Abstract
Bakgrunn
sykdomsspesifikke biomarkører er et viktig verktøy for rettidig og effektiv forvaltning av patologiske tilstander, herunder fastsettelse av følsomhet, diagnostisering og overvåking effekt av forebyggende eller terapeutiske strategier . Aptamerer, bestående av enkeltkjedet eller dobbeltkjedet DNA eller RNA, kan tjene som biomarkører for sykdom eller biologiske tilstander. Aptamerer kan binde til spesifikke epitoper på makromolekyler på grunn av deres tredimensjonale strukturer, og mye som antistoffer, kan aptamerer anvendes for å målrette mot spesifikke epitoper på basis av deres molekyl form. Den Systematisk Utviklingen av ligander ved eksponentiell berikelse (SELEX) er tilnærmingen brukes til å velge høy affinitet aptamerer for spesifikke makromolekyl mål fra mellom 10
13 oligomerer består typisk tilfeldig oligomertynnfilmer biblioteker. I denne studien har vi brukt levende cellebasert SELEX å identifisere DNA aptamerer som gjenkjenner celleoverflate forskjeller mellom HPV-transformert livmorhalskreft kreftceller og isogene, nontumorigenic, revertante cellelinjer.
Metodikk /hovedfunnene
Hel-celle SELEX metoden som er tilpasset for bruk med adherente cellelinjer (som vi har betegnet heft~~POS=TRUNC Cell-SELEX (AC-SELEX)). Ved bruk av denne tilnærmingen, identifiserte vi høy affinitet aptamerer (nanomolare området K
d) til epitoper som er spesifikke for celleoverflaten av to nontumorigenic, nontumorigenic revertanter avledet fra den humane cervikale kreft HeLa-cellelinjen, og viste tap av disse epitoper i en annen humant papillomavirus transformert livmorhalskreft cellelinje (Siha). Vi utførte også foreløpig undersøkelse av aptamer epitoper og deres bindende egenskaper.
Konklusjon /Betydning
Ved hjelp av AC-SELEX vi har generert flere aptamerer som har høy affinitet og spesifisitet til nontumorigenic, rever av HPV-transformlivmorhalskreftceller. Disse aptamerer kan brukes til å identifisere nye biomarkører som er relatert til kreftutvikling. Paneler av aptamerer, som disse kan være nyttig i å forutsi karsinogent potensial og egenskaper av kreft biopsier og hjelpemiddel i effektiv forvaltning av patologiske tilstander (diagnose, spådde utfallet, og behandling)
Citation. Graham JC , Zarbl H (2012) bruk av Cell-SELEX å generere DNA aptamerer som molekylære prober av HPV-Associated livmorhalskreftceller. PLoS ONE 7 (4): e36103. doi: 10,1371 /journal.pone.0036103
Redaktør: Eric Deutsch, Institut Gustave Roussy, Frankrike
mottatt: 26 januar 2012; Akseptert: 28. mars 2012; Publisert: 20 april 2012
Copyright: © 2012 Graham, Zarbl. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Støttet av Public Health Services Grant # NIEHS P30ES005022 (HZ), et fellesskap å JCG fra New Jersey Commission on Cancer Research, Award #: 09-1962-CCR-EO, og institusjonell støtte fra Robert Wood Johnson Medical School, UMDNJ. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
livmorhals~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er den nest vanligste kreftformen rammer kvinner over hele verden [1]. Mer enn 90% av livmorhalskreft er forårsaket av HPV, og ca 10 800 nye tilfeller av HPV-relatert kreft i livmorhalsen er diagnostisert i USA (US) årlig [2]. Mer enn 100 HPV-typene er klassifisert, den mest onkogene som er HPV16 og HPV18. HPV type 16 (HPV-16) er assosiert med mer enn 50% av livmorhalskreft over hele verden [3]. En fersk studie viste at HPV-infeksjon er også assosiert med seksuell aktivitet, og er den ledende årsak til den økende forekomsten av orofaryngeal kreft i USA [4]. Således, til tross for tilgjengeligheten av en forebyggende vaksine for HPV-infeksjon [5], er det fremdeles et betydelig behov for utvikling av biomarkører som er spesifikt assosiert med HPV karsinogenese i stedet for bare infeksjon. Disse transformasjon spesifikke biomarkører vil være nyttig for studier av sykdomsprogresjon, forebygging og /eller respons på behandling. Her beskriver vi utviklingen av en aptamer basert tilnærming for å identifisere biomarkører for HPV-mediert celle transformasjon.
