydelige svingninger. De tilsvarende resultater ble funnet i den neste fryse-tine-sykluser eksperiment (figur 5). Derfor vurderte vi at de var ganske stabil i plasmaprøver og neppe dårligere i løpet av protokoller og lagringsinnstillinger. Basert på disse resultatene, konkluderte vi med at MIR-601 og MIR-760 i utgangspunktet oppfylt kravene for klinisk anvendelse.
Plasmanivåer av MIR-601 og MIR-760 var stabil etter langvarig romtemperatur inkubasjon 1-24 timer (A) eller minst 4 fryse-tine sykluser (b).
Diskusjoner
mirnas spille en viktig rolle i kreftutvikling. Deregulering av miRNA uttrykket forekommer i ulike kreftformer, særlig MIR-143 og MIR-145 i CRC [23]. Mirnas kan bidra til terapeutiske strategier som diagnostiske biomarkører og prognostiske faktorer i kreft [5], [6]. Imidlertid biopsi-baserte metoder detekteringsanordninger forbli invasiv og tidkrevende for screening og overvåkning av kreftpasienter. Tumor-avledet mirnas først beskrevet av Mitchell et al. viser klart at stabile mirnas er til stede i humant plasma og serum, som åpner opp et ekstremt bredt felt for klinisk anvendelse [9], [24], [25], [26], [27].
Publisert rapporter av sirkulerende mirnas i CRC er begrenset. Imidlertid Ng et al. funnet at MIR-17-3p og MIR-92 ble signifikant forhøyet i serum fra pasienter med CRC betydelig reduksjon etter operasjonen. Videre validering med et uavhengig sett av 180 prøver indikerte at MIR-92 nivåer i plasma kan skille mellom kolorektal og mage kreft, inflammatorisk tarmsykdom eller normale individer [13]. Og vi tidligere rapportert at plasma MIR-29a og MIR-92a var signifikant oppregulert i CRC pasienter med gode diagnostiske verdier for CRC screening [15].
MiR-601 og MIR-760 var 2 mirnas av mindre bekymring i maligniteter. MiR-601, som ligger innenfor
DENND1A
gen som oppregulert i livmorhalskreft, kan påvirke kjernefysiske faktor-kappa B signalveier i humane lungekreftceller A549 [28], [29]. MiR-760, som ligger innenfor intron-en av
BCAR3
-genet, blir regulert av østrogen, og har en lavere ekspresjon i CRC vev [30]. Ingen ytterligere funksjonelle studier har siden blir utført på de 2 miRNAs. Informasjon om sine relasjoner med kreftutvikling er fortsatt begrenset, men våre nye funn tyder på at plasma MIR-601 og MIR-760 kan fungere som egnede tidlig diagnostiske markører for CRC.
I denne studien, vi først fant MIR-601 og MIR-760 var nedregulert i CRC plasma av miRNA profilering og validert dem ved QRT-PCR fra i alt 17 utvalgte miRNAs. Vi viste at plasmanivået av MIR-601 og MIR-760 ble redusert i avansert kolorektal neoplasi sammenliknet med friske kontroller, og at MIR-760 var mer fremtredende enn MIR-601 som en CRC biomarkør. Ifølge vår erfaring og tidligere studier, 11% samsvar mellom chip screening og validering var lav, men akseptabelt. ROC kurven analyse viste svak uttrykk for disse 2 miRNAs kan bidra til tidlig påvisning av CRC med 69,2% sensitivitet og 72,4% spesifisitet for MIR-601 (AUC = 0,747) og 80,0% sensitivitet og 72,4% spesifisitet for MIR-760 (AUC = 0,788). Kombinasjonen av disse biomarkører supplert CEA i å oppdage tidlig stadium CRC (stadium I og II) fikk en AUC på 0,805 med 80,4% sensitivitet og 65,5% spesifisitet. Videre, kombinert MIR-601 og MIR-760 kan også diskriminere avanserte adenomer fra friske kontroller som gir en AUC på 0,683 med 72,1% sensitivitet og 62,1% spesifisitet. Mer bemerkelsesverdig, nivåene av både MIR-601 og MIR-760 falt ned i etapper I og II CRC, som sterkt forhøyet deres potensielle verdi for tidlig deteksjon av CRC. Selv om den diagnostiske verdien av MIR-601 og MIR-760 kan falle kort for å være optimal, et panel av tre plasma miRNA (MIR-760, -29a og -92a) markører avslørt godt diagnostisk effektivitet.
