Abstract
Bakgrunn
Androgen deprivasjon terapi (ADT) er førstelinjebehandling for metastatisk prostatakreft (PCA). Imidlertid vedvarende ekspresjon og funksjon av androgenreseptoren (AR) genet bidra til utviklingen av resistente kastrerings prostatakreft (CRPC). I tillegg kan svulster tilpasse PI3K /AKT overlevelse vei å flykte ADT. Co-targeting AR og PI3K /AKT signalering har blitt foreslått å være en mer effektive terapeutiske midler for CRPC pasienter. Mange kliniske studier pågår for å teste om PI3K /AKT-hemmere er gunstig for PCA pasienter. Men hvorvidt disse hemmere har noen konsekvenser for de uttrykk for full lengde AR (AR-FL) og dens spleisevariant (AR-V7) er fortsatt uklart.
Metoder
Fire menneskelige prostata kreft cellelinjer (LNCaP, LNCaP95, Vcap og 22Rv1) med ulike genetiske bakgrunn ble behandlet med fem PI3K /AKT-hemmere (LY294002, Wortmannin, BKM120, Akti og AZD5363) og eller AKT siRNA. AR og AR-V7 protein og mRNA nivåene ble målt ved immuno og real-time PCR-analyser. AR gentranskripsjon initiering, alternativ RNA-spleising og AR mRNA nedbrytningsrater ble også bestemt.
Resultater
PI3K /AKT-hemmere hadde ulike effekter på AR protein uttrykk primært gjennom endringer av AR gentranskripsjon initiering og RNA-spleising. Imidlertid forble uendret i nærvær RNA Slå av AKT genene disse effektene.
Konklusjon
PI3K /AKT-hemmere har off-target effekter på AR genuttrykk i prostatakreftceller, som skal være vurderes når du søker disse hemmere til PCA pasienter, spesielt pasienter under ADT behandling
Citation. Liu L, Dong X (2014) Komplekse Konsekvenser av PI3K /AKT-hemmere til androgen Receptor genuttrykk i prostata kreft celler. PLoS ONE 9 (10): e108780. doi: 10,1371 /journal.pone.0108780
Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 18 juli 2014; Godkjent: 03.09.2014; Publisert: 31 oktober 2014
Copyright: © 2014 Liu Dong. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet har mottatt driftsstøtte fra kanadiske Institutes of Health Research (MOP-137007) og en Rising Star Award fra Prostate Cancer Canada (RS2013- 58) til Xuesens Dong. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
androgen deprivasjon terapi (ADT) er standard behandling for metastatisk prostatakreft (PCA). Imidlertid progresjon til kastrering motstandsdyktig prostatakreft (CRPC) forekommer til fleste pasientene [1]. CRPC tumorer opprettholde ekspresjon av AR og dets regulerte gener, noe som indikerer at AR signale fortsetter å fungere [2] – [5]. Flere mekanismer har blitt foreslått for avvikende AR re-aktivering post ADT inkludert: i) AR genamplifisering og få-av-funksjon mutasjoner [4], [6] – [9]; ii) endringer i uttrykk og funksjon av sentrale AR co-regulatorer [10] – [12]; og iii) viktigere, generering av ligandbindende domene avkortede AR spleisevarianter (AR-Vs) [13] – [16] som konstitutivt aktivere AR signalering. Blant disse variantene, AR-V7 (også kalt AR3) er den mest rikelig uttrykt AR-V i PCa [13], [14], [17]. AR-V7 protein nivåer er signifikant forhøyet i CRPC svulster og nært forbundet med kortere pasientoverlevelse [13], [14], [18]. Disse funnene understreker at blokkering AR genekspresjon og funksjon er fortsatt en viktig terapi.
I tillegg er phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /AKT /mammalian target of rapamycin (mTOR) signale ofte aktiveres ved PCA og har vært vist seg å spille en viktig rolle for CRPC progresjon og resistens overfor terapi-fremkalt celledød [19], [20]. Genetiske endringer av komponentene av PI3K /AKT /mTOR sti forekom hos 42% av primære prostatakreft og 100% av metastatiske tumorer [19]. Enda viktigere, gjensidig tilbakemelding aktivering av AR og PI3K /AKT veier var blitt påvist, noe som tillater at kreftcellene for å tilpasse hver vei for å overleve når den andre er farmakologisk inhiberes [21], [22]. Disse funnene gir en begrunnelse som co-targeting begge veier kan oppnå bedre resultater for CRPC pasienter.