Begrepet aptamerer oppsto gjennom observasjon at makromolekyler med ulike primærmolekylstrukturer vil hver vedta en unik, tre- dimensjonal konfigurasjon, som hver vil ha unike affinitet for binding til, og som danner komplekser med andre molekyler [6]. Det er faktisk den samme type sekvensavhengig strukturelle variasjoner som ligger til grunn for spesifikk binding av antistoffer til antigen epitoper. I løpet av de siste årene -20, begrepet struktur binde- har blitt utnyttet til å utvikle aptamer biblioteker, sett av makromolekyler med randomiserte sekvenser av nukleinsyrer (RNA eller DNA). Aptamer bibliotekene blir deretter screenet for deres evne til å binde fortrinnsvis til spesifikke molekyler eller makromolekyler ved hjelp av SELEX (Systematisk Utviklingen av ligander ved eksponentiell anriking), som kombinerer aptamer berikelse av iterative utvalg av affinitetsbinding og polymerase kjedereaksjon (PCR), for å oppdage høy affinitet , funksjonsspesifikk dobbelt-trådet eller enkelt-trådet RNA eller DNA [6], [7]. Mens aptamerer kan ha affiniteter sammenlignbare med de av monoklonale antistoffer de har flere fordeler. Aptamerer kan produseres
in vitro Hotell og dermed ikke krever vaksinering, cellefusjon, eller gjæring å produsere masse mengder. Når nukleinsyresekvensen av en funksjonell aptamer er bestemt, kan store mengder av den spesifikke oligomer fremstilles ved kjemisk eller enzymatisk syntese ved lave omkostninger og høy effektivitet.
En nyere anvendelse er celle-SELEX, hvor aptamerer som gjenkjenner spesifikke molekyler på overflaten av cellene blir utviklet ved gjentatt forsterkning og binding til levende celler [8]. I denne tilnærmingen aptamerer kan brukes for å identifisere et bredt utvalg av molekyler inkludert nukleinsyrer, proteiner, lipider, karbohydrater samt posttranslasjonell modifikasjon av slike molekyler som er på overflaten av de eksponerte celler. Betydelig, celle-SELEX tilbyr en unik evne til å oppdage ukjente eller uidentifiserte biomarkører knyttet til en bestemt celletype, utviklingsstadiet, eksponering, infeksjon, biologisk tilstand eller sykdom. Celle-SELEX har blitt anvendt i ikke-adherente cellekulturer for å identifisere aptamerer som kan gjenkjenne leukemiceller i biologiske prøver [8], [9]. I denne studien tilpasset vi helcelle-SELEX for bruk på heftcellelinjer (target og ikke-target), en prosess som vi kalte Heft Cell-SELEX (AC-SELEX) for enkelhet. Ved hjelp av AC-SELEX, utviklet vi aptamerer som kan skille humant papillomavirus (HPV)-transformerte HeLa-cervical carcinoma-celler fra ikke-tumorigene revertanter av HeLa-celler (HF) som holder en funksjonell integrert HPV-genomet [10], [11]. HF rever-cellelinjen ble tidligere utledet i vårt laboratorium fra HeLa-celler eksponert for en enkelt mutagen dose, ethylmethylsulfonate (EMS), etterfulgt av seleksjon av kloner fra celler som har mistet forlenget rhodamin 123 retensjonstid karakteristisk for de fleste kreftceller [12] . I forhold til foreldre HeLa-celler, HF-celler har en ikke-transformerte fenotype, redusert kloningseffektiviteten i myk agar og er ikke-tumorigene i atymiske nakne mus [11]. HF x HeLa-cellehybridceller som er generert av cellefusjon viste signifikant reduksjon i kloningseffektiviteten i myk agar, noe som tyder på aktiveringen av en dominant tumorsuppressorgen i HF-celler og molekylær analyse indikerte reaktivering av p53 tumor suppressor-gen i HF-celler, men uten tapet, omleiring, eller reduksjon i ekspresjonen av HPV E6 /E7 onkoproteiner [10], [11]. Gitt at HF-celler er isogen med HeLa-celler, forskjeller i genuttrykk mønstre er sannsynlig å bli assosiert med tap av tumorigent fenotype, noe som gjør dette til det ideelle cellen pair der for å søke etter biomarkører av HPV-mediert celle transformasjon.
