Abstract
Økologisk kasjon /karnitin Transporter 2 (OCTN2) er ansvarlig for cellulært opptak av det antineoplastiske middel, oksaliplatin. Epigenetisk modifikasjon er en mulig mekanisme av endret legemiddel transportøren ekspresjon i kreftformer, noe som fører til endret effekt av kjemoterapeutiske medikamenter. Imidlertid er de mekanismene som styrer OCTN2 regulering ikke helt forstått. I denne studien ble det lave nivåer av OCTN2 i HepG2 og LS174T celler forhøyet ved demethylating reagent, decitabine (DCA). For ytterligere å avsløre epigenetisk mekanisme nedregulering av OCTN2, fant vi at Region-en i
OCTN2
promoter (spenner -354 til 85) var med på å bestemme OCTN2 uttrykk i en luciferase reporter analysen. Videre metylering-spesifikk PCR (MSP) og bisulfitt genomisk sekvensering viste at graden av de enkelte metylerte CpG-områder innenfor dette område ble inverst korrelert med nivåene av OCTN2 i forskjellige kreftceller. Bruk av DCA til HepG2 og LS174T celler snudd hypermethylation status for
OCTN2
arrangøren og økt OCTN2 uttrykk, styrke cellulært opptak av oksaliplatin. Således identifiserte vi at promoteren metylering er ansvarlig for epigenetisk nedregulering av OCTN2 i HepG2 og LS174T celler. Gitt den avgjørende rollen OCTN2 i kreftcellen opptak av kjemoterapeutika, og dermed behandlingseffekt, forbehandling med en demethylating reagens er en mulig strategi for å optimalisere farmakoterapi mot kreft
Citation. Qu Q, Qu J, Zhan M, Wu LX, Zhang YW, Lou XY, et al. (2013) Ulike Involvering av arrangøren Metylering i Expression of Organic Kasjon /carnitine Transporter 2 (OCTN2) i Cancer Cell Lines. PLoS ONE 8 (10): e76474. doi: 10,1371 /journal.pone.0076474
Redaktør: Suresh Yenugu, University of Hyderabad, India
mottatt: 16 juli 2013; Godkjent: 29 august 2013; Publisert: 16 oktober 2013
Copyright: © 2013 Qu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Statens Scholarship Fund fra Kina Scholarship Council (Fil nr 201 206 370 103), National Scientific Foundation of China (No. 81273595, 81072706), den vitenskapelige grunnlag Hunan (No. 11K073, 10JJ4020), «863» Project (No. 2012AA02A518), NCET-10-0843 og forsknings Innovation Foundation of Graduate Student i Hunan-provinsen, PRC (CX2011B056). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
den menneskelige
SLC22A5
genet, som koder for et 63 kDa organisk kation /karnitin transporter 2 (OCTN2), ligger i cytokin klyngen regionen på kromosom 5q31 [1], [2]. OCTN2 uttrykkes i forskjellige vev, inkludert nyre, skjelettmuskel, hjerte, tykktarm, hjerne, lever, osv [3]. Funksjonelle defekter av OCTN2 er assosiert med forskjellige sykdommer, inkludert primære carnitin-mangel, Crohns sykdom, astma og [4] – [8]. OCTN2 ikke bare transporterer karnitin, men også anerkjenner klinisk viktige behandlingsformer som mildronate, verapamil, pyrilamin, oksaliplatin, imatinib og cephaloridine [9] – [13]. OCTN2 er forbundet med oksaliplatin akkumulering og cytotoksisitet i OCTN2-HEK293 transfekterte celler [11]. De to alleler av
OCTN2
(rs2631367 og rs2631372) kan være viktige prediktorer i gastrointestinal stromal tumor pasienter som fikk imatinib terapi [12]. Disse rapportene tyder på at de funksjonelle defekter og /eller avvikende uttrykk for OCTN2 kan påvirke gemytt og påfølgende terapeutisk effekt av sine underlag.
