Abstract
Aberrant uttrykk for MIR-96 i prostatakreft har tidligere blitt rapportert. Imidlertid har rollen og virkningsmekanismen til MIR-96 i prostatakreft ikke fastslått. I denne studien ble de diagnostiske og prognostiske egenskapene til Mir-96 uttrykk nivåer undersøkt av QRT-PCR i to veldokumenterte prostatakreft kohorter. Mir-96 uttrykk ble funnet å være signifikant høyere hos prostatakreftpasienter og korrelerer med WHO-grad, og redusert total overlevelse tid; pasienter med lave nivåer av MIR-96 levde 1,5 år lenger enn pasienter med høye MIR-96 nivåer. Den terapeutiske potensialet ble videre undersøkt in vitro, viser at ektopiske nivåer av MIR-96 forbedrer vekst og cellulær proliferasjon i prostatakreftceller, noe som tyder på at MIR-96 har onkogene egenskaper i denne innstillingen. Vi viser at Mir-96 uttrykk reduserer transkripsjon og proteinnivåer FOXO1 ved binding til en av to spådd bindingssteder i FOXO1 3’UTR sekvens. Blokkering av denne bindingssetet fullstendig hemmet veksten forbedring formidles av MIR-96. Dette funnet ble bekreftet i en stor ekstern prostata kreft pasient kohort hvor Mir-96 uttrykk omvendt korrelert til FOXO1 uttrykk. Til sammen disse funnene tyder på at Mir-96 spiller en nøkkelrolle i prostatakreft celle spredning og kan forbedre prostata kreft progresjon. Denne kunnskapen kan brukes til utvikling av nye terapeutiske verktøy for prostatakreft
Citation. Haflidadóttir BS, Larne O, Martin M, Persson M, Edsjö A, Bjartell A, et al. (2013) oppregulering av MIR-96 Forbedrer Cellular spredning av prostata kreft celler gjennom FOXO1. PLoS ONE åtte (8): e72400. doi: 10,1371 /journal.pone.0072400
Redaktør: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australia
mottatt: 17 april 2013; Godkjent: 10.07.2013; Publisert: 12. august 2013
Copyright: © 2013 Haflidadóttir et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forskningen som fører til disse resultatene har fått støtte fra EU syvende rammeprogram (FP7 /2007-2013) under tilskuddsavtalen n ° 201438, Vetenskapsrådet rådet~~POS=HEADCOMP, Gunnar Nilssons Cancer foundation, Jeanssons fundament og Gyllenstiernska Krapperups fundament. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den vanligste kreftformen i europeiske og nordamerikanske menn og en av de viktigste årsakene til kreft dødsfall [1]. Mens begrenset til prostatakjertelen, er kreft herdbare ved enten prostatektomi eller strålebehandling [2]. Som svulsten utvikler seg, det utvikler evner til å invadere omkringliggende vev, indusere angiogenese, og metastaserer. Androgen deprivasjon terapi, enten kjemisk eller kirurgisk kastrering, er gullstandarden behandling for avansert PCa. Denne behandlingen alternativet medfører betydelig klinisk respons i nesten alle pasienter [3,4]. Men flertallet av svulstene blir kastrering motstandsdyktig og fortsetter veksten innen 12-18 måneder og for tilbakevendende svulster kun palliativ behandling er tilgjengelig. For å overleve og fortsette veksten i en androgen oppbrukt rundt, må cellene enten tilpasse androgen reseptor (AR) sti eller indusere alternative overlevelse og vekst veier. Mekanismer underliggende tilpasning av AR kan økes ekspresjonen av AR, økt lokal produksjon av androgener, hypersensitivitet eller konstitutivt aktive trunkerte former av AR, promiscuity, og /eller ligand-uavhengig aktivering kinase krysstale. Ved PCA deregulert mikroRNA (miRNA) uttrykket har blitt rapportert [5-7] og mirnas antas å bidra til tumorprogresjon gjennom sitt engasjement i celleproliferasjon, apoptose, invasjon, metastasering og kastrering motstand utbruddet [anmeldt i 8-10]. Vi og andre har tidligere vist at MIR-96 nivåer blir oppregulert i PCa [5,7,11], og at den er også sterkt uttrykt i flere andre krefttyper, inkludert lymfom, lever, bryst, ovarie, lunge, tarm, testikler og tykktarmskreft [5,12]. MIR-96 har vært foreslått å virke som en oncomiR regulerende proliferasjon og DNA-reparasjon [13], men også som en tumor suppressor å indusere apoptose i bukspyttkjertelen celler [14]. I brystkreft, fremmer MIR-96 celleproliferasjon gjennom målretting tumorsuppressorgenet gaffelhodeboks O transkripsjonsfaktor, FOXO3a, og cyclin-avhengig kinase hemmere p27