Her vi rapporterer på oppdagelsen av enkelt-trådede DNA aptamerer med høy affinitet for epitoper som er anriket på overflaten av det vedheftende, nontumorigenic HF cellelinje i forhold til tumorigen HeLa-cellelinjen. Evnen som aptamerer for å detektere biomarkører som går tapt ved HPV-mediert celletransformasjoner ble validert i Siha cervikale karsinom-cellelinje. Resultatene av denne studien tyder på at aptamerer kan brukes til å belyse kandidatens biomarkører for celleforandringer forbundet med og /eller bidra til generasjon av en ikke-tumorigen fenotype i HPV-infiserte celler.
Resultater
heft~~POS=TRUNC Cell-SELEX og identifikasjon av Target-Cell Specific Aptamer Kandidater
for å tilpasse hele cellen-SELEX til tilhenger celler i kultur, vi utlized prosedyren skissert i figur 1. aptamerer ble rettet mot nontumorigenic HF cellen linjen ved hjelp isogene HeLa-celler for negativ mot valget. Etter atten sykluser med positiv /negativ seleksjon identifiserte vi molekylære prober som var meget spesifikt for rever HF-cellelinje (tabell 1). Vi sekvensert elleve aptamer kandidater og fra disse ble fire tilfeldig valgt for ytterligere DNA-sekvensanalyse, og bindingsstudier (fet skrift i tabell 1). Siden aptamerer kan betraktes som bestående «shape» biblioteker, genererte vi potensielle sekundære strukturer for hver av de valgte aptamerer og beregnet de relative frie energier for hver av de antatte strukturer [13] (figur 2).
Et utgangs bibliotek av 10
15 aptamerer ble benyttet og atten runder med AC-SELEX ble utført for å rense og forsterke aptamerer som anerkjente epitoper som er tilstede på HF-celler og ikke til stede på HeLa-celler utgangs~~POS=TRUNC biblioteket ble først inkubert. med HeLa-cellelinjen, og de ikke-bundne aptamerer ble gjenvunnet og anvendt for AC-SELEX prosedyre.
de sekundære strukturer for hver av de undersøkte aptamerer. strukturen (e) med lavest fri energi ( dG) er presentert. sekundærstruktur spådommer ble bestemt med UNAfold programvare og er sir_graph ® utgang [13].
Aptamer bindingssteder på målcellene
Når vi innhentet nukleotidsekvensene for våre mål-celle spesifikke aptamerer, ble de tilsvarende enkelt DNA oligonukleotider syntetisert med fluorescerende FAM-koder. De merkede aptamerer ble så inkubert med HF-celler for å bestemme den cellulære lokalisering av deres bindingsseter (figur 3). FAM konjugerte aptamerer ble også inkubert med foreldre HeLa-celler for å verifisere differensial bindende.
Bilder av HF og HeLa celler inkubert med fluorescently merkede aptamerer. De aptamerer er spesifikke for den ikke-tumorigen cellelinje HF. De gjenkjenner epitoper på eller i HF-celler og kjenner ikke sine bindingsseter på de tumorigene HeLa-celler. Alle bilder er 40 × og er av celler innen 24 timer etter inkubasjon med 2000 nM aptamerer og påfølgende fiksering og coverslip med Aquamount.