Flere rapporter tyder på involvering av peroksisomproliferatoraktiverende aktivert reseptor alfa (PPARA) og gamma ( PPARG) i den transkripsjonelle regulering av OCTN2 i forskjellige vev. Imidlertid, nedregulering av OCTN2 har blitt rapportert i tumorer med høy ekspresjon av PPARA og PPARG [14] – [16]. En fersk studie fant at redusert nivå av OCTN2 i flere epiteliale kreftcellelinjer kan gjenopprettes ved demethylating reagens 5-aza-cytidine [17]. Disse funnene antyder at andre machineries samvirke med transkripsjonsfaktor nettverk til å modulere ekspresjon av OCTN2, slik som DNA-metylering.
DNA metylering er en viktig epigenetisk mekanisme som modulerer genekspresjon. CPG dinucleotide nær transkripsjonsstartsider er rikelig i genet arrangører, og er referert til som CpG øyer. Den metylering av CpG-øyer er forbundet med undertrykt gentranskripsjon og unormal DNA-metylering kan føre til avvikende genekspresjon. I motsetning til genmutasjon, kan DNA-metylering blir reversibelt endret av demethylating midler slik som decitabine (5-aza-2′-deoksycytidin, DCA) og 5-aza-citidine. Disse midler er innlemmet i DNA og inaktivere DNA-cytosin C5-metyltransferaser [18]. Dermed har vi en hypotese om at differensial metylering status for
OCTN2
kan være korrelert med avvikende uttrykk for OCTN2 i kreftceller.
I denne studien har vi undersøkt om metylering av CpG øyer fungerer som en mulig mekanisme som er ansvarlig for nedregulering av OCTN2 i kreftcellelinjer. Ved å bruke metylering spesifikke PCR (MSP), bisulfitt genomisk sekvensering, og
in vitro
metylering analyser, har vi gitt bevis for at arrangøren DNA metylering er en viktig mekanisme undertrykke OCTN2 uttrykk i kreftcellelinjer. Bruk av en demethylating reagens, som moduleres metylering status for
OCTN2
promoter, økt uttrykk for OCTN2 og gjort kreftceller mer følsomme for oksaliplatin.
Materialer og metoder
Kjemikalier og reagenser
Decitabine, natriumbisulfat, hydrokinon og oksaliplatin ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). TRIzol reagent og Lipofectamine 2000 ble oppnådd fra Invitrogen (Carlsbad, California).
Cell Kultur og Behandling med DCA
hepatoma cellelinje HepG2, tykktarmskreft cellelinje LS174T, gliom cellelinje U251, gallegang kreftcellelinje QBC-939 og afrikansk grønn ape nyrecellelinje COS-7 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Cellelinjer ble dyrket i DMEM supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i en fuktet inkubator inneholdende 5% CO
2, med unntak av QBC-939-cellelinjen, som ble dyrket i RPMI 1640. Cellene ble behandlet med DCA ved en sluttkonsentrasjon på 0,5 uM eller 1 uM og fornyes hver 24. time i en uke.
RNA-rensing, cDNA-syntese og kvantitativ real-time PCR
Total cellulær RNA ble isolert fra de behandlede celler ved hjelp av TRIzol reagens. cDNA ble syntetisert fra 1 pg av total RNA ved hjelp av den første cDNA-syntesesett (Takara, Dalian). Kvantitativ RT-PCR ble utført ved hjelp SYBR Grønn (Bio-Rad) og primere er oppført i tabell S1. RT-PCR ble utført i løpet av 40 sykluser ved 95 ° C i 30 s, ved 60 ° C i 30 s, og 72 ° C i 30 s etterfulgt av en endelig forlengelse ved 72 ° C i 2 min. Den relative mRNA uttrykk var normalisert til husholdningsgenet
β-aktin Hotell og analysen ble utført ved hjelp av to
-ΔΔCt metoden [19].