Det er flere hemmere rettet mot ulike sentrale deler av PI3K /AKT banen, herunder PI3K, AKT og mTOR. Imidlertid har PI3K-inhibitorer så som LY294002 også blitt vist å binde og inhibere andre kinaser som ikke hører til den PI3K /AKT signalering [23], [24]. I tillegg har studier vist at når mTOR aktivitet hemmes av noen AKT-inhibitorer, kan det utløse en tilbakekoplingsmekanisme som resulterer i re-aktivering av AKT eller mitogenaktiverte protein [25], [26]. Sammen utgjør disse funnene indikerte at utover å undertrykke AKT nedstrøms effektbokser, kan off-target effekter av AKT hemmere produsere dype konsekvenser for kreftceller. Spørsmålet gjenstår å besvare er om PI3K /AKT-hemmere kan endre uttrykk for full lengde AR (AR-FL) og AR-V7 i PCA celler, som kunne motvirke effekten av ADT.
I denne studie, fire PC-cellelinjer ble behandlet med fem PI3K /AKT-inhibitorer. Vi målte både AR mRNA og proteinnivåer og bestemt AR gentranskripsjon initiering, RNA-spleising og AR mRNA nedbrytningshastigheter. Vi rapporterte det fantes komplekse konsekvensene av PI3K /AKT-hemmere til AR genuttrykk som er uavhengige til AKT knockdown. Disse off-target effekter på AR genekspresjon må vurderes når du søker PI3K /AKT-hemmere til PCA pasienter.
Materialer og Metoder
Prostatakreft cellelinjer, PI3K /AKT-hemmere og siRNA transfeksjon
LnCap, VCap og 22Rv1 humane prostatacancercellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). LNCaP celler var mellom 42-50 passasjer. LNCaP95 cellelinjen ble gitt av Dr. Plymate (University of Washington) og ble rapportert i tidligere studier [14], [27], [28]. Det er avledet fra LNCaP-celle og har fått motstandsevne mot androgen uttømming forhold. Både LNCaP og LNCaP95 uttrykke mutant AR (T877A) som kan aktivere AR av et bredt spekter av steroider eller steroid analoger. De uttrykker også mutant fosfatase og tensin homolog (PTEN) gen som konstitutivt aktiverer AKT. Vcap celler uttrykker villtype AR og PTEN. Men de har AR genamplifisering resulterer i høyere nivåer av AR-FL og AR-V7 uttrykk. 22Rv1 celler uttrykker villtype PTEN, men har genet omorganisering av AR genet resulterende høye nivåer av AR-V7 uttrykk. Til sammen utgjør disse fire PCA-cellelinjer som representerer et bredt spekter av genetiske endringer av PCA-celler. LY294002 og Wortmannin ble kjøpt fra Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI). NVP-BKM120 og AZD5363 var fra Selleck Chemicals (Houston, TX). Akti (CAT # 124005) var fra EMD Millipore (Rica, MA). Kontroll og AKT sirnas (CAT #: J-003000, J-003001 og J-003002 for AKT 1-3 isoformer henholdsvis) var fra Dharmacon (Ottawa, Ontario). Sirnas ble transfektert inn i PCA celler ved hjelp siLentFect Lipid Reagens fra Bio-Rad (Mississauga, ON) i henhold til produsentens protokoll.
immunoblotting analyser
Protein lysates ble samlet inn med lysebuffer (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% NP40, 0,5% natriumdeoksycholat og 0,1% SDS) supplert med protease og fosfatase-inhibitorer fra Roche (Laval, QC) som vi beskrevet [29]. Protein konsentrasjon av hver prøve ble bestemt ved hjelp av BCA kit fra Pierce (Rockford, IL) i henhold til produsentens instruksjoner. Proteinprøver ble separert ved SDS-PAGE-geler, overført til polyvinyldifluorid (PVDF-membraner) og blottet med antistoffer som er angitt. Forsøkene ble gjentatt minst tre ganger, og ett sett av de representative blottene ble vist. Antistoff informasjonen i Tabell S1.