Confocal avbildning og bilde rekonstruksjon ved hjelp av z-stabler ble brukt til å bestemme celle lokalisering av aptamer-epitop komplekser (figur 4). Bindingsstedene for aptamerer 13, 14, 20 og 28 ut til å være lokalisert på celleoverflaten. Aptamer 14, men synes også å være bindende til den perinukleære regionen inne i cellen, noe som er konsistent med binding av aptamer 14 til epitoper på celleoverflaten, etterfulgt av transport til det perinukleære regionen. Selv om mekanismen ved hvilken dette oligomer kom inn i cellen er uklar, pre-inkubering av HF-celler med proteinaser (proteinase K eller trypsin i 2 eller 10 minutter før aptamer-binding) ikke påvirke evnen av cellene for å internalisere FAM merket aptamerer. I motsetning til dette, proteinase behandling betydelig redusert evne til aptamerer 13, 20 og 28 for å binde seg til cellene, noe som tyder på at de var forbundet med epitoper på celleoverflateproteiner.
bilder fra HF-celler med FAM merket aptamerer. Aptamerer 13, 20 og 28 synes å være å binde utelukkende til celleoverflatene, mens aptamer 14 blir også internalisert inn i cellecytoplasmaet. Alle bilder er 40 × og er av celler innen 24 timer etter inkubasjon med 2000 nM aptamerer og påfølgende fiksering og coverslip med Aquamount.
Aptamer Binding Kjennetegn
For å bestemme bindingen likevekt de aptamerer for sine HF-epitoper, inkubert vi HF-celler med gradvis økende konsentrasjoner av den FAM tagget aptamerer og målte fluorescens fra individuelle celler (figur 5). Basert på våre analyser, alle aptamerer evaluert viste høy affinitet binding til sine epitoper: Aptamer 13 (K
d = 2,5 ± 0,5 nM); Aptamer 14 (K
d = 7,1 ± 0,4 nM); aptamer 20 (K
d = 1,6 ± 0,4 nM); og Aptamer 28 (K
d = 6,9 ± 0,2 nM).
Fluorescence kvantifisering av FAM-merket aptamerer bundet til HF celler. Aptamer bindingskurver (linje- og datapunkter) ble samlet ved grafisk fremstilling av den gjennomsnittlige fluorescens med feilfelt som representerer standardfeil av gjennomsnittet for hvert datapunkt (n = 4 pr datapunkt). Disse data ble tilpasset til modellen Y = Bmax * X (Kd + X) (heltrukket linje) som ble dannet ved anvendelse av ikke-lineær regresjonsanalyse for en setespesifikk binding: aptamer 13 (K
d = 2,5 ± 0,5 nM); aptamer 14 (K
d = 7,1 ± 0,4 nM); aptamer 20 (K
d = 1,6 ± 0,4 nM); og aptamer 28 (K
d = 6,9 ± 0,2 nM).
Aptamer spesifisitet for Non-tumorigent, HPV-transformlivmorhalskreft cellelinje
For å undersøke om aptamerer utviklet seg for binding til ikke-tumorigene HF-celler ble gjenkjenner celle-overflate forskjeller spesifikt til ikke-tumorigene revertanter, vi også undersøkt binding til en uavhengig klon av ikke-tumorigene revertanter av HeLa-celler (HA) og til en annen HPV-transformerte cervikale karsinom cellelinje (Siha). Inkubasjoner av FAM-merket aptamerer med HA og Siha cellelinjer (figur 6) er vist at aptamerer spesifikke for de ikke-transformerte HF-celler også er bundet til HA rever klonen, men ble ikke bundet til de transformerte cellene Siha. Disse resultatene indikerer at aptamerer utviklet seg mot HF revertante celler er spesifikke for epitoper som gikk tapt under HPV-indusert transformasjon av livmorhalsen. Studier ved hjelp av aptamer reagenser for affinitetskromatografi er i gang for å rense og identifisere makromolekyler skjuler de epitoper.