Western Blotting
Totalt cellulære proteiner ble hentet ut og konsentrasjonene ble kvantifisert ved BCA proteinanalyse (Thermo Scientific, Rockford, IL). Proteiner ble underkastet SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese på 10% polyakrylamidgeler og overført til PVDF-membran. Membranen ble probet med enten et anti-kanin-antistoff OCTN2 (1:400, Abcam Labs, Cambridge, MA) eller β-aktin-antistoff (1:1000, Abcam Labs). Deretter ble membranene inkubert med DyLight 800-merket kanin polyklonale antistoff (1:7500, KPL Inc, Gaithersburg, MD), beskyttet mot lys. De fargede Membranene ble skannet av Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR biovitenskap). Forholdet mellom OCTN2 mot β-aktin ble beregnet.
celleviabilitet Assay
kreftcellelinjer ble behandlet med 1 pM DCA eller 0,1% DMSO i en uke. Deretter ble cellene sådd ut i 96-brønners plater i en tetthet på 2 x 10
4 /brønn, og utsatt for oksaliplatin i forskjellige konsentrasjoner (0, 0,3, 1, 3, 10, 33, 100 eller 330 uM) for 48 timer. Cellelevedyktigheten ble målt ved hjelp av MTS-analysen (Promega, Madison, WI) og IC
50-verdier ble beregnet ved hjelp av SPSS 13,0 versjon.
Metylering-spesifikke PCR (MSP) og Bisulfite-sekvense PCR (BSP)
for å forutsi områder med stor CpG dinukleotider nær
OCTN2
transkripsjonen starter stedet brukte vi metyl-Primer programvare (https://www.urogene.org/methprimer/) i henhold til følgende kriterier: lengden av CpG island 100 bp, observert /forventet CpG ratio 0,6 og prosentandel av G pluss C 50%. Vi søkte på
OCTN2
genomisk sekvens inkludert 1,5 kb oppstrøms og 2 kb nedstrøms transkripsjonen start hotellet (TSS). Ifølge den anslåtte CpG øyer, ble MSP og BSP primere designet og er oppført i tabell S1. Genomisk DNA fra kreftcellelinjer ble isolert og DNA-bisulfitt modifikasjon ble utført som beskrevet [20]. Bisulfitt modifiserte DNA ble gjenvunnet ved Wizard DNA Clean Up System (Promega) og behandlet med 5,5 mL av NaOH og deretter utfelt med etanol. Utfelt DNA ble resuspendert i vann, og så forsterket med MSP eller BSP primere. PCR tilstand var som følger: 94 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 40 sykluser ved 94 ° C i 30 sekunder, annealing temperatur (tabell S1) i 30 s, 72 ° C i 60 s, og til slutt 72 ° C i fem min. De amplifiserte DNA-fragmenter ble kjørt på 2% agarosegeler og farget med etidiumbromid. BSP produkter ble renset ved hjelp av en DNA-rensesett (Takara, Dalian) og settes inn i pGEM-T enkel vektor (Promega). Fem kloner for hver cellelinje ble tilfeldig valgt ut og sekvensert. Den metylert sekvens av
OCTN2
ble sjekket for justering ved hjelp MethBLAST.
Plasmid Bygg og
in vitro
Metylering analysen
Ifølge den anslåtte CpG øyer i genomisk sekvens, fordelt vi arrangøren i tre regioner. Tre regioner inneholdende forskjellige CpG-øyer ble amplifisert (primere er oppført i Tabell S2) og innsatt i pGL4.17 vektor (Promega). Disse rekombinanter, pGL4.17-REGION1, REGION2 og Region3 ble verifisert av automatisert sekvensering. De respektive Plasmidet ble linearisert ved
Xho
I og underkastet
in vitro
metylering analyse som beskrevet i vårt tidligere arbeid [21]. Metyleringen produktene ble deretter spaltet ved
Kpn
I og innsatt i pGL4.17 vektoren. Disse nye rekombinante inneholder denaturert promotorområdene ble kåret pGL4.17-mRegion 1, pGL4.17-mRegion 2 og pGL4.17-mRegion 3, henholdsvis.