Real-Time PCR
Real-Time PCR-analyser ble utført som vi beskrev [30], [31]. Total RNA ble ekstrahert ved hjelp Purelink RNA mini kit fra Invitrogen (Burlington, ON) i henhold til produsentens instruksjoner. Real-time PCR ble utført i tre paralleller bruker Applied Biosystems7900HT med 5 ng av cDNA, 1fiM av hver primer par og SYBR Grønn PCR Master Mix fra Roche (Laval, QC). Alle real-time PCR-analyser ble utført ved hjelp av tre tekniske replikater og tre uavhengige cDNA synteser. Primer informasjonen i Tabell S1.
Nuclear run-on-analysen
Nuclear kjøre på analysene ble utført som beskrevet [32] med mindre modifikasjoner. LnCap og LNCaP95-celler ble behandlet i 18 timer med kjøretøyet, LY294002, AZD5363 eller siRNA mot AKT1-3 isoformer. Helt 6 x 10
6-celler ble vasket med kald PBS, høstet og lysert på is i 0,5% Nonidet P-40 lyseringsbuffer [10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2] og sentrifugerte ved 500 x g i 10 min. Supernatantene ble fjernet og kjerner ble inkubert i reaksjonsbuffer [10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM MgCl2, 0,3 mM KCl] inneholdende 2,5 mM NTP pluss biotin-16-UTP blanding fra Roche (Laval, QC) i 45 min ved 30 ° C. Biotinylerte begynnende RNA transkripsjoner ble fremskyndet av streptavidin perler fra Gold Bioteknologi (St. Louis, MO) og vasket med saltvann natriumcitratbuffer pluss 15% formaldehyd. Utfelt RNA ble eluert fra streptavidin perler og brukes som maler for real-time PCR-analyser med primere forsterke mRNA av totalt AR eller 18S rRNA (18rS) som beskrevet i tabell S1. Resultatene ble plottet som gjennomsnitt ± SEM fra tre uavhengige ganger i hver eksperimentell betingelse.
RNA spleising analysen av AR genet
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp Purelink RNA mini kit fra Invitrogen (Burlington, ON ). Real-time PCR ble gjennomført for å måle AR genet RNA-spleising. Den relative AR-FL og AR-V7 spleising effektivitet ble bestemt ved normalisering med en intern PCR produktet innen AR eksoner 2 og 3. Primer informasjonen ble oppført i tabell S1. Alle real-time PCR-analyser ble utført ved hjelp av tre tekniske replikater og tre uavhengige cDNA synteser.
statistikker
Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. For å bestemme forskjellene mellom eksperimentelle grupper, enveis ANOVA etterfulgt av student
t
-test ble utført ved anvendelse av GraphPad Prism (versjon 4) med signifikansnivå satt til P 0,05 som *, P 0,01 som ** og P . 0.001 som ***
Resultater
Konsekvenser av PI3K /AKT-hemmere til AR protein nivåer i PCA celler
LY294002 er et sterkt konkurranse inhibitor til PI3K og hindrer PI3K fra fosforylering og aktivering av nedstrøms effektorer av AKT [33]. Wortmannin er en kovalent inhibitor av PI3K som irreversibelt hemmer AKT-fosforylering [34]. LY294002 trykt AR-FL proteinnivåer i LNCaP-celler (fig. 1A), inhiberte både AR-FL og AR-V7 proteinnivåer i LNCaP95 celler (Fig. 1B). Både LNCaP og LNCaP95 celler er PTEN manglende celler, der AKT er konstitutivt aktiv i sin fosforylering form (p-AKT). Både LY294002 og Wortmannin sterkt inhibert p-AKT nivåene i begge cellelinjer. Densitometry analyser på proteinuttrykk av AR-FL, AR-V7 og p-AKT ble målt (Fig. 1C). Interessant, både LY294002 og Wortmannin trykt AR-FL og AR-V7 proteinuttrykk i Vcap celler (Fig. 2A). Men økt LY294002 AR-FL, men redusert AR-V7 proteinnivåer i 22Rv1 celler (Fig. 2B). Wortmannin hemmet både AR-FL og AR-V7 proteinuttrykk i Vcap og 22Rv1 celler. Densitometry analyser på proteinuttrykk av AR-FL og AR-V7 ble analysert (Fig. 2C). Siden Vcap og 22Rv1 celler er PTEN nok celler, hvor p-AKT er på svært lave /ikke målbare nivåer med mindre oppstrøms tyrosin kinase reseptorer aktiveres, effekten av LY294002 til AR protein uttrykk i Vcap og 22Rv1 cellene ble ikke sannsynlig relatert til AKT aktivering . BKM120 er en pan-PI3K-inhibitor, men ikke til mTOR [35]. BKM120 effektivt undertrykt p-AKT nivåer i både LNCaP og LNCaP95 celler. Men BKM120 hadde ingen effekter på AR-FL og AR-V7 protein nivåer i alle fire PCA cellelinjer (Fig. 1-2). Akti er et konkurranse phosphatidylinositol eter analog at dokker inn i pleckstrin homolgy (PH) domene av AKT, hindrer AKT trans å PI3K på plasmamembranen og dermed hemmer AKT fosforylering og aktivering [36]. Akti viste ingen undertrykkende effekter til AR-FL eller AR-V7 protein nivåer (Fig. 1-2). AZD5363 er en ATP-kompetitiv hemmer av AKT [37], [38]. Den økte både AR-FL og AR-V7 proteinnivåer og induserte p-AKT nivåer i LNCaP og LNCaP95 celler (Fig. 1). Men det redusert AR-FL og AR-V7 proteinnivåer i PTEN tilstrekkelig VCap og 22Rv1 celler (Fig. 2).
