Abstract
Bakgrunn
tryptase er en serin protease lagret og frigjøres fra mastceller (MCS) som spiller en rolle i tumorangiogenese. I denne studien ønsket vi å evaluere serum tryptase nivåer i colo-endetarmskreft (CRC) pasienter før (STLBS) og etter (STLAS) radikal kirurgisk reseksjon. Vi vurderte også mastcelletettheten positiv til tryptase (MCDPT) og mikrovaskulær tetthet (MVD) i primær svulstvev.
Metoder
En serie av 61 pasienter med stadium B og C CRC (i henhold til den Astler og Coller staging system) ble valgt. Serumblodprøver ble innsamlet fra pasienter en dag før og en dag etter operasjonen. Tryptase-nivåer ble målt ved anvendelse av UniCAP tryptase Fluoroenzymeimmunoassay (Pharmacia, Uppsala, Sverige). Tumor seksjonene ble immunfarget med et primært anti-tryptase-antistoff (klon AA1; Dako, Glostrup, Danmark) og et anti CD-34 antistoff (QB-END 10; Bio-Optica Milano, Italia) ved hjelp av immunhistokjemi og deretter evaluert av bilde analysemetoder.
Resultater
gjennomsnitt ± sD STLBS og STLAS var 5,63 ± 2,61 ug /l, og 3,39 ± 1,47 pg /l henholdsvis, og en signifikant forskjell mellom gjennomsnittsnivåer ble funnet: p = 0,000 ved t-test. Gjennomsnitt ± S.D. av MCDPT og MVD var henholdsvis 8,13 ± 3,28 og 29,16 ± 7,39. En sterk korrelasjon mellom STLBS og MVD (r = 0,83, p = 0,000); STLBS og MCDPT (r = 0,60, p = 0,003); og MCDPT og MVD (r = 0,73; p = 0,001) ble funnet
Konklusjon
Resultatene viste høyere STLBS i CRC pasienter, noe som indikerer en involvering av MC tryptase i CRC angiogenese.. Data også indikert lavere STLAS, noe som tyder på utgivelsen av tryptase fra tumor infiltrere MCs. Serum tryptase nivåer kan derfor spille en rolle som en roman bio-markør prediktiv av respons på radikal kirurgi. I denne sammenheng tryptase hemmere som Gabexate og Nafamostat mesilat kan bli evaluert i adjuvant kliniske studier som en ny anti-angiogen tilnærming
Citation. Ammendola M, Sacco R, Sammarco G, Donato G, Montemurro S, Ruggieri E, et al. (2014) Sammenheng mellom Serum tryptase, mastceller Positive til tryptase og Mikrovaskulær tetthet i Colo-endetarmskreft pasienter: Mulig Clinical Biologisk-betydning. PLoS ONE 9 (6): e99512. doi: 10,1371 /journal.pone.0099512
Redaktør: Michael Muders, Universitetssykehuset Carl Gustav Carus Dresden, Tyskland
mottatt: 02.12.2013; Godkjent: 15 mai 2014; Publisert: 10 juni 2014
Copyright: © 2014 Ammendola et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Angiogenese er en kompleks prosess som er involvert i vekst, invasjon og metastasering av flere humane og animalske svulster [1] – [3]. Mastceller (MCS) gripe inn i denne prosessen frigjøre klassiske pro-angiogene faktorer, slik som vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), tymidinfosforylase (TP), fibroblastvekstfaktor-2 (FGF-2) og interleukin-6 (IL- 6), så vel som ikke-klassiske pro-angiogene faktorer, slik som tryptase, som er lagret i deres sekresjonsgranuler [4] – [8]. Data fra eksperimentelle tumormodeller viser at MCS akkumuleres nær til tumorceller før utbruddet av angiogenese, og at de er nødvendige for makroskopisk utvidelse og metastatisk spredning av primær tumorceller. Bevis for en bestemt rolle for MCs har blitt rapportert i animalske og menneskelige kreftformer, som MC svulster, hode og nakke, mage, colo-endetarms, lunge og hudmaligniteter, hvor MC tetthet er sterkt korrelert med graden av tumor angiogenese [9 ] – [19]
tryptase er en nøytral serinprotease med en molekylvekt på 134 kDa og en tetramer struktur som består av ikke-kovalent bundne subenheter.. Fire forskjellige former av tryptase er blitt identifisert i menneske MCS hittil: α-, β-, γ- og δ-tryptase [20]. Av disse α- og β-tryptase er de to beste sirkulasjons isoformer beskrevet. α-tryptase stadig løslatt fra MCs i blodet. β-tryptase blir selektivt konsentreres i de sekretoriske granuler av MCS og frigis først etter degranulering. Tilstedeværelsen av en høy konsentrasjon av β-tryptase i blodet er derfor et klart uttrykk for MC-aktivering [21] – [23]. Eksperimentelle studier har vist utgivelsen av tryptase fra MCs å være en potent angiogen stimulus som er i stand til å indusere neo-vascolarization både i
vitro og in vivo
og er derfor involvert i kreftutvikling.