Transient Transfeksjon og Luciferase Rapporter analysen
COS-7-celler ble sådd i 24-brønns plater ved en tetthet på 10
5 /brønn i 500 ul DMEM og 10% FBS. Etter 8 timer ble cellene transfektert med vektorer konstruert luciferase (0,2 ug /brønn) ved anvendelse av Lipofectamine 2000. pGL4.17 vektoren som mangler en promoter tjente som den negative kontroll. Internkontrollen vektor PRL-TK (0,02 ug /brønn) ble brukt til å normalisere luciferase-aktivitet. Etter 8 timer ble hver brønn av transfekterte cellene vasket to ganger og deretter 100 ul av reporter lyseringsbuffer ble tilsatt for å lysere cellene. Hver gruppe hadde triplikatbrønner og er gjentatt mer enn tre ganger. Dual luciferase-aktivitet (relative lysenheter, RLU) ble bestemt ved en luminometer.
Statistical Analysis
Alle data ble uttrykt som middelverdi ± standardavvik. Statistiske analyser ble utført med en enveis ANOVA for betydningen etterfulgt av en post-hoc test i SPSS 13.0 programvare. Data sammenligninger med en
p
verdi på mindre enn 0,05 (
p
0,05). Ble ansett som vesentlig forskjellig
Resultater
OCTN2 mRNA og protein nivåer i ulike kreftcellelinjer
Totalt cellulært RNA og protein ble hentet fra kreftcellelinjer og OCTN2 uttrykk ble målt ved kvantitativ RT-PCR og Western blotting, henholdsvis. Den høyeste ekspresjon av OCTN2 var i QBC-939, etterfulgt av U251, LS174T og HepG2-celler (Fig. 1). Uttrykk for OCTN2 i QBC-939 og U251 celler var betydelig høyere enn i U251, LS174T celler (
p
0,05).
(A), analyse av mRNA nivåer av OCTN2 i cancercellelinjer. Total RNA i kreftceller ble renset ved hjelp av TRIzol reagens for cDNA syntese og mRNA-nivåene av OCTN2 ble analysert ved kvantitativ RT-PCR. (B), analyse av proteinnivåer av OCTN2 i kreftceller. Totale proteiner ble ekstrahert og proteinnivåer av OCTN2 ble analysert ved western blotting. Den relative ekspresjon av mRNA og protein ble normalisert til p-aktin. Ekspresjon av HepG2 ble satt til 1. Alle av mRNA og protein-analyse ble utført tre ganger. Signifikant forskjell fra HepG2 eller LS174T cellen er markert med stjerne (*,
p
0,05) eller nummertegn (#
p
0,05), henholdsvis
Effekter av DCA på uttrykk for OCTN2 i kreft~~POS=TRUNC celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
for å undersøke om de avvikende uttrykk for OCTN2 i ulike kreftcellelinjer skyldtes arrangøren metylering, behandlet vi kreftcellelinjer med DCA og bestemmes den restaurerte uttrykk for OCTN2. På fig. 2, DCA bemerkelsesverdig oppregulert den relative OCTN2 mRNA og protein uttrykk i HepG2 celler med 0,5 mikrometer (1,38 ganger 1,61 ganger) og en mikrometer behandling (1,52 ganger, 2.07-fold) (
p
0,05), sammenlignet med kontrollgruppen. Tilsvarende behandling av DCA føre til en økning av OCTN2 nivåer i LS174T celler. Men DCA ikke endre uttrykket av OCTN2 i QBC-939 og U251 celler, som allerede hadde høy OCTN2 uttrykket nivåer.
(A), analyse av mRNA nivåer av OCTN2 i DCA-behandlede kreftcellelinjer. Etter behandling med 0,5 og 1 uM DCA, ble total RNA i kreftceller renset ved hjelp av TRIzol reagens for cDNA syntese og mRNA-nivåene av OCTN2 ble analysert ved kvantitativ RT-PCR. (B), analyse av proteinnivåer av OCTN2 i DCA-behandlede kreftcellelinjer. Totale proteiner ble ekstrahert og proteinnivåer av OCTN2 ble analysert ved western blotting. Den relative ekspresjon av mRNA og protein ble normalisert til p-aktin. Dataene som presenteres representerer gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter. Signifikant forskjell fra kontrollgruppen på 0,1% DMSO er angitt med stjerne (*,
p
0,05, **,
p
0,01).