Bilder som viser ikke-transformrever, HA cellelinje og HPV-transformlivmorhalskreft cellelinje, Siha, etter inkubering med FAM merket aptamerer. De aptamerer som genereres for å målrette den ikke-transformerte rever, HF-cellelinjen også gjenkjenne den ikke-transformerte rever, HA cellelinje. Legg også merke til at disse aptamerer ikke gjenkjenner epitoper på Siha livmorhalskreft cellelinje, lik de resultatene vi observert med HeLa livmorhalskreft cellelinje. Disse resultatene er i samsvar med hypotesen om at disse aptamerer erkjenner epitoper som er tapt som følge av transformasjon av livmorhals epitelceller av HPV. Alle bilder er 40 × og er av celler innen 24 timer etter inkubasjon med 2000 nM aptamerer og påfølgende fiksering og coverslip med Aquamount.
Diskusjoner
Highly sensitive og spesifikke biomarkører er svært nyttig for diagnostikk, behandling og prognose krefttilfeller. Cell-SELEX er en
in vitro
prosedyre der aptamerer kan velges ved sin evne til å binde forskjellig til celler [14], uten forutgående kunnskap om celleforandringer. Aptamerer kan binde med høy affinitet og spesifisitet til en rekke molekyler [15], [16], [17], og gir en unik alternativ til antistoffer som er mye større, lett degradert, kostbart og tidkrevende å utvikle seg, og krever bruken av dyr [18]. Nukleinsyre-basert-aptamerer er lett syntetisert og kan gjennomgå reversibel denaturering for PCR forsterkning. De kan også gjenkjenne små molekyler som giftstoffer [19], [20] og molekyler som ikke ikke-immunogene komplekser [21] og aptamerer kan enkelt endres med reportermolekyler eller andre molekyler til å forbedre sine egenskaper (dvs. halveringstid) [18 ]. Aptamerer også vedta unike sekvensavhengig tredimensjonale figurer, slik at de er på en måte, form bibliotekene og de kan binde seg til en celle basert på deres rekkefølge, eksteriør og /eller ladning gjennom samhandling med bindende lommer, hydrogenbindinger, stabling av aromatiske ringer, van der Waals krefter, eller en kombinasjon av disse [22]. Aptamerer kan forstyrre protein-protein interaksjoner, konkurrere om og forstyrre bindingssteder, forstyrre virus-celle vedlegg, transkripsjon og mRNA oversettelse [23]. På grunn av sin lille størrelse, kan aptamerer også være i stand til å få tilgang til epitoper som normalt blokkert /skjult for andre sonder /behandlingsformer. Disse ønskelige egenskaper, gi aptamerer evnen til å fungere som terapeutiske midler [21], [24], [25], [26], [27].
aptamerer er allerede utnyttet i kreft biologi og medisin kreft [28], [29], [30]. Ved hjelp av celle-SELEX, forskere har identifisert høy affinitet aptamerer som øker sensitiviteten av kreft i bukspyttkjertelen til kjemoterapeutika [31], levere terapeutiske midler til kreftceller [32] eller gjenkjenne kreftceller i biologiske prøver [8], [9]. SELEX har også gjort det mulig å identifisere forskere aptamerer som er målrettet mot transformasjonsspesifikke antigener, slik som HPV-16 E6 og E7 oncoproteiner, i ekstrakter av cervikale kreftceller [33], [34]. Her viser vi at AC-SELEX kan også brukes til å identifisere celleoverflatemarkører som er endret i løpet av HPV-indusert celletransformasjon.