(A) LNCaP og (B) LNCaP95 celler ble behandlet med økende doser av PI3K /AKT-inhibitorer LY294002 (0, 25, 50 pM), Wortmannin (0, 0,5 og 1 uM), BKM120 (0, 0,5 og 1 uM), Akti (0, 5 og 10 uM) eller AZD5363 (0, 2,5 og 5 uM ) i 18 timer. Protein lysates ble immunoblottet med AR (N-20), AR-V7, Pan-AKT, fosfor-AKT (ser473) og p-aktin antistoffer. (C) Resultater ble gjentatt minst tre uavhengige eksperimenter. Densitometri analyse av proteinbånd ble målt ved bilde J programvare og plottet som midlere + SEM. Enveis ANOVA etterfulgt av student t-test ble utført med * som P 0,05, ** som P 0,01 og *** som P . 0.001
(A) Vcap og (B ) 22Rv1 celler ble behandlet med økende doser av PI3K /AKT-inhibitorer LY294002 (0, 25, 50 pM), Wortmannin (0, 0,5 og 1 uM), BKM120 (0, 0,5 og 1 uM), Akti (0, 5 og 10 uM) eller AZD5363 (0, 2,5 og 5 uM) i 18 timer. Protein lysates ble immunoblottet med AR (N-20), AR-V7, Pan-AKT, fosfor-AKT (ser473) og p-aktin antistoffer. (C) Resultater ble gjentatt minst tre uavhengige eksperimenter. Densitometri analyse av proteinbånd ble målt ved bilde J programvare og plottet som midlere + SEM. Enveis ANOVA etterfulgt av student t-test ble utført med * som P 0,05, ** som P 0,01 og *** som P . 0.001
Konsekvenser av PI3K /AKT-hemmere til AR mRNA nivåer i PCA celler
AR mRNA nivåer ble også målt i PCA cellelinjer etter behandlinger av PI3K /AKT-hemmere. Endringene av AR-FL og AR-V7 mRNA-nivåer (fig. 3) var i samsvar med hva ble observert i AR proteinnivåer som vist i figur 1 og 2. LY294002 og Wortmannin redusert både AR-FL og AV-7 mRNA-nivåer i alle PCA cellelinjer, bortsett fra at LY294002 økt AR-FL mRNA nivåer i 22Rv1 celler. BKM120 og Akti hadde ingen vesentlige konsekvenser i AR mRNA nivåer. AZD5363 økt AR-FL og AR-V7 mRNA nivåer i LNCaP og LNCaP95 celler, men reduserte sine mRNA nivåer i Vcap og 22Rv1 celler med statistisk signifikans. Disse resultatene antydet at PI3K /AKT-inhibitorer påvirkes AR-genekspresjon i første rekke på mRNA-nivå.