i denne pilotstudien, vi analysert serum tryptase nivåer (STLs) i CRC pasienter før (STLBS) og etter (STLAS) radikal kirurgisk reseksjon; MC tetthet positive til tryptase (MCDPT); og mikrovaskulær tetthet (MVD) i primær tumor vev for å korrelere hver til de andre, og for å evaluere STLs som en mulig bio-markør prediktive for respons på radikal kirurgi. I denne sammenheng kan inhibering av tryptase ved hjelp av gabexate og nafamostat bli evaluert i kliniske forsøk adjuvant som en ny anti-kreftterapi [24] -. [26]
Materialer og metoder
Studie Bestander
En serie av 61 CRC pasienter observert ved klinisk kirurgi Unit av «Magna Graecia» University of Catanzaro ble valgt. Helical computertomografi av thorax, abdomen og bekken avslørte at ingen pasienter hadde fjernmetastaser. Ulike kirurgiske tilnærminger ble brukt: venstre og høyre åpen hemicolectomy for tykktarmskreft; åpen fremre reseksjon, total meso-rektal excision og åpen mage–perineal reseksjon for endetarmskreft [27] – [30]. Pasienter med stadium B og C CRC henhold til Astler og Coller iscenesettelse system ble registrert. I den globale serien var det 61 adenokarsinomer; histopatologisk gradering ble utført i henhold til den AJCC 7
th Edition [31] – [32]. De klinisk-patologiske trekk ved pasientene er oppsummert i tabell 1. Full etisk godkjenning og signert samtykke fra den enkelte pasient ble oppnådd å gjennomføre studien. Det fulle navnet på etikk institusjonelle komité gjennomgang styret som godkjente vår studie er:. Universitetssykehus Ethics Committee «Mater Domini», Germaneto, Catanzaro, Italia
prøveopparbeidelse
Blodprøver ble samlet 07:00 til 09:00 etter faste over natten, en dag før og en dag etter kirurgisk reseksjon av svulsten. Prøvene ble umiddelbart fordelt i reagensglass med serum separator rør uten tilsetninger (Becton Dickinson Systems Vacutainer Hemogard, Plymouth, UK) og igjen i minst 30 minutter ved romtemperatur for å tillate en fullstendig clotting prosess. Prøvene ble deretter sentrifugert ved 1500 x g i 15 minutter ved romtemperatur og supernatanten ble utvunnet. Pasientserum ble oppnådd, ble oppsamlet, alikvotert og frosset ved -80 ° C inntil analysefasen.
Før oppstarting av den analytiske fasen ble prøvene tint til romtemperatur og blandet grundig ved å virvle ved lav hastighet for å kunne eliminere eventuelle rester av fibrin eller andre partikler potensielt påvirker reproduserbare resultater. Lipemiske eller hemolyserte prøver potensielt forstyrrende inn på analysen ble ekskludert fra den analytiske vurdering.
Serum tryptase-nivåene ble målt ved hjelp av fluor-enzym-immunoassay (feia) for hver prøve, ved hjelp av Uni-CAP100 (Pharmacia Diagnostics AB, Uppsala , Sverige).