Kip1 og p21
Cip1 [15]. MIR-96 er også blitt vist å målrette FOXO1 i endometriet [16], bryst [17], hepatocellulær kreft celler [18] og Hodgkin lymfom [19]. Gaffelhodeboks O proteiner FOXO1, FOXO3a, FOXO4, og FOXO6 er transkripsjonsfaktorer involvert i biologiske prosesser som DNA-skade reparasjon [20], cellesyklus [21,22] og apoptose [21,23]. Den FOXO1 tumor suppressor ligger ved 13q41, et område som ofte er slettet i PCa og andre kreftformer, og er blitt vist både nukleær FOXO1 og transkripsjonsnivåer til å bli redusert i PCa [24,25]. Fosfatase og tensin homolog (PTEN) blir ofte borte i prostatakreft [26,27] som også ville føre til tap eller nedsatt funksjon av nedstrøms effektorer som FOXO1 [21]. FOXO1 har vist seg å forbedre apoptose [17,21], og reduksjon proliferasjon [17,21]. I PCa-celler spesifikt induserer apoptose FOXO1 og cellesyklus-stans [21,28], og har også vist seg å være en del av en reguleringstilbakekoblingssløyfe med AR i PCa. FOXO1 undertrykker både androgen-avhengige og androgen-uavhengig aktivitet av AR [24,29,30], og AR inhiberer DNA-bindende aktivitet av FOXO1 ved å danne en protein-proteinkompleks med FOXO1, hvilket gjør FOXO1 ute av stand til å indusere apoptose og celle syklus arrest [30].
Derfor vi en hypotese om at i PCA MIR-96 fungerer som en oncomiR, påvirker tumorprogresjon. I denne studien ble prognostiske egenskapene til Mir-96 analysert i to kohorter av PCA pasienter og uttrykket korrelert til kliniske parametre. Effekten av MIR-96 på cellevekst og proliferasjon ble vurdert
in vitro Hotell og FOXO1 ble identifisert som et direkte mål for MIR-96 i PCA celler.
Materialer og Metoder
Etikk uttalelse
Etisk godkjenning for alle prøver som er beskrevet er hentet fra «Regionala etikprövningsnämnden i Lund» (lokal Ethical Review Board i Lund, Sverige), godkjenning #: LU909-03 og personlige data anonymiserte. Den etiske komiteen fravikes behovet for skriftlig samtykke og på deres forslag om forskning med instruksjoner av opt-out prosedyren ble publisert i alle større lokale aviser. Vi holder seg til erklæringen av Helsinki og Data Protection Directive.
Pasientprøver
Cohort 1, tidligere beskrevet [31,32] og i tabell S1, ble brukt til å analysere MIR-96 uttrykk . Den består av vevsprøver innsamlet fra transuretral reseksjon av prostata (Turps), samlet 1990-1999 i Malmö, Sverige. I korthet, ble materialet fiksert i 4% bufret paraformaldehyd og parafin innebygd. Prøvene ble gradert i henhold til WHO-standarden og diagnosen var basert på histopatologisk diagnose i tilfeldig utvalgte tilfeller med tegn på prostata adenokarsinom i 50 pasienter og benign prostatahyperplasi (BPH) (dvs. ingen bevis for PCA) i ytterligere 25 menn. Tilstedeværelsen av PCa og vurdering av mengden (%) av kreftceller ble utført ved bruk av seksjoner som grenser til de som brukes for miRNA analyse [31]. Ett (1/50) kreft prøve ble ikke funnet å inneholde PCa i den tilstøtende seksjon og ble ekskludert fra den endelige datasettet. Aldersspredningen på tidspunktet for TURP var 63-89, med et gjennomsnitt på 76 år for menn diagnostisert med kreft, og 56-86, med et gjennomsnitt på 71 år for menn med BPH. Cohort 2 består av 93 formalinfiksert parafin innebygd (FFPEs) vev oppnådd fra radikale prostatectomies, gradert i henhold til WHO og Gleason. Prøvene ble oppsamlet ved Malmø Hospital 1999-2002 og er beskrevet i tabell S2. Aldersspredningen på tidspunktet for prostatektomi var 48-73 med en gjennomsnittsalder på 62 år. Passende etiske godkjennelser foreligger fra etikkomiteen, Universitetet i Lund og vi har levd opp til Helsinki-deklarasjonen.