OCTN2 genomisk Sequence Havner Tre CpG Islands
Vi søkte på
OCTN2
genomisk sekvens for plasseringen av CpG dinukleotider hjelp metyl-primer programvare. CpG-dinukleotider ble funnet utstrakt plassert i nærheten av TSS (fig. 3A). Ifølge plasseringen intensiteten av CpG dinukleotider, observerte vi tre antatte CpG øyer som ligger i
OCTN2
genomisk sekvens. CpG øy-2 ligger i nærheten av UTR og ekson 1 er CpG øy-3 plassert i intron 1, og CpG øy-1 er plassert oppstrøms for TSS (fig. 3A).
(A), beregningsorientert analyse avdekket tre mulige CpG øyer innenfor OCTN2 genomisk sekvens av metyl-primer programvaren som beskrevet i
Materiale og metode
. (B), MSP analyse for CpG øyene OCTN2 i 1 mikrometer DCA behandlet og ikke-behandlede kreftcellelinjer. MSP ble utført med spesifikke primere for å forsterke målet CpG øyer fraksjoner og kjøre på en 2% agarosegel. Alle av MSP og BSP-analyse ble gjentatt tre ganger. U: unmethylated sekvens; M:. Metylert sekvens
Metylering Status for CpG øyer innen OCTN2 av MSP
For ytterligere å belyse metylering status av CpG øyer innenfor
OCTN2
i forskjellige kreftcelle linjer, analyserte vi tre CpG øyer av MSP som skiller denaturert DNA fra un-denaturert DNA. På fig. 3B, CpG island-en (CpG1) var helt metylert i HepG2 celler, delvis metylert i LS174T og U251 celler, og un-metylert i QBC-939 celler. Delvis metylerte produkter av CpG øy-2 (CpG2) ble funnet i LS174T og QBC-939-celler, men disse var un-metylert i HepG2 og U251-celler. I nesten alle cellelinjer, CpG island-tre hadde mer denaturert produkter enn unmethylated. På fig. 3C, etter behandling med DCA, un-metylert produkter av CpG1 ble økt i HepG2, LS174T og U251 celler. Dette funnet viser at DCA kan føre til de-metylering innen CpG1. Et lignende resultat ble observert innen CpG2. DCA behandling økt un-denaturert produkter av CpG3 i HepG2 celler, men ikke føre til vesentlige endringer i andre celler.
Effekt av metylert og Un-metylert Arrangøren Regions på transkripsjon aktivitet av OCTN2 å bruke en
in vitro
luciferaserapportørplasmid analysen
for å finne ut hvilke metylert CpG øyer spille viktige roller i nedregulering av OCTN2, bygget vi luciferaserapportørplasmid plasmider som bærer enten un-denaturert eller denaturert regioner (fig. 4). Konstruerte plasmider ble transfektert inn i COS-7-celler og brukes for å vurdere transkripsjonen aktivitet. I sammenligning med pGL4.17 (Control), vises pGL4.17-REGION1 markant økt luciferase aktiviteten til 102,5 ganger (
p
0,01), mens luciferase aktivitet fra pGL4.17-REGION2 og Region3 bare var økt 11,4 ganger og 3,5 ganger (
p
0,05). Dette resultatet indikerer at REGION1 spenner -354 til 85 bp spiller en avgjørende rolle i promoter aktivitet. Interessant, bare luciferase aktiviteten til un-metylert Region-en var høyere enn sin metylert vektor (29,7 ganger,
p
0,01). Un-metylert Regions-2 og -3 viste ikke signifikante forskjeller i luciferase aktivitet i forhold til deres tilsvarende denaturert regioner. Det er mulig at metylering statusene Region-2 og -3 inneholder CpG island-2 og -3, henholdsvis, er irrelevant å
OCTN2
uttrykk. Dermed disse funn viser at økt metylering kan hemme aktiviteten av promoter-regionen-1.