Immunohistochemistry
for evaluering av MCPT og MVD en tre-lags biotin-avidin-peroxydasesystemet ble utnyttet [33]. Kort beskrevet ble 4 um tykke seriesnitt av formalinfiksert og parafin-innleiret tumorprøve og tilstøtende normal slimhinne kuttet. Snittene ble deretter varmes i mikrobølgeovn ved 500 V i 10 minutter, hvoretter endogen peroxidise aktivitet ble blokkert med 3% hydrogenperoksydoppløsning. Tumor seksjoner ble inkubert med et anti-tryptase (klon AA1; Dako, Glostrup, Danmark) fortynnet 1:100 i 1 time ved romtemperatur, og et anti-CD34-antistoff (QB-END 10; Bio-Optica Milano, Italia) fortynnet 1 :50 i 1 time ved romtemperatur som en pan-endotelial markør respektivt. Tilstøtende normal slimhinne seksjoner ble inkubert med et anti-tryptase (klon AA1; Dako, Glostrup, Danmark) og deretter behandlet på ovennevnte måte. Tumor snitt ble også inkubert med et anti-VEGF (Clone VG-1) (Dako Glostrup, Danmark), fortynnet til 1:200 i 1 time ved romtemperatur. Den bundne antistoff ble visualisert ved anvendelse av en biotinylert sekundært antistoff, avidin-biotin kompleks peroxidise og rask rød. Nuclear kontra ble utført med Gills hematoksylin no. 2 (Polysciences, Warrington, PA, USA). Den primære antistoff ble utelatt i negative kontroller.
Morphometrical analysen
Et bilde analysesystem (Quantimet500 Leica, Wetzlar, Tyskland) ble benyttet [34]. I tumorsnitt fem mest immunostained områder (hot spots) ble valgt ved lav forstørrelse og individuell MCDPT (Fig. 1A) og MVD (Fig. 1B) ble talt ved x400 forstørrelse (0,19 mm
2 område). Detaljene ble evaluert ved x1000 forstørrelse i olje (fig. 2A og 2B). I tilstøtende normal slimhinne seksjoner fem mest immunostained områder (hot spots) ble valgt ved lav forstørrelse og individuell MCDPT (Fig. 3A) ble talt ved x400 forstørrelse (0,19 mm
2 område). I svulstvev VEGF uttrykk ble evaluert (Fig 3B).
I en primær anti-tryptase antistoff har vært ansatt. Pilene viser røde mastceller positive til tryptase. I B en primær anti CD-34 antistoff som er blitt anvendt. Pilene viser rød positive microvessels.
I en primær anti-tryptase antistoff har vært ansatt. De store piler indikerer enkelt røde mastceller positive til tryptase. Den lille pilen indikerer degranulation forsiden av mastcelle danner en microvessel. I B en primær anti CD-34 antistoff som er blitt anvendt. Den store pilen indikerer en rød positiv microvessel. Den lille pil indikerer kjernen av endotelcelle. Merk lumen av microvessel.
I en primær anti-tryptase antistoff har vært ansatt. Pil viser et enkelt og unike røde mastceller positive til tryptase i den observerte feltet. I B en primær anti-VEGF-antistoff er blitt anvendt. Mange røde immunfargete kreftceller. Store piler indikerer enkelt røde cytoplasmatiske kreftceller positive til VEGF.
Statistisk analyse
MCDPT og MVD gjennomsnittsverdier ± 1 standardavvik (SD) ble evaluert av to uavhengige observatører (GR og GD) for hver tumorprøve, og i alle serier av seksjoner. MCDPT middelverdier ± SD 1 ble også evaluert for hver tilstøtende normal slimhinne. Sammenhenger mellom STLs, ble MCDPT, og MVD beregnet ved hjelp av Pearsons (r) analyse. Sammenhenger mellom de ovennevnte indekser og klinisk-patologiske funksjoner oppført i tabell 1 ble analysert av Chi-kvadrat test. Alle statistiske analyser ble utført med SPSS statistisk programvare pakken (SPSS Inc., Chicago, IL).