Cell kultur og transfeksjon
PCA cellelinjer 22Rv1, LNCaP klone FGC, DU145 og PC3 ble oppnådd fra American Type Culture Collection og VCap og PNT2 cellelinjer ble oppnådd fra European Collection of Cell Culture. Cellene ble dyrket i henhold til leverandørens anbefalinger. Cellene ble transient transfektert med miRIDIAN mikroRNA Mimic (C-300514-07, 80nM sonde, Thermo Fisher Scientific Inc., Wilmington, DE) og parallelt; celler ble transfektert med miRIDIAN mikroRNA Mimic negativ kontroll (CN-001000-01-05). Å hemme endogen MIR-96, celler ble transfektert med miRCury LNA hemmere (100 nM sonde, Exiqon A /S, Vedbæk, Danmark), MIR-96-hemmer (kat. Nr. 410467-00) og parallelt med negativ kontroll A (Cat . nr. 199004-00). Cellene ble transfektert hjelp Oligofectamin reagens (Invitrogen, Carlsbad, California).
Isolering av RNA
RNA isolert fra PCA og BPH vevsprøver i kohort 1 ble tidligere beskrevet [31]. Kort, RNA ble ekstrahert fra 20 pm deler av 75 formalinfiksert parafin innebygd (FFPEs) prostata vevsprøver. Små RNA ble ekstrahert med en litt modifisert protokoll fra mirVanaTM miRNA Isolation Kit (Ambion); prøvene ble deparaffinised av xylen behandling og spaltet med protease før det organiske ekstraksjon. Etter vasking av filteret som inneholder de små RNA ble prøvene DNase-behandlede (RecoverAll, Ambion), og vasket igjen. I kohort 2, ble total RNA ekstrahert fra prostata vev kjerner (1-4mm). Total RNA ble ekstrahert i samsvar med en modifisert protokoll fra
mir
Vana ™ miRNA Isolation Kit (Ambion) som beskrevet i Hagman et al. [31]. Alle RNA-konsentrasjoner ble målt ved hjelp av en Nanodrop (ND-1000, spektrofotometer, Thermo Fisher Scientific Inc.). RNA-ekstraksjon fra 27 humane vev av forskjellig opprinnelse er blitt beskrevet tidligere [33]. Fra cellelinjene, ble totalt RNA isolert ved hjelp Trizol reagens i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen), og behandlet med DNase (Promega biovitenskap, San Luis Obispo, CA). RNA-konsentrasjonen ble målt ved anvendelse av et Nanodrop. For ekstern validering av sammenhengen mellom MIR-96 og FOXO1 transkripsjonsnivåer vi analysert en ekstern microarray datasettet fra Taylor et al. utgjør 110 prostatakreft vevsprøver og ikke-maligne tilstøtende prøvene 28 godartet prostata vev [34] (GEO tiltredelse antall GSE21036).
Omvendt transkripsjon reaksjon og QRT-PCR
miRNA nivåer ble kvantifisert av TaqMan Micro-RNA Analyser protokollen (Applied Biosystems, Foster City, CA) i henhold til produsentens instruksjoner med mindre endringer. Kort, 5 eller 10 ng små RNA ble omvendt transkribert med MIR-96 spesifikke primere (analyse nr. 000186). RT Produktet ble forsterket i 10 ul reaksjoner ved QRT-PCR i 384-brønners plater på en 7900 HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Prøvene ble kjørt i quadruplicates, og kvantifisering ble utført ved den komparative Delta-Ct-metoden. Logg
2-transformerte verdier ble normalisert ved å dividere med det geometriske gjennomsnittet av de 3 housekeeping gener RNU48, RNU66 og U47 i studiet av pasientprøver. I studiet av MIR-96 uttrykk i vev av ulik menneskelig opprinnelse og PCa cellelinjer det geometriske gjennomsnittet av RNU48 ble RNU66, RNU24 og RNU44 brukt. Ekspresjonen av FOXO1 (primer: Hs01054576m1) i cellelinjer og etter MIR-96 overekspresjon i 22Rv1 celler, ble gjennomsnittet av GAPDH (Hs02758991_g1), og PGK1 (Hs9999906) anvendt som kontroll. Disse housekeeping gener også tjente som kontroll for RNA integritet. Sammen med revers transkripsjon og QRT-PCR, en uten enzym negativ kontroll og ingen mal kontroll ble kjørt for å utelukke PCR forurensning og genomisk DNA.