LNCaP, LNCaP95, VCap og 22Rv1 celler ble behandlet med økende doser av PI3K /AKT-inhibitorer LY294002 (0, 25, 50 pM) , Wortmanin (0, 0,5 og 1 uM), BKM120 (0, 0,5 og 1 uM), Akti (0, 5 og 10 uM) eller AZD5363 (0, 2,5 og 5 uM) i 18 timer. AR-FL (A) og AR-V7 (B) mRNA uttrykk nivåer i forhold til 18rS ble bestemt ved real-time PCR. Resultatene var fra tre uavhengige RNA ekstraksjon med tredoble Real-Time PCR-analyser på hver RNA prøve. Data ble plottet som gjennomsnitt + SEM. Enveis ANOVA etterfulgt av student t-test ble utført med * som P 0,05, ** som P 0,01 og *** som P . 0.001
Konsekvenser av AKT knockdown til AR genet uttrykk
for ytterligere å undersøke om virkningene av LY294002 og AZD5363 på AR protein og mRNA nivåer ble formidlet gjennom AKT, vi utførte AKT knockdown-analyser ved hjelp av samlet siRNA mot alle tre AKT1-3 isoformer. Effektiviteten av AKT siRNA ble vist ved Western blotting (fig. 4A-B). Vi har observert at uansett tilstedeværelsen av AKT knockdown, LY294002 fortsatt kan dramatisk redusere AR-FL og AR-V7-proteinet (fig. 4A) og mRNA (fig. 4C) nivåer i LNCaP, LNCaP95 og VCap-celler. LY294002 oppregulert AR-FL uttrykk, men redusert AR-V7 uttrykk i 22Rv1 celler. I tillegg observerte vi at AZD5363 betydelig økt AR-FL uttrykk i LNCaP og LNCaP95 celler og redusert AR-FL og AR-V7 i VCap og 22Rv1 celler, som bevirker forble uforandret selv i nærvær av effektiv AKT knockdown (fig. 4B og 4D). Sammen utgjør disse resultatene indikerte at virkningene av LY294002 og AZD5363 til AR uttrykk var uavhengig til AKT og nedstrøms effektorer.
LNCaP, LNCaP95, Vcap og 22Rv1 celler ble transfektert med kontroll eller samlet siRNA for AKT 1-3 isoformer i 36 timer. Cellene ble deretter ytterligere behandlet med 50 pM LY294002 (A) eller 5 pM AZD5363 (B) i ytterligere 18 timer. Protein lysates ble immunoblottet med AR (N-20), AR-V7, Pan-AKT, p-AKT (ser473) og p-aktin antistoffer. Resultatene ble gjentatt i mer enn tre uavhengige eksperimenter. Densitometri analyse av proteinbånd ble målt ved bilde J programvare og plottet som midlere + SEM. (C) AR-FL og (D) AR-V7 mRNA uttrykk nivåer i forhold til 18rS ble bestemt ved real-time PCR. Resultatene var fra tre uavhengige RNA ekstraksjon med tredoble Real-Time PCR-analyser på hver RNA prøve og plottet som gjennomsnitt + SEM. Student t-tester ble utført sammenligning mellom kjøretøy og LY294002 /AZD5363 behandlinger med * som P 0,05; ** Som P 0,01 og *** som P . 0.001
LY294002 og AZD5363 påvirke AR gentranskripsjon initiering, RNA-spleising og AR mRNA stabilitet
Konsekvensene av LY294002 og AZD5363 på AR mRNA nivåer kan være på flere mulige nivåer, inkludert AR gentranskripsjon initiering, pre-mRNA spleising og AR mRNA degradering. Ved hjelp av kjernefysisk kjøre-på analysen, vi målt både AR og 18rS gentranskripsjon innvielses priser i nærvær av kjøretøy eller PI3K /AKT-hemmere (Fig. 5A). Den 18rS-genet ble anvendt som en intern kontroll som dets mRNA-nivåer ble ikke påvirket av PI3K /AKT-inhibitorer. Vi viste at LY294002 hemmet, mens AZD5363 forbedret AR genet transkripsjonsinitieringen priser i forhold til 18rS både LNCaP og LNCaP95 celler. Videre slå ned AKT endret ikke AR gentranskripsjon priser.