For å utvikle aptamerer som skiller HPV-transformerte celler fra ikke-transformerte cervikale celle uten
et før
utvalg av epitoper eller mål, innrettet vi helcelle-SELEX for bruk på adherente cellelinjer (figur 1). Ved bruk av denne tilnærmingen, har vi identifisert og uavhengig av hverandre validert aptamerer som har høy affinitet for proteiner eller celleoverflate-antigener som er spesifikke for og til stede på overflaten av nontumorigenic revertanter av HeLa-celler, men er ikke til stede på HPV-transformerte cervikale karsinom-cellelinjer (figur 3 ). Viktigere, to uavhengig avledede revertante cellelinjer (HF og HA) fortsetter å uttrykke HPV E6 og E7 oncoproteiner, men i motsetning til de paren HeLa-celler, HF og HA cellelinjer som har en ikke-transformert morfologi, kontakt hemmet vekst, betydelig redusert kloning effektivitet i myk agar, og den manglende evne til å danne tumorer i nakne mus [10], [11]. I en enkelt skjerm, var vi i stand til å identifisere elleve unike aptamer sekvenser som spesifikt gjenkjenner og binder seg til ligander stede på transformerte rever HF celler, men ikke på HeLa-celler (tabell 1). På grunnlag av våre resultater, aptamerer 13, 20 og 28 binder seg til HF spesifikke celleoverflate-epitoper, mens aptamer 14 er binding til celleoverflaten og blir internalisert inn i cellecytoplasmaet (figur 4). Evnen til å avskaffe aptamer binding med forbehandling av celler med protease foreslått at tre av de fire testede aptamerer føres epitoper på celleoverflateproteiner. Aptamer 14 var i stand til å gå inn i cellene uavhengig av celleoverflateprotein binding, eller ble anerkjenne en protease resistente celleoverflaten epitop som internalisert aptamer kompleks. Sammen disse funnene indikerte at AC-SELEX var i stand til å utvikle seg aptamerer som gjenkjenner forandringer i celleoverflatemakromolekyler som skiller den tumorigent fra ikke-tumorigene HPV-infiserte celler, noe som tyder på verktøyet som diagnostiske prober.
For å utforske sin prognostisk potensial , aptamerer 13, 14, 20 og 28 ble testet sammen med en uavhengig HPV-positive livmorhalskreft cellelinje, Siha, og en ytterligere, ikke-tumorigen revercellelinje, HA. Betydelig, observerte vi at aptamerer gjorde gjenkjenne sine epitoper på ikke-tumorigene HA-celler, men ble ikke bundet til de tumorigene Siha-celler (figur 6), støtter hypotesen om at aptamerer gjenkjenne markører som går tapt ved HPV-mediert transformasjon av cervikale epitelceller . Siden HF, HA og HeLa cellelinjer er isogen, forventer vi at forskjellene i genuttrykk som ikke er knyttet til transformasjon for å være minimal, og derfor at aptamerer utviklet seg er sannsynlig å gjenkjenne viktige biomarkører og epitoper som indikerer livmorhalscelle tumorigenitet. Disse resultatene indikerer at aptamerer generert av AC-SELEX har muligheten til å fortrinnsvis gjenkjenne høyt tumorigene livmorhalskreft cellelinjer i forhold til ikke-tumorigene livmorhalskreft cellelinje rever.
I sammendraget, denne studien demonstrert muligheten for Heft celle-SELEX så vel som dens anvendelse ved påvisning av epitoper som er tapt som et resultat av transformasjonen av cervikale epitel-celler av HPV. Paneler av aptamerer som disse, utviklet seg mot forskjellige tumorcellelinjer for å skille krefttyper og subtyper kan være nyttig anvendes for å forbinde diagnose og prognose og for å bestemme kjemoterapi og sykdom susceptibility (dvs. genetiske forskjeller).
Materialer og Metoder
Cell Culture
den tidlige passasje ATCC CCL2 klone av Hela celler samt Siha livmorhalskreft cellelinje ble oppnådd fra American Type Culture Collection. HF og HA-celler ble oppnådd fra eksperimenter utført tidligere i hvilket utvalg av ikke-transformerte revertanter ble oppnådd basert på tap av rodamin 123 fra celle mitokondrier [11]. HeLa, HF, HA og Siha celler ble dyrket i Dulbeccos Modified Eagle Medium (Gibco) med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin løsning.
SELEX Bibliotek og Primere
Single DNA-sekvenser med 52 tilfeldige nukleotider flankert av kjente 18-nt primer nettsteder ble hentet fra Integrerte DNA Technologies. Primersekvensene var 5′-ATACCAGCTTATTCAATT og 5′-AGA TAG TAA GTG CAA TCT. FAM tagget primere ble opprettet som 5′-fami- ATACCAGCTTATTCAATT og biotin merkede primere ble opprettet som 5′-Biotin-AGATTGCACTTACTATCT.