Cell nummer og cellevekst
Cell nummer ble tellet i tre paralleller av prøver transfektert med MIR-96 etterligne sammenlignet med en negativ kontroll ved fire tidspunkter, 2, 3, 4 og 5 dager etter transfeksjon. Celler ble trypzinised og telles på en Bürkner kammer. Sulforhodamin B (SRB) assay ble brukt for å måle cellevekst indirekte ved farging det totale proteininnhold i celler transfektert med MIR-96 etterligner sammenlignet med celler transfektert med den negative kontroll. Celler ble fiksert i iskald 10% trikloreddiksyre og farget med 0,4% SRB (S9012-5G fra Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) i 1% eddiksyre i 15 min. Ubundet SRB ble vasket bort med 1% eddiksyre. Bundet SRB ble oppløst i 10 mM Tris base og absorbansen ble avlest ved 490 nm ved hjelp ELx808 IE Ultra mikroplateleser (Biotek Instruments, Inc, Winooski, VT). Celler transfektert med MIR-96 ligner ble høstet 72-120 timer etter transfeksjon ble DU145 cellene høstet 72 timer etter transfeksjon, PC3 celler 96 h og 22Rv1 celler 120 timer etter transfeksjon.
Celleproliferering
Celler transfektert med MIR-96 eller den negative kontroll (in triplo) ble inkubert med 5-brom-2-deoksyuridin (BrdU, GE Healthcare, Wauwatausa, WI) ved en fortynning på 1: 1000 i normal vekstmedium. Etter 1 time ble cellene trypsinisert, vasket med PBS og talt i en Bürkner kammer. Cellene ble fiksert i iskald 70% etanol. Fikserte celler ble inkubert med 2M HCl inneholdende 0,2 mg /ml pepsin i 20 minutter for å fordøye celleproteiner. Etter vasking, ble prøvene inkubert med blokkeringsbuffer (1% BSA, 0,5% Tween-20 i PBS). Prøvene ble inkubert med Alexa 488 Fluor® merket BrdU-mus-monoklonalt antistoff (klon MoBU-1) (Kat. Nr. B35139 fra Invitrogen) ved en konsentrasjon på 1:60 i blokkeringsbuffer og inkubert ved RT i 1 time med forsiktig blanding. Prøvene ble vasket med PBS og inkubert med 5 ul av 7-AAD celleviabilitet Solution (Kat. Nr. 559925, BD, Franklin Lakes, NJ) i PBS, i mørket over natten ved 4 ° C Cellene ble analysert på en CyFlow ® Space Partec strømningscytometer.
Western blot
Protein lysates av tre biologiske triplicates ble høstet ved hjelp av M-PER pattedyr Protein Extraction Reagent (Pierce Scientific, Thermo Fisher Scientific Inc.) supplert med Halt
TM Proteasehemmer cocktail (1: 100), (Thermo Fisher Scientific Inc. Cat no 87 785..) og 0,5 mM EDTA. Proteinkonsentrasjonen ble målt på Nanodrop og lik mengde protein prøver ble lastet på en NuPAGE
®Novex 4-12% Bis-Tris prefabrikerte gels (kat. Nr. NP0321BOX, Life Technologies, Carlsbad, CA). Proteinene ble overført til en Immobilon
®-P Transfer Membrane, PVDF (Kat. Nr. IPVH00010, EMD Merck Millipore Corporation, Billerica, Massachusetts). Membranene ble inkubert med FOXO1 (C29H4), Kanin monoklonalt antistoff ved en konsentrasjon på 1: 500 (# 2880, Cell Signaling Technology Inc, Danvers, MA). GAPDH (GAPDH, mus monoklonalt, MAB374, Merck Millipore, Billerica, MA), ble brukt som lasting kontroll. Signaler fra HRP kombinert antistoffer ble generert av ECL
TM Prime Western blotting Detection Reagent (RPN2232 fra GE Healthcare) og oppdaget ved hjelp av en CCD-kamera (LAS-3000, Fujifilm, Tokyo, Japan) og ChemiDoc ™ MP Imaging System (Bio -Rad Laboratories, Hercules, CA). Band intensiteter ble kvantifisert ved hjelp ImageJ programvare og normalisert til GAPDH.