(A) LNCaP og LNCaP95 celler ble behandlet med kjøretøy, 50 pM LY294002 eller 5 um AZD5363 i 18 timer (til venstre). LNCaP og LNCaP95 cellene ble også transfektert med kontroll eller AKT1-3 sirnas i 48 timer (til høyre). Atom run-on analysene ble utført som beskrevet i Materiale og metode delen. (B) LNCaP og LNCaP95-celler ble transfektert med kontroll eller sammenslått siRNA for AKT 1-3 isoformer i 36 timer. Celle ble deretter ytterligere behandlet med 50 pM LY294002 eller 5 uM AZD5363 i ytterligere 18 timer. RNA-spleising analyser for AR-FL og AR-V7 ble målt som beskrevet i Materiale og metode delen. (C) LNCaP og LNCaP95-celler ble forbehandlet med 2 uM actinomycin D i 2 timer. Cellene ble deretter behandlet med bærer, 50 pM LY294002 eller 5 uM AZD5363 for 0, 2, 4, 6, 8 og 16 timer. AR-FL og AR-V7 mRNA uttrykk nivåer i forhold til 18rS ble bestemt ved real-time PCR. (D) LNCaP og LNCaP95-celler ble transfektert med kontroll eller sammenslått siRNA for AKT 1-3 isoformer i 36 timer. Celle ble forbehandlet med 2 uM Actinomycin D i 2 timer og deretter behandlet med bærer, 50 pM LY294002 eller 5 uM AZD5363 i 6 timer. AR-FL og AR-V7 mRNA uttrykk nivåer i forhold til 18rS ble bestemt ved real-time PCR. Resultatene var fra tre uavhengige RNA ekstraksjon med tredoble Real-Time PCR-analyser på hver RNA prøve. Enveis ANOVA etterfulgt av student t-test ble utført med * som P 0,05, ** som P 0,01 og *** som P . 0.001
For å måle
bona fide
effekter av LY294002 og AZD5363 på AR-FL og AR-V7 RNA-spleising, men utelukker deres virkninger på AR gentranskripsjon start, har vi designet tre sett med primere for å måle de relative spleise priser for AR-FL og AR-V7 . Siden AR-V7 RNA-spleising er en gjensidig utelukkende RNA-spleising fremgangs ekson 3b og exon 4 av AR pre-mRNA, ett sett av primere dekker exon 3 og 4 krysset av AR-genet for måling av AR-FL mRNA-nivåer, ett sett primere dekke ekson 3 og 3b for AR-V7 mRNA nivåer og det andre settet av primere er innenfor eksoner 2 og 3 for totalt AR mRNA nivåer. Vi viste at AR-FL RNA-spleising ikke ble påvirket av LY294002, AZD5363 eller AKT knockdown. Imidlertid LY294002 dramatisk hemmet, mens AZD5363 øket AR-V7 skjøting i LNCaP95 celler (Fig. 5B). Endringene av AR-V7 skjøting indusert av LY294002 eller AZD5363 ble ikke endret i nærvær av AKT knockdown.
AR-FL og AR-V7 mRNA stabilities ble også studert i LNCaP og LNCaP95 celler forbehandlet med actinomycin D (fig. 5C). LY294002 forbedret AR-FL og AR-V7 mRNA degradering i LNCaP95 celler innen 16 timer. AZD5363 forbedret AR-FL og eller AR-V7 mRNA degradering i både LNCaP og LNCaP95 celler. Men konsekvensene av LY294002 og AZD5363 på AR mRNA stabilities ble ikke påvirket av AKT knockdown (Fig. 5D). Siden den totale mRNA nivåer av AR-FL og AR-V7 i LNCaP og LNCaP95 celler ble økt med AZD5363 (Fig. 3), disse resultatene indikerte at virkningene av AZD5363 på AR gentranskripsjon initiering og RNA-spleising overweighed sine effekter til AR mRNA degradering.