SELEX Prosedyrer
Før du begynner en start bibliotek på ca. 1,6 x 10
15 aptamerer ble inkubert med ikke-target-HeLa-celler og deretter de ubundne aptamerer ble gjenvunnet og forberedt for den første runden av AC-SELEX. Før hver runde ble aptamerer denaturert ved oppvarming ved 95 ° C i 5 minutter og deretter raskt avkjølt på is i 2 minutter. For hver runde av inkubasjoner, 3 x 10
5 HF-celler ble skylt med PBS og inkubert på is med aptamer bibliotek i bindingsbuffer (1% BSA i PBS med salter) under forsiktig omrøring. Cellene ble deretter skylt med PBS og de aptamerer som bundet til HF-celler ble eluert ved tilsetning av elueringsbuffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris 7,5, 1 mM EDTA og 1% SDS) og gjenvinnes ved hjelp av Hirt DNA-prep Fremgangsmåten [35] som er involvert fenolekstraksjon, fenol-kloroform-ekstraksjon, kloroform ekstraksjon. Vi innarbeidet også en back-ekstraksjon skritt for å sikre tilstrekkelig aptamer utvinning. Det genomiske DNA ble deretter fjernet fra etanoloppløsningen. Aptamerer ble utvunnet fra oppløsningen ved etanolutfelling (3 M NaOAc i 100% etanol) og tillatt å bunnfelle over natten ved -20 ° C. Den resulterende prøve ble deretter sentrifugert og pelleten vasket to ganger med 70% etanol og fikk tørke. Pelleten ble deretter rekonstituert i bindingsbuffer og inkubert med 10
6 HeLa-celler for aptamer mot markering. Cellene ble deretter skylt med PBS og de ikke-bindende aptamerer ble gjenvunnet fra dette rinsate igjen anvendelse av Hirt-metoden, som blant annet en tilbake-ekstraksjon trinn, etterfulgt av etanolutfelling av aptamerer. De resulterende aptamer bibliotekene ble deretter amplifisert via PCR med en biotin-merket primer og en ikke-biotin-merket primer (Integrated DNA Technologies), og de resulterende dobbelt-trådede aptamerer ble deretter separert ved anvendelse av streptavidin belagte perler og kolonne sentrifugering for å separere den uønskede biotin-merket sekvens fra den ønskede aptamer-sekvensen (se PCR og Aptamer Strand Separation). De resulterende enkelt-strandet aptamerer ble så felt og brukes for neste runde av AC-SELEX.
PCR og Aptamer Strand Separation
aptamerer følge av kontraseleksjonstrinnet ble rekonstruert med elusjonsbuffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris 7,5, 1 mM EDTA og 1% SDS) og amplifisert via PCR med biotin-merkede primere (94 ° C i 30 sek, 46 ° C i 30 sek, 72 ° C i 30 sek) på en Eppendorf-AG 22331 termo (Hamburg, Tyskland). Betingelsene for PCR-amplifisering av aptamer biblioteker er forskjellig fra den i homogen DNA. PCR ble optimalisert rundt utføre 18 runder med AC-SELEX. Forskning med en tilfeldig nukleotid av denne tilsvarende lengde har vist at produktdannelse når et maksimum ved 18 runder, og hvis mer enn 20 runder med PCR blir utført, biprodukter begynner å dannes, og det er en risiko for fullstendig tap av aptamer produkt [36 ]. De resulterende biotin-merket dobbelt-trådede aptamerer ble deretter kokt i 5 minutter, flash-kjølt i isvann i 3 minutter, og inkuberes med streptavidin belagte perler i kolonne bindingsbuffer (20 mM NaPO4, 150 mM NaCl) før kolonne sentrifugering. De resulterende enkelt-trådede aptamerer ble utfelt fra kolonnen strømme gjennom via etanolpresipitering. Den aptamer pellet ble så rekonstituert i PBS med 1% BSA og dette aptamer løsningen ble benyttet for neste runde av AC-SELEX.