målområde blokkere
Det er to spådd bindingssteder for Mir-96 i FOXO1 3 «ikke-translatert område (3’UTR) på plassering 264-271 og 2139-2146 (Targetscan Menneske, Release 6.2, juni 2012). Target språk blokkere ble utformet for å binde seg til de spådd bindingssteder og flere baser på begge sider av bindingssteder (figur S1). BLO_FOXO1_miR96-1: TTACT + TCAC + GGT + TTGAGTG og BLO_FOXO1_miR96-2: CTTGAAC + CAC + GGT + TTCATGA. Den + er foran «Locked Nukleinsyrer» (LNA
TM) i DNA-sekvenser (Exiqon A /S, Vedbæk, Danmark). Målstedet blokkere ble co-transfektert med MIR-96 etterligne (100 nM) i tre forskjellige konsentrasjoner, 300nm, 600nm eller 1 um. Proteinnivåer av FOXO1 ble kvantifisert ved hjelp av western blot-analyse. Veksten ble målt ved hjelp av SRB analysen etter transfeksjon med MIR-96 etterligne og 600nm av target språk blokkere.
Statistisk analyse
Resultatene ble analysert ved hjelp Graphpad Prism 5 og statistisk signifikans ble beregnet ved hjelp av uparet , tosidige t-test med mindre annet er angitt, og p 0,05 ble betraktet som signifikant. Cuzick trend test ble brukt til å analysere utviklingen av MIR-96 uttrykk i WHO I, II og III i kohort 1. For overlevelsesanalyse en Log-rank (Mantel-Cox) test ble brukt. Spearmans rank korrelasjon ble brukt til å analysere korrelasjonen av MIR-96 uttrykk til PSA nivåer i pasient kohort 1 og til FOXO1 nivåer i det eksterne datasettet.
Resultater
MIR-96 expression korrelater med kliniske parametre
nivåene av MIR-96 har tidligere vist seg å være betydelig høyere ved PCA vev enn i de ikke-PCA vev i kohort 1 [11]. Her prognostiske egenskapene til Mir-96 nivåer, målt ved QRT-PCR på RNA hentet fra FFPE- prostata vev, ble undersøkt. De kliniske kjennetegn ved kohort 1 er grundig beskrevet tidligere [31,32], men en kortere versjon kan sees i tabell S1. Vi fant MIR-96 nivå for å være lavest i BPH (non-PCA) og øker med høyere WHO grad, median MIR-96 uttrykk i BPH = 0,1150, WHO I = 0,1368, WHO II = 0,1767, WHO III = 0,2969 (p 0,0001, Cuzick trend test), som vist i figur 1A. Når PCA prøvene sammenlignes uten å inkludere BPH prøvene Mir-96 uttrykk øker med WHO grad er fremdeles signifikant (p = 0,0498, Cuzick trend test). Dette ble også bekreftet i en annen uavhengig kohort av 93 svenske menn med PCa; median MIR-96 uttrykk i WHO I = 1,620, WHO II = 1,610, WHO III = 2,205. Det er bare seks menn i WHO jeg gruppen, men hvis WHO I og II kombineres, Mir-96 nivåer i WHO III er betydelig høyere (p = 0,0414) (figur 1B). Kliniske karakteristika for kohort 2 er vist i tabell S2. Økt MIR-96 uttrykk korrelerer med økt PSA nivåer i pasientprøver i kohort 1 (figur 1C). En Kaplan-Meier analyse av pasient total overlevelse i kohort 1 ble gjort basert på MIR-96 expression nivåer. Laveste uttrykk kvartal sammenlignet med høy uttrykk i tre fjerdedeler av pasientprøver, deler betydelig PCA pasienter i høy risiko (median overlevelse på 3 år) og lav risiko pasienter (median overlevelse på 4,5 år) (p = 0,0389, log-rank test ), med en hazard ratio på 2,2 (95% KI 1,040 til 4,463), se figur 1D. Siden kohort 2 er en nyere kohort en analyser med overlevelse som endepunkt er ikke mulig enda.
A. MIR-96 uttrykk i pasientprøvene i kohort 1 er lavest i BPH (non-PCA) prøver og øker betydelig med høyere WHO karakterer i PCA prøver (Cuzick trend test p 0,0001). Når BPH prøvene holdes utenfor, er økningen i PCA prøvene alene fremdeles signifikant (Cuzick trend test, p = 0,0498). B. I kohort 2, er MIR-96 uttrykk betydelig høyere i PCA pasienter prøver med gradering WHO III sammenlignet med pasientprøver med gradering WHO I og WHO II kombinert (t-test p = 0,0414). C. Økt PSA nivåer korrelerer med økt MIR-96 uttrykk nivåer i pasientprøvene i kohort 1 (p = 0,0002, Spearman r = 0,4528). D. Kaplan-Meier kurve som viser overlevelse i forhold til Mir-96 uttrykk i kohort 1. Pasientgruppen med høye MIR-96 nivåer (heltrukket linje) har median overlevelse på 3 år og i gruppen med lav MIR-96 nivåer (stiplet linje) har median overlevelse på 4,5 år. Hazard ratio er 2,2. X-aksen viser tiden i år og Y-aksen viser prosentvis overlevelse (Logg rang (Mantel-Cox) test p = 0,0389).