Ingen enighet interne kontroller som er avgjørende viktig i nøyaktig kvantifisering av RNA-nivåer med QRT-PCR har blitt etablert for å date. Det ble bekreftet at en lineær korrelasjon ble eksisterte mellom mengden av innmatede syntetiske miRNA og Ct-verdier i QRT-PCR [31]. I denne studien ble cel-MIR-39 tilsatt til hver denaturert prøve i løpet av RNA isoleringsfremgangsmåter for normalisering [32]. I tillegg har vi også brukt MIR-16, en foreslått intern kontroll av vår tidligere arbeid, for å normalisere våre QRT-PCR data og fått lignende resultater (Figur S3) [15]. Men det syntes at vi kan få en bedre AUC når normal med cel-MIR-39, så cel-MIR-39 ble valgt ut til å normalisere QRT-PCR data i denne studien (figur S5).
Plasma prøver kan samles en ikke invasiv og ikke tidsbegrenset. Vi har fastslått at sirkulerende mirnas utvunnet fra en minimal plasmaprøve var godt egnet for kvantifisering formål. I forhold til andre nukleotid-inneholdende molekyler, slik som DNA og mRNA, mirnas er mer motstandsdyktig mot DNase og RNase-aktivitet, noe som gjør dem forholdsvis stabil i sirkulasjonen. Vi beviste at MIR-601 og MIR-760 var ganske stabil i plasmaprøver og gjennomgikk litt degradering etter langvarig romtemperatur inkubasjon eller flere fryse-tine sykluser.
En begrensning med denne studien har vært at molekylære innsikt i årsaken til dereguleringen har ikke vært forestående. Sirkulasjon miRNA nivåer synes å gjenspeile vev uttrykk som er blitt vist i en rekke krefttyper, inkludert prostata kreft og brystkreft [9], [24]. Mens MIR-601 og MIR-760 nivåer ikke ble redusert i CRC vev, som virket ikke består med det i plasma. En annen begrensning med denne studien er at lignende, men ikke utfyllende, diagnostiske verdiene ble funnet mellom disse to miRNAs. Tilsetting av MIR-601 ble ikke bedre differensial kraften i MIR-760 i diskriminerende avansert kolorektal neoplasi fra normale kontroller. Men identifisere plasma MIR-601 og MIR-760 som biomarkører skal nå mer nøyaktig oppdage CRC i et tidlig stadium. Videre, tilsetningen av MIR-760 til andre to miRNA identifisert tidligere av oss viste en signifikant forbedret diagnostisk verdi, noe som tyder på at et panel av plasma miRNA markører kan forbedre følsomheten og spesifisiteten av denne analysen for CRC-screening.
i konklusjonen, er plasma MIR-601 og MIR-760 nivåer i CRC og avanserte adenomer betydelig redusert, noe som tyder på muligheten for at plasma MIR-601 og MIR-760 er nye biomarkører for klinikken diagnostisering av CRC, men underliggende mekanismene for deres nedgang krever videre undersøkelser.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Plasma MIR-29a og MIR-92a uttrykk. Plasma MIR-29a (A) og Mir-92a (B) var signifikant oppregulert i CRC sammenlignet med normale kontroller (
P
0,0001,
P
= 0,0005). Adenomer ble samtidig differensiert fra normale kontroller (
P
= 0,0015,
P
= 0,0003). Linjen representerer medianverdien. Mann-Whitney U-test ble benyttet for å bestemme statistisk signifikans
doi:. 10,1371 /journal.pone.0044398.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Kombinert ROC kurven analyse av MIR-29a, MIR-92a og MIR-760. Kombinert ROC kurve analyse av de 3 mirnas (MIR-29A, MIR-92A og MIR-760) ga en AUC på 0,943 (95% KI: 0,908 til 0,979) med 83,3% sensitivitet og 93,1% spesifisitet i diskriminerende CRC fra normale kontroller.
doi: 10,1371 /journal.pone.0044398.s002 plakater (JPG)
Figur S3.