LY294002 og AZD5363 påvirke AR-FL og AR-V7 transkripsjonen aktivitet
for ytterligere å undersøke om endringer av AR-FL og AR-V7 protein nivåer av LY294002 og AZD5363 ville påvirke AR transkripsjonen aktiviteter, målte vi uttrykk for to AR-FL regulerte gener (PSA og OPRK1) og en AR-V7 regulert gen (UGT2b17). I begge LNCaP og Vcap celler, AR-FL agonist R1881 stimulert PSA uttrykk, hvilke handlinger som ble undertrykt av LY294002 (Fig. 6A-B). I motsetning styrket AZD5363 den R1881 effekt i oppregulering PSA uttrykk i LNCaP celler, men redusert R1881 handlingen i Vcap celler. Disse endringene var konsistente til konsekvensene av LY294002 og AZD5363 på AR-FL proteinnivåer i disse cellene. Ekspresjonen av OPRK1 genet ble undertrykket ved ligand aktivert AR-FL [39]. Behandling av LY294002 redusert AR-FL mediert inhibering til OPRK1 ekspresjon i begge LNCaP-celler (69% undertrykkelse redusert til 35%) og VCap-celler (94% undertrykkelse redusert til 42%). AZD5363 styrket AR-FL for å undertrykke OPRK1 ekspresjon i LNCaP-celler (69% undertrykkelse økt til 79%), men redusert AR-FL mediert inhibering av OPRK1 ekspresjon i VCap-celler (94% undertrykkelse redusert til 86%). Men begge virkninger av LY294002 og AZD5363 på PSA og OPRK1 uttrykk ble ikke signifikant endret av AKT knockdown. For å studere den AR-V7 transkripsjonen aktivitet, målte vi uttrykket for UGT2b17 i VCap og LNCaP95 celler som ble behandlet med MDV3100 å blokkere AR-FL aktivitet. Begge Vcap og LNCaP95 celler uttrykker både AR-FL og AR-V7. Vi har tidligere vist at i nærvær av AR-FL funksjonell blokade ble oppregulering av ekspresjon av UGT2b17 bestemt ved AR-V7 [27]. LY294002 hemmet UGT2b17 uttrykk i både LNCaP95 og Vcap celler (Fig. 6C-D). AZD5363 stimulert UGT2b17 uttrykk i LNCaP celler, men redusert uttrykk i Vcap celler. Disse endringene i UGT2b17 genekspresjon var konsistente til AR-V7 proteinnivåer under LY294002 og AZD5363 behandlinger. Imidlertid ble disse konsekvensene ikke endret ved AKT knockdown.
(A) LNCaP og (B) Vcap celler ble transfektert med kontroll eller AKT1-3 sirnas i 48 timer og behandlet med kjøretøy eller en nM R1881. Celler ble også samtidig behandlet med bærer, 50 pM LY294002 eller 5 uM AZD5363 i 18 timer. Real-Time PCR-analyser målt PSA og OPRK1 mRNA nivåer. (C) LNCaP95 og (D) VCap-celler ble transfektert med kontroll eller AKT1-3 sirnas i 48 timer og behandlet med bærer, 50 pM LY294002 eller 5 uM AZD5363 i nærvær av 5 uM MDV3100 i 18 timer. Real-Time PCR-analyser målt UGT2b17 mRNA nivåer. Resultatene var fra tre uavhengige RNA ekstraksjon med tredoble Real-Time PCR-analyser på hver RNA prøve. Student t-tester ble utført sammenligning mellom kjøretøy og LY294002 /AZD5363 behandlinger med * som P 0,05; ** Som P 0,01 og *** som P . 0.001
Diskusjoner
Aberrant aktivering av PI3K /AKT sti gjennom enten genetisk eller epigenetiske mekanismer oppstår ofte i svulster, dette gjør dette reaksjonsvei til et attraktivt terapeutisk mål for et bredt spektrum av kreftsykdommer. Mange hemmere er tilgjengelige for å blokkere PI3K /AKT signalering og noen er under tidlige kliniske studier. Men heterogenitet av prostatakreft er en spesiell funksjon, som gjør det vanskelig å forutse om hemming av PI3K /AKT signale ville nytte PCA pasienter. I tillegg kan mange mulige biologiske følgetilstander av PI3K /AKT hemming ytterligere undergrave potensialet terapeutisk gevinst. Denne studien tar sikte på å undersøke om PI3K /AKT-inhibitorer har noen off-target-effekter til AR-genekspresjon i et panel av PCA-cellelinjer som representerer prostata tumorceller med et bredt spekter av genetiske variasjoner. Det er viktig å dokumentere ekspresjonsprofilen av AR-FL og AR spleisevarianter i henhold til behandlinger av PI3K /AKT-inhibitorer, ettersom vedvarende AR ekspresjon og funksjon er et av de kritiske molekylære mekanismer som prostatakreft videre til CRPC. Vi rapporterte at PI3K /AKT-hemmere hadde komplekse virkninger på AR genekspresjon som var uavhengig i AKT, noe som tyder på at disse PI3K /AKT-hemmere kan påvirke signale utover PI3K /AKT sti i PCA celler ventende på deres genetiske bakgrunn. Disse off-target effekter advares potensiell anvendelse av PI3K /AKT-hemmere til visse, om ikke alle, PCA pasientpopulasjoner.