MIR-96 uttrykk i vev og cellelinjer
Mir-96 uttrykk ble målt i vevsprøver av forskjellig opprinnelse og i seks PCA cellelinjer (22Rv1, LNCaP, Vcap, DU145, PNT2 og PC3). I vevsprøver ble høy MIR-96 uttrykk påvist i bitestikkelen, blod, binyrene og prostata. Nivåene i PCA cellelinjer var høyere enn i normal prostata, med det høyeste uttrykk i PC3 og lavest i DU145 cellene (figur 2).
MIR-96 uttrykk nivåer i humane vevsprøver (svarte striper ) og PCA cellelinjer (stripete barer) ble målt ved QRT-PCR og normalisert til geometrisk gjennomsnitt av RNU48, RNU66, RNU24 og RNU44. Høyeste uttrykk ble sett i cellelinjer og prostata (pil) hadde høyt uttrykk i forhold til andre vev.
MIR-96 øker celle nummer og cellevekst i PCA celler gjennom celleformering
Vi fortsatte å undersøke den biologiske rollen MIR-96 i PCA celler
in vitro
. Ektopisk ekspresjon av MIR-96 i forskjellige prostatakreft-cellelinjer øket cellevekst som målt ved hjelp av et SRB-analyse; i DU145-celler (p = 0,0006), 22Rv1 celler (p = 0,0061) og PC3-celler (p = 0,0211) (figur 3A, henholdsvis B og C). Det skal imidlertid bemerkes at hemming av MIR-96 med miRCury LNA-inhibitorer i DU145, PC3 eller 22Rv1 resulterte ikke i forandring i cellevekst målt ved SRB (data ikke vist). Effekten av MIR-96 på cellevekst tilsvarte en effekt på celletall fra DU145-celler, som målt ved celletelling. Ektopisk uttrykk for MIR-96 signifikant øker celle tall fire (p = 0,0316) og fem (p = 0,0396) dager etter transfeksjon (Figur 3D). Dette ble vist å være på grunn av en økning i proliferasjon, som et ektopisk ekspresjon av MIR-96 en signifikant økning i BrdU-inkorporering i DU145 sammenlignet med den negative kontroll (p = 0,0091) (figur 3E). Vi gjorde ikke oppdage en betydelig endring i celler i G1, G2 eller S-fasen mellom cellene transfektert med MIR-96 og den negative kontrollen.
Ektopisk uttrykk for MIR-96 øker cellevekst i PCA celler. A. DU145-celler (p = 0,0006). B. 22Rv1 celler (p = 0,0061). C. PC3 celler (p = 0,0211). Veksten ble målt ved anvendelse av et SRB-analyse. D. Ektopisk uttrykk for MIR-96 øker celle nummer i DU145 cellene fire (p = 0,0316) og fem (p = 0,0396) dager etter transfeksjon. E. Sprednings er betydelig økt i DU145-celler ved overekspresjon av MIR-96 (p = 0,0091), målt ved anvendelse av BrdU-inkorporering og 7-AAD på et strømningscytometer. Gjennomsnittet er representert ved en vertikal linje og feilSøylene viser standard feil av gjennomsnittet. Resultatene ble analysert ved hjelp av uparet, tosidige t-test.