Resultater
gjennomsnitt ± standardavvik STLBS og STLAS var 5,63 ± 2,61 pg /l og 3,39 ± 1,47 pg /l henholdsvis, og en signifikant forskjell mellom gjennomsnittsnivåer ble funnet: p = 0,000 ved t-test (tabell 2, fig. 4). I tumorvev gjennomsnitt ± S.D. av MCDPT og MVD var 8,13 ± 3,28 og 29,16 ± 7,39 (Tabell 2). (. R = 0,83, p = 0,000, figur 5) En signifikant korrelasjon mellom STLBS og MVD, STLBS og MCDPT (r = 0,60, p = 0,003, figur 6.), Og MCDPT og MVD (r = 0,73; p = 0,001 , fig. 7) ble funnet. I tilstøtende normal slimhinne gjennomsnitt ± S.D. av MCDPT var 2,63 ± 1,17 (Fig. 3A). En vesentlig forskjell mellom tumorvev MCDPT bety og tilstøtende normal slimhinne MCDPT midlere ble funnet (p = 0,000). VEGF-ekspresjon viste en sterk cytoplasmisk farging i kreftvev (Fig. 3B), men basert på tidligere publiserte data som viser en sterk ekspresjon av VEGF i CRC vev og blodfraksjonen fra pasienter i forhold til tilstøtende normal slimhinne og friske kontroller henholdsvis data ikke ble vist [35] -. [38]
Ingen andre signifikante sammenhenger mellom de ovennevnte indeksene og de viktigste klinisk-patologiske funksjoner oppført i tabell 1 ble funnet .
Diskusjoner
i denne pilotstudien vi har vist for første gang at STLBS sterkt korrelerer med MCDPT og MVD i primær svulstvev. Våre data viser også at STLs redusere etter kirurgisk reseksjon i CRC pasienter med en betydelig lavere verdi på STLAS. På grunn av utgivelsen av tryptase fra MC aktivering, foreslår vi at MCDPT i primær CRC svulstvev representerer den viktigste kilden til serum tryptase. I vår hypotese, hvis primære svulst vev er fjernet fullstendig STLs bør reduseres på en dag på grunn av deres omtrent 4 timer lang levetid. Av disse grunner, vi har oppdaget STLs 24 timer før kirurgi for å evaluere deres mulige rolle som en sirkulerende biomarkør som tyder på tilstedeværelsen av tumorvevet, og igjen 24 timer etter behandling for å bekrefte konsentrasjonen reduseres og, som en konsekvens, er det mulig innblanding av fraværet av svulstvev. Vi utdype bakgrunnen for vår hypotese basert på tidligere utgitt pilot data som foreslått en økning på MCDPT i primær svulstvev, og her våre resultater bekreftes også de innrapporterte data (Fig 1A, 3A). I disse studiene STLBS og MCDPT var korrelert med MVD, noe som tyder på deres rolle i CRC angiogenese. Våre data er enig med en tidligere publisert studie som viste en involvering av MCs i forskjellige maligniteter som hematologiske maligniteter, melanom, brystkreft, mage- og colo-endetarms kreft, og også i dyretumormodeller [38] – [43]. Men de ovennevnte studiene ikke fokusere på endringene i STLs før og etter operasjonen, og ingen sammenheng mellom STLs ble MCDPT og MVD evaluert. Interessant er tryptase løslatt fra MCs involvert i tumor angiogenese ved flere mekanismer: for det første, stimulerer tryptase dannelsen av vaskulære rør i
in vitro Hotell og
in vivo
eksperimentelle modeller; for det andre, er tryptase en agonist av proteinase-aktivert reseptor-2 i vaskulære endotelceller som i sin tur induserer angiogenese [44]; for det tredje, kan tryptase stimulerer frigjøringen av latente angiogene faktorer som er bundet til den ekstracellulære matrisen [45] – [47]. Betraktet sammen, de ovenfor angitte data antyder at tryptase kan være en potensiell surrogat bio-markør av tumor angiogenese, som er i stand til å forutsi responsen til kirurgisk behandling.
Derfor, med den primære kilde til tryptase produksjon ikke lenger eksisterende, etter 24 ha betydelig reduksjon i STLs bør forventes. Hvis forhøyede STLs vedvarer etter operasjonen, vil dette antyde at resttumorvevet forblir etter kirurgisk reseksjon eller, alternativt, det ukjente metastaser er til stede. I denne sammenheng kan flere tryptase hemmere som Gabexate eller Nafamostat mesilat vurderes i fremtidige kliniske studier som en ny anti-tumor og anti-angiogenic tilnærming.
Takk
Forfatterne ønsker å takke Caroline Oakley for manuskript redigering.