Aptamer Cloning
Etter 18 runder med AC-SELEX den resulterende aptamer bassenget ble PCR-forsterket med umodifiserte primere. Den resulterende aptamer Biblioteket ble deretter ligert inn i plasmider og klonet inn i Escherichia coli ved hjelp av
TOPO
TA
kloning kit
inneholder pCR®2.1-
TOPO
® (
Invitrogen
, K4500-01). De plasmider ble renset ved hjelp QIAprep Spin Miniprep (Qiagen, 27106). Konsentrasjonene av de resulterende rensede plasmider ble bestemt ved hjelp av Nanodrop TM 1000 spektrofotometer (Thermo Scientific). PCR etterfulgt av gelelektroforese ble så utført på de rensede prøvene plasmidet for å sørge for et innlegg av den riktige lengde.
Aptamer Sekvense
dobbelttrådet aptamerer ble sekvensert ved å bruke M13 forover og revers primere som er gitt i den TOPO 10 Cloning kit. Plasmider ble sekvensert ved Universitetet i medisin og odontologi i New Jersey DNA Kjerne Facility (Piscataway, NJ).
DNA Folding Spådommer
De sekundære strukturer av de enkelte DNA aptamerer ble beregnet med UNAfold mfold programvare (https://mfold.rna.albany.edu). Strukturene presenteres er utgang fra sir_graph ® utviklet av D. Steward og M. Zuker [13].
Imaging av Cell-Aptamer Komplekser
FAM 5′-merket aptamerer ble syntetisert ved Integrated DNA Technologies. Celler ble dyrket i kammers objektglass, dyrket over natten, vasket med PBS og deretter inkubert med fluorescensmerkede aptamer (e) i PBS med 1% BSA på is i 45 minutter. Cellene ble deretter skylt med PBS før fiksering med 4% paraformaldehyd. De fikserte celler ble deretter skylt med PBS og raskt med DNase-fri vann og montert ved hjelp av Aquamount (Polysciences, Inc.). Cell-bundet aptamerer ble deretter avbildes med en Leica konfokal mikroskop.
Fluorescence Kvantifisering Analyse
fluorescens av aptamer-cellekomplekser ble målt ved bruk av Leica Lite programvare. Celler ble fotografert ved hjelp av en Leica konfokal mikroskop og individuelt kvantifisert ved hjelp av Leica Lite programvare. Fire celler ble kvantifisert per datapunkt etter bakgrunn subtraksjon. Den gjennomsnittlige fluorescens tegnes med feilfelt representerer standard feil av gjennomsnittet for hvert datapunkt. Tilsynelatende Kd-verdier for hver aptamer ble bestemt ved ikke-lineær regresjon for på-stedet-binding i henhold til ligningen: Y = Bmax * X /(Kd + X) ved å anvende GraphPad Prism versjon 5.04 for Windows (GraphPad Software, La Jolla California USA, www. graphpad.com [37].
Proteinase Behandling av celler
Vi har utformet vårt AC-SELEX prosedyre for å tillate aptamer binding til overflaten protein epitoper som kan være sensitive for proteinases. for å bestemme som aptamer epitoper var følsomme for proteaser, behandlet vi målcellene med proteaser et minimum 4 ganger for hver proteinase og aptamer og bestemmes aptamer-binding. celler ble behandlet med 0,05% trypsin og 0,53 mM EDTA i HBSS eller 0,1 mg /ml proteinase K i PBS ved 37 ° C i 2 og 10 min. proteinase behandlet målceller ble deretter brukt for fluorescensmerkede aptamer bindende som beskrevet ovenfor.
takk
Vi ønsker å takke Dr. Denise Galloway for Siha livmorhalskreft cellelinje, Dr. Paul Thomas og Dr. Carol Gardner for å få hjelp med utstyr og protokoller, og Christal Lewis for hennes assistanse med PCR optimalisering.