MIR-96 overekspresjon reduserer FOXO1 mRNA og proteinnivåer
Som det har blitt vist i andre krefttyper som MIR -96 kan regulere FOXO1 nivåer og FOXO1 har blitt beskrevet å hemme spredning dette ville forklare den proliferative fenotype av MIR-96. Vi har derfor satt ut for å undersøke effekten av MIR-96 på FOXO1 i PCA celler. Først undersøkte vi de endogene FOXO1 nivåer i prostata cellelinjer. Den høyeste ekspresjon av FOXO1 ble funnet i 22Rv1 og PC3 og lavest i DU145-celler (Fig. 4A). Vi valgte 22Rv1, LNCaP og DU145 som modellsystemer. Overekspresjon MIR-96 signifikant reduserte FOXO1 proteinnivåene i 22Rv1 celler (p = 0,0065), LNCaP-celler (p = 0,0030) og DU145-celler (p = 0,0082) (fig. 4B). De FOXO1 nivåer er også redusert ved MIR-96 overekspresjon i VCap-celler (p = 0,0096), selv om de endogene nivåene av FOXO1 er lav i denne celletype (fig. 4B). Siden avtagende effekt av MIR-96 på FOXO1 ble størst i 22Rv1 celler, bestemte vi oss for å undersøke FOXO1 transkripsjonsnivået i denne cellelinjen. Vi fant at MIR-96 overekspresjon betydelig senket FOXO1 mRNA-nivåer i celler 22Rv1 (p = 0,0341) (fig. 4C). Dette var imidlertid ikke så uttalt som effekten på proteinnivå, noe som indikerer at MIR-96 fungerer både nedverdigende FOXO1 transkripsjon og blokkerer protein translasjonsforskning. FOXO1 inneholder to
i silico
spådd bindingsseter for Mir-96 (Fig. 5A). For å undersøke om Mir-96 bindes direkte til begge disse områdene, effekten av å blokkere hver av de to spådd bindingsseter ble analysert ved hjelp av target språk blokkere spesielt utviklet for hver bindingssetet (fig. S1) og co-transfektert med MIR-96 ligner i 22Rv1 celler. Ved anvendelse av anti-FOXO1 antistoff og sammenligne båndintensitetene til GAPDH, ble det ikke observert noen signifikant økning i FOXO1 proteinnivå når den forutsagte bindingssetet 96,1 ble blokkert, (figur 5B). Imidlertid økte proteinnivået i betydelig grad når det andre bindingssete, ble 96,2 blokkeres, ved hjelp av seks gangers konsentrasjon av den blokker forhold til MIR-96 etterligner (figur 5C). Dette indikerer at effekten av MIR-96 var avhengig av tilgang til det andre området for å være i stand til å redusere de FOXO1 nivåer. Notatet er også at når begge målene plasser blokkere ble kombinert effekten var tapt. Reguleringen av FOXO1 ble ytterligere bekreftet i en ekstern datasettet på 110 PCA pasienter og 28 ikke-maligne prøver godartet prostata vev [34], var MIR-96 uttrykk omvendt korrelerer til uttrykk av FOXO1 i prostata kreft vevsprøver (p = 0,0193 , Spearman, r = -2228) og i de ikke-maligne vevsprøver (p = 0,0029, Spearman, r = -0,5424) hver for seg, så vel som når alle prøvene er samlet (p = 0,0013, Spearman, r = -0,2717) (figur 6).
A. Endogene FOXO1 mRNA nivåer i PCA cellelinjer. mRNA-nivåer ble målt ved QRT-PCR og normalisert til gjennomsnittet av GAPDH og PGK1. B. FOXO1 protein nivåer er betydelig redusert i 22Rv1 celler (p = 0,0065), LNCaP celler (p = 0,0030), DU145 celler (p = 0,0082) og Vcap celler (p = 0,0096) ved MIR-96 overekspresjon. Prøvene viser biologiske triplicates og FOXO1 proteinnivåene ble normalisert til GAPDH protein nivåer. C. FOXO1 mRNA-nivåene er betydelig redusert i 22Rv1 celler etter overekspresjon av MIR-96 (p = 0,0341). Målt ved QRT-PCR og normalisert til gjennomsnittet av GAPDH og PGK1. Feilsøylene viser standard feil av gjennomsnittet.
A. Det er to spådd MIR-96 bindingsseter i FOXO1 3’UTR sekvens. Frøet region av modne MIR-96 og den anslåtte bindingsseter i 3’UTR sekvensen er understreket og fet. Plassering av bindingsstedene er i henhold til Targetscan, (Slipp 6.2, juni 2012). B. 22Rv1 celler ble ko-transfektert i tre paralleller med MIR-96 etterligne og et målområde blokker for bindingssetet 96.1 i tre konsentrasjoner. FOXO1 proteinnivået økte ikke når bindingssete 96,1 ble blokkert. C. Blokkering bindingssete 96.2 med 6x konsentrasjonen av målstedet blokkering i forhold til mir-96 etterligne resulterte i en betydelig økning av FOXO1 proteinnivå (p = 0,0118). FOXO1 protein nivåer ble normalisert til GAPDH. Feilsøylene viser standard feil av gjennomsnittet.