Konstruert pGL4.17 luciferase-vektor inneholdende unmethylated og metylerte promoter-regioner ble transfektert inn i COS-7-celler med den PRL-TK kontroll vektor. Førti-åtte timer senere ble cellene vasket og analysert for luciferase-aktivitet. Relativ luciferaseaktivitet ble målt i triplikate brønner. Dataene som presenteres representerer gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter. Signifikant forskjell fra kontrollgruppen av pGL4.17 betegnes med stjerner (*,
p
0,05, **,
p
0,01). Signifikant forskjell fra gruppen av metylert region i samme region vises med en firkanttegn (#
p
0,05).
Fastsettelse av DNA metylering Profiler av OCTN2 av BSP
for å vurdere metylering profilen til CpG steder i Region-en, bisulfitt genomisk sekvensering i ulike kreftcellelinjer ble utført. På fig. 5A, den genomiske sekvens av OCTN2 promoter ble vist og CpG steder ble merket. En metylert sekvens av
OCTN2
spenner -325 til -92 bp i HepG2 celler ble sjekket for justering ved hjelp MethBLAST og er presentert i Fig. 5B. Andre denaturert sekvenser fra LS174T er QBC-939 og U251-celler presentert i fig S1, S2 og S3. På fig. 5C, metylering profiler viste at satsene denaturert CpG nettsteder (mCpG /totalt CpG antall) var 72,2% og 60,0% i HepG2 og LS174T celler, henholdsvis, som er mye høyere enn metylering priser målt i QBC-939 (20,0%) og U251 (11,1%) celler. Dessuten, etter 1 mikrometer DCA behandling i HepG2, satsene denaturert CpG nettsider redusert til 13,3% (Fig. 6). Siden hypermethylated CpG områder innen OCTN2 blir reddet av DCA behandling i HepG2 og LS174T celler, disse funnene gir direkte bevis for at enkelte denaturert CpG steder i arrangøren kan nettopp regulere uttrykk for OCTN2.
(A), genomisk sekvens spenner -325 til -92 bp i promoter Region-1 av
OCTN2
. Atten CpG steder ble plassert og merket. (B), sulfitt genomisk sekvense analyse av Region-1 av
OCTN2
i HepG2 celler. Bisulfite modifiserte DNA ble forsterket av BSP som beskrevet under
Materiale og metode
og deretter sekvensert. Spiss stjerne representerer denaturert CpG nettsteder. (C), DNA-metylering profiler av de enkelte metylerte CpG-dinukleotider i fire kreftcellelinjer. Etter BSP ble fem kloner tilfeldig valgt og sekvensert. De denaturert sekvensene ble sjekket for justering ved hjelp MethBLAST. Den åpne og lukkede sirkler representerer unmethylated eller denaturert cytosines hhv.
(A), sulfitt genomisk sekvense analyse av DCA-behandlede HepG2 celler. Etter behandling av DCA, ble DNA ekstrahert og underkastet bisulfitt modifikasjon. Bisulfite modifiserte DNA ble forsterket av BSP som beskrevet under
Materiale og metode
og deretter sekvensert. Spiss stjerne representerer denaturert CpG nettsteder. (B), DNA metylering profiler av individuelle denaturert CpG dinukleotider i DCA-behandlede HepG2 celler. Etter BSP ble fem kloner tilfeldig valgt og sekvensert. De denaturert sekvensene ble sjekket for justering ved hjelp MethBLAST. Den åpne og lukkede sirkler representerer unmethylated eller denaturert cytosines hhv.