Off-target effekter av PI3K /AKT-hemmere hadde vært godt dokumentert, og gjentatte ganger observert i denne studien. LY294002 og Wortmannin ble vist å binde mange andre kinaser som ikke var relatert til PI3K /AKT signale [23], [24]. Det er derfor ikke overraskende at LY294002 og Wortmannin hadde vist dominerende negative effekter på AR genuttrykk selv under AKT knockdown tilstand. Selv om både BKM120 og Akti dramatisk undertrykt AKT fosforylering og aktivering, gjorde de ikke viser noen konsekvenser for AR genekspresjon i alle fire PCA cellelinjer. Disse resultatene utelukket muligheten for at aktiveringen av AKT var direkte ansvarlig for forandringer av AR genekspresjon. De tjente som negative kontroller for å støtte de off-target effekter av LY294002, Wortmannin og AZD5363 på AR genekspresjon videre. Interessant, kan AZD5363 endre AR-FL og AR-V7 uttrykk i påvente av den genetiske bakgrunnen til PCA cellelinjer. Men flere bevis overalt angitte off-target effekter av AZD5363 til AR genuttrykk. Først, selv LNCaP og LNCaP95 celler uttrykker mutant PTEN og konstitutivt aktiv AKT, økt AZD5363 både AR-FL og AR-V7 uttrykk selv når endogene AKT ble betydelig utarmet av RNA Slå (Fig. 4). Disse resultatene indikerer at tilbakemeldingene aktivering av AKT av AZD5363 ikke bidro til endringer av AR uttrykk. For det andre, VCap og 22Rv1 celler uttrykker villtype PTEN med lav /ikke-detekterbare nivåer av p-AKT i fravær av aktivering av de oppstrøms tyrosinkinase-reseptorer (fig. 1-2). Virkningene av AZD5363 i å redusere AR-FL og AR-V7 i Vcap og 22Rv1 linjene ble dermed ikke relatert til AKT aktivering. Sist, kan AZD5363 forbedre AR gentranskripsjon start (Fig. 5A), RNA spleising av AR-V7 (Fig. 5B), AR-FL og AR-V7 mRNA degradering uavhengig til AKT knockdown (Fig. 5C-D).
Både AR og PI3K /AKT signalering hadde vist seg å være viktig for PCA-celler til å utvikle resistens terapi. Utvikling av inhibitorer mot disse signalisering gir nye muligheter for PCA pasienter. Motvekten av disse mulighetene er utfordringen med intrapatient PCa celle heterogenitet [40]. Flere kloner av kreftceller med ulik genetisk bakgrunn kan sameksistere i samme pasient [41]. Derfor er en PI3K /AKT-inhibitor kan være effektive til en populasjon av kreftceller, men muligens gi vekst privilegium til andre gjennom klonal seleksjon prosessen. Co-targeting AR og PI3K /AKT veier kan bli enda mer utfordrende. Gjensidig aktivering av AR og PI3K /AKT signalisering i prostata kreft kan komplisere utfallet av PCA pasienter som får kombinatoriske behandlinger av AR og PI3K /AKT hemming. Anti-androgener kan muligens svekke effektiviteten av PI3K /AKT-hemmere. Vice versa, kan PI3K /AKT-inhibitorer motvirke effektiviteten av anti-androgener. Nyere studier med PTEN knockout musemodeller videre viste at selv om kastrering sensitive svulster svarte på AR og PI3K /AKT signalering, de avledet kastrering resistente svulster gjennomgå fenotypisk plastisitet fører til økt intratumoral heterogenitet og tap av tumor uavhengighet til PI3K signale [42]. Våre tidligere studier hadde vist at kastrering forhold indusere AR gentranskripsjon og RNA spleising av AR-V7 [27]. Vi viste videre her at hemmere som AZD5363 kan øke AR gentranskripsjon initiering og AR-V7 RNA-spleising. Samtidig behandling av anti-androgen og AZD5363 vil muligens resultere i forbedret AR-V7 uttrykk og fremme AR-V7 drevet svulster i en undergruppe av PCA pasienter.
I sammendraget, våre studier viste PI3K /AKT-hemmere har ulike off-target effekter på AR genekspresjon i PCA celler med ulike genetiske bakgrunn. Denne informasjonen bør vurderes ved behandling av PCA pasienter med disse hemmere.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Informasjon av antistoffer og primere brukt i denne studien
doi:. 10,1371 /journal.pone.0108780.s001 plakater (docx)