FOXO1 mRNA nivåer inverst korrelert til Mir-96 uttrykk nivåer i en ekstern datasettet [34]. Datasettet inneholder 110 PCA vevsprøver og 28 prøver godartede godartet prostatavevet (GEO sjonsnummer GSE21036) (p = 0,0013; Spearman r = -0,2717)
Effekten av MIR-96 på. cellevekst formidles av FOXO1
neste satt ut for å undersøke om FOXO1 er hovedmålet å formidle vekstfremmende MIR-96 fenotype i prostata celler. Interessant, ved å blokkere det andre MIR-96 bindingssete (96.2) i den FOXO1 3 «UTR-sekvens med målsetet blokkering, er MIR-96 ikke lenger er i stand til å forbedre veksten av DU145-celler som målt ved hjelp av et SRB-analysen (figur 7). Dette styrker hypotesen om at effekten av MIR-96 på cellevekst fremmes utelukkende gjennom FOXO1. Blokkering av første MIR-96 bindingssetet ikke redusere veksten betydelig som ytterligere bekrefter funn at MIR-96 bruker andre MIR-96 bindingssetet for å hemme FOXO1.
MIR-96 forbedrer vekst i DU145 cellene betydelig (p = 0,0005). Blokkering av andre MIR-96 bindingsstedet (96,2) i FOXO1 3’UTR sekvens med et målområde blocker eliminerer effekten av MIR-96 på cellevekst (p = 0,002). Blokkering av første MIR-96 bindingsstedet (96,1) ikke hemme effekten av MIR-96 på cellevekst. Celleveksten ble målt ved anvendelse av et SRB-analyse. Gjennomsnittet er representert ved en vertikal linje og feilSøylene viser standard feil av gjennomsnittet.
Diskusjoner
Høye nivåer av MIR-96 har blitt oppdaget i prostatakreft [5,7, 11] og flere studier viser betydningen av MIR-96 i prostata kreft progresjon. I denne studien, viser vi at økt MIR-96 uttrykk forbinder med progresjon av PCa som Mir-96 uttrykk øker med økt WHO grad i kohorten 1. Dette er ikke sett i kohort 2, som er en mer homogen kohort av radikaler utgjør av 63% WHOII. Videre er den totale overlevelse vesentlig kortere i pasienter som har de høyeste MIR-96 nivåer. Det har også blitt vist for MIR-96-ekspresjon i lungen cancerpasienttumor og serumprøver. Mir-96 uttrykk nivå korrelerer med dårlig postoperativ overlevelse [35].
In vitro
, finner vi at overekspresjon av MIR-96 i PCA cellelinjer fører til økt vekst og spredning, noe som ytterligere bekrefter involvering av MIR-96 ved PCA progresjon. Få mål for Mir-96 har blitt identifisert som forklarer effekten av MIR-96 på PCA celler. I endometrial [16], bryst [17] og leverkreft [18], har MIR-96 er vist å målrette tumor suppressor FOXO1. har blitt rapportert FOXO1 til å bli redusert ved PCA [24,25] og hemming av MIR-96 kan bidra til dette. Her identifiserer vi FOXO1 som et mål av MIR-96 i fire forskjellige PCA cellelinjer med både høye endogene FOXO1 nivåer (22Rv1) samt lave endogene nivåer (Vcap), noe som indikerer at MIR-96 er en potent hemmer av FOXO1 proteinproduksjon. Våre data indikerer at reguleringen skjer på begge transkripsjonelle og translasjonelle nivåer, som mRNA og i enda større grad proteinnivået ble berørt. At hoved regulering skjer på translasjonelt nivå kan være en forklaring på at uttrykket nivåer av MIR-96 og FOXO1 mRNA i prostata cellelinjer er positivt korrelert, med de laveste nivåene i DU145 og med høyeste uttrykk for begge funnet i PC3 celler. Hypotetisk trenden tilsvarer mengden av MIR-96 er nødvendig i hver celletype, for å holde lave FOXO1 proteinnivåer. MIR-96 har vist seg å redusere nivået av mRNA FOXO1 betydelig i leverkreft celler og redusere proteinnivåene svakt [18]. Her viser vi i et PCa cellelinje 22Rv1, at MIR-96 kun bindes til den andre av de to forutsagte bindingssetet (96.2) i det 3′-UTR av FOXO1. I kontrast, ble Mir-96 regulering i brystkreftceller vist seg å være avhengig av tilgang til både bindingssteder [17].