Effekter av DCA på Styrking Sensitivitet av kreftceller til oksaliplatin
For ytterligere å forstå hvis metylering status for
OCTN2
gen påvirker følsomheten av kreftceller til oksaliplatin, kreftceller ble forbehandlet med DCA etterfulgt av eksponering for oksaliplatin. Cellelevedyktigheten ble vurdert og IC
50-verdier ble beregnet. I figur 7., når cellene ble utsatt for oksaliplatin på 3, 10, 33 og 100 mikrometer, ble celleviabilitet av DCA-behandlet HepG2 og LS174T redusert sammenlignet med DMSO-behandlede celler (
p
0,05 ), men endret ikke på U251 og QBC-939 celler. På fig. 7B, IC
50-verdier for DCA-behandlede HepG2 og LS174T celler ble redusert til 51,6% og 44,8% (
p
0,05), respektivt, sammenlignet med DMSO-behandlede celler, men var uendret i QBC-939 og U251 celler. Derfor er det mulig at DCA sensitizes HepG2 og LS174T celler til oksaliplatin gjennom å øke OCTN2 uttrykk og styrke opptaket av oksaliplatin.
Kreftceller ble forbehandlet med en mikrometer DCA for en uke, sådd i 96-brønn platene på 1 x 10
4 celler /brønn i 100 ul DMEM og 10% FBS. Etter 8 timer ble cellene eksponert for oksaliplatin i forskjellige konsentrasjoner (0,1, 0,3, 1,0, 3,3, 10, 33, 100 eller 330 uM) i 48 timer i ferskt kulturmedium. Celleviabilitet ble bestemt av en MTS celle voksende testsett. Hver konsentrasjon ble bestemt i tre brønner. Dataene som presenteres representerer gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter. (A), ble cellelevedyktigheten ved hver konsentrasjon vist. Vesentlige forskjeller fra DMSO behandling er merket med en stjerne (*,
p
0,05). (B), ble IC
50-verdier beregnes ved SPSS 13.0 programvare. Dataene som presenteres representerer gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter. Vesentlige forskjeller fra ikke-behandlede celler er merket med en stjerne (*,
p
0,05).
Diskusjoner
I denne studien fant vi at hypermethylation i
OCTN2
arrangøren er ansvarlig for nedregulering av
OCTN2
i HepG2 og LS174T celler. Vi har oppdaget at nettopp graden av metylering av individuelle metylerte CpG områder i promoterregionen av MSP og BSP, som er inverst korrelert med ekspresjonen av OCTN2 i forskjellige kreftceller. Videre DCA forbehandling av HepG2 og LS174T celler økt oksaliplatin-indusert celledød via OCTN2 demetylering.
Den viktige rollen av DNA metylering har tiltrukket seg mye interesse som en mulig mekanisme som ligger til grunn avvikende uttrykk for onkogener, tumor suppressor gener og DNA-reparasjonsgener i carcinoma celler. Nyere funn viser en rolle for DNA metylering i å regulere uttrykket av transportører som SLC22A1, A2, A3 (Oct1, OCT2, OCT3), SLC22A18, SLC5A8, NTCP, Oatp1b2, BSEP, ABCG2, ABCG5 /G8 [22] – [ ,,,0],27]. For å forstå mekanismen ved hvilken OCTN2 ekspresjon er undertrykt i HepG2 og LS174T celler, behandlet vi disse cellelinjer med demethylating reagens DCA og det observert en økning i OCTN2 mRNA og proteinnivåene i HepG2 og LS174T celler, mens ingen forandring skjedde i QBC-939 og U251 celler. En fersk studie fant også at lave nivåer av OCTN2 ble økt med DCA i menneskelig papillomavirus16 E6- og E7- uttrykker keratinocytter [17]. DCA hemmer DNA-metyltransferase-enzymer (DNMTs) og ytterligere ødelegger integriteten av metylering avtrykk, og dermed føre til avbrudd av epigenetiske signaturer og regulering av genekspresjon [28]. Dermed disse funnene tyder på at nedregulering av OCTN2 i HepG2 og LS174T celler kan skyldes avvik arrangøren metylering.
Analysere de tre antatte CpG øyer i
OCTN2
, vi observert at CpG øyer vises ulike metylering statuser i ulike kreftceller, og at hypermethylation kunne bli redusert med DCA. Derfor søkte vi å identifisere hvilke CpG island spiller en sentral rolle i reguleringen av OCTN2 uttrykk. I luciferase reporter analysen, bare arrangøren Region-en spenner -354 til 85 bp viste økt promoter aktivitet. Videre metylering av Region-en som etterligner metylering mønstre i cellene, fullstendig hemmet arrangøren aktivitet. Dette resultatet gir bevis for at Region-1 er en mulig faktor for OCTN2 uttrykk, fordi hypermethylation av Region-1 hemmet transkripsjonen aktivitet av OCTN2 i LS174T og HepG2 celler.