Plasma MIR-601 og Mir-760 uttrykk normalisert ved MIR-16. Både cel-MIR-39 og MIR-16 kan brukes til normalisering. MiR-601 og MIR-760 var fortsatt betydelig nedregulert i CRC og avanserte adenomer sammenlignet med normale kontroller når QRT-PCR data ble normalisert til Mir-16. Linjen representerer medianverdien. Mann-Whitney U-test ble benyttet for å bestemme statistisk signifikans
doi:. 10,1371 /journal.pone.0044398.s003 plakater (TIF)
Figur S4.
Diagnostiske sensitiviteter av MIR-601 og MIR-760 sammenlignet med CEA for stadium I og II CRC. De cut-off verdier av MIR-601 og MIR-760 fra ROC kurven analyse var -11,50 og -8,09, henholdsvis. Cut-off verdi for CEA var 5,0 ng /ml (ln 5 = 1,609). (A, B) To-parameter klassifikasjoner viste at 26 og 29 tilfeller (stadium I og II) savnet av CEA ble supplerende oppdaget av MIR-601 og MIR-760, henholdsvis. (C) MiR-601 og MIR-760 var mer potent enn CEA i differensiere stadium I og II CRC fra friske kontrollpersoner og kombinert bruk av MIR-601 og MIR-760 kan påvises 30 CEA-tapte saker i det hele tatt. (D) Kombinert bruk av de 3 markørene ga en AUC på 0,805 (95% KI: 0,457 til 0,683). Med en forhøyet sensitivitet på 86,3%
doi: 10,1371 /journal.pone.0044398.s004 plakater (TIF )
Figur S5.
ROC kurve analyse av plasma MIR-601 og MIR-760 normalisert til cel-MIR-39 eller MIR-16. (A, B, C) Normalisert til cel-MIR-39, plasma MIR-601 gir en AUC på 0,713 (95% KI: 0,634 til 0,792) med 72,4% sensitivitet og 62,4% spesifisitet (cut-off verdi = -11,50) og MIR-760 gir en AUC på 0,754 (95% KI: 0,682 til 0,826) med 72,4% sensitivitet og 72,2% spesifisitet (cut-off verdi = -8,08) for kresne avansert kolorektal neoplasi (CRC og avanserte adenomer) fra normale kontroller . Kombinert analyse av MIR-601 og MIR-760 avslørte en AUC på 0,824 (95% KI: 0,680 til 0824), med 74,4% sensitivitet og 70,0% spesifisitet. (D, E, F) Normalisert til MIR-16, plasma MIR-601 ga en AUC på 0,668 (95% KI: 0,588 til 0,748) med 74,1% sensitivitet og 53,4% spesifisitet (cut-off verdi = -7,63), og MIR-760 avslørte en AUC på 0,724 (95% KI: 0,651 til 0,798) med 87,9% sensitivitet og 48,9% spesifisitet (cut-off verdi = -4,81) for kresne avansert kolorektal neoplasi fra normale kontroller. Kombinert analyse av MIR-601 og MIR-760 avslørte en AUC på 0,732 (95% KI: 0,661 til 0,803), med 43,6% sensitivitet og 94,8% spesifisitet
doi:. 10,1371 /journal.pone.0044398.s005
(JPG)
Tabell S1.
Pasientinformasjon for miRNA profilering.
doi: 10,1371 /journal.pone.0044398.s006 plakater (docx)
Tabell S2.
Pasientinformasjon for storskala validering.
doi: 10,1371 /journal.pone.0044398.s007 plakater (DOC)
tabell S3.
Den patologiske trekk avanserte adenomer.
doi: 10,1371 /journal.pone.0044398.s008 plakater (docx)
Tabell S4.
Pasientinformasjon for validering av sammenkoblede CRC vev.
doi: 10,1371 /journal.pone.0044398.s009 plakater (docx)
Tabell S5.
mirnas deregulert i CRC plasma med FC 2.
doi: 10,1371 /journal.pone.0044398.s010 plakater (docx)