Bisulfite genomisk sekvense nettopp oppdaget de enkelte denaturert CpG sider innenfor promoter-regionen-1, som var signifikant hypermethylated i HepG2 og LS174T forhold til QBC-939 og U251-celler. Graden av DNA-metylering er omvendt korrelert med ekspresjonen av OCTN2 i disse kreftceller. Disse funnene kan med rimelighet forklare de lavere nivåene av OCTN2 i HepG2 og LS174T celler, i forhold til uttrykk i QBC-939 og U251 celler. Videre DCA reversert metylering av CpG steder i Region-en i HepG2 celler i samsvar med økningen i OCTN2 uttrykk.
denaturert CpG dinukleotider innenfor promoter Region-en hemme uttrykket av
OCTN2
sannsynligvis gjennom to mekanismer. For det første kan mange transkripsjonsfaktorer bindinger bli blokkert av denaturert CpG dinukleotider innenfor
OCTN2
promoter. Vi analyserte promoter Region-1 av
OCTN2
av TFSEARCH programvare (https://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html), og fant ut at den konsensus bindingsseter for transkripsjonsfaktoren spesifisitet protein 1 (SP1) og myeloid sink finger 1 (MZF-1) overlappet noen viktige CpG områder (fig S4). Videre arbeid er i gang for å undersøke om metylering av spesifikke CpG steder blokkerer disse transkripsjonsfaktorene. En annen mulig mekanisme er den avvikende regulering av DNA-metyltransferase enzymer og metylering avhengig rekruttering av nukleoprotein faktorer som for eksempel metyl-CpG bindende protein MeCP1 og MeCP2 [29] – [31]. Vi vil undersøke hvordan hypermethylated CpG nettstedene til OCTN2 rekruttere disse metylering relaterte proteiner og undertrykke uttrykk for OCTN2.
Gitt avgjørende rolle OCTN2 i kreftcelleopptak og dermed behandlingseffekten av oksaliplatin, metylering av
OCTN2
kan brukes som et mål for å forbedre terapeutisk effektivitet. Etter behandling med 1 mikrometer DCA, HepG2 og LS174T celler ble mer følsomme for oksaliplatin, men ikke QBC-939 og U251 celler. Videre, i DCA behandlede celler, den økte ekspresjon av OCTN2 tillagt større oksaliplatin opptak og mer cytotoksisitet enn ikke-DCA behandlede celler. Selv om DCA i høye konsentrasjoner forårsaker global genomiske ustabilitet og cytotoksisitet, DCA i lave konsentrasjoner virker hovedsakelig til å hemme DNMT i stedet for å indusere celledød [32]. Dermed DCA ble administrert samtidig med oksaliplatin, og den resulterende restaurering av OCTN2 uttrykk forbedret opptak og effekt av oksaliplatin.
Konklusjon
I konklusjonen, avslørte vi at epigenetisk mekanisme av nedregulering av
OCTN2
i ulike kreftceller. Arrangøren regionen spenner -354 til 85 var med på å bestemme OCTN2 uttrykk. Graden av denaturert CpG områder innenfor regionen ble omvendt korrelert med nivåene av OCTN2 i kreftceller. Bruk av demethylating agent, DCA, reverserte hypermethylation status for
OCTN2
arrangøren og økt OCTN2 uttrykk, og dermed føre til økt opptak av oksaliplatin fremkallende kreftceller til å være mer følsomme for oksaliplatin. Gitt den avgjørende rollen OCTN2 i kreftcelleopptak og dermed behandlingseffekten av flere kjemoterapeutika, forbehandling av en demethylating reagens er en mulig strategi for optimalisering av farmakoterapi mot kreft.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Metylering profiler rundt transkripsjons start stedet for
OCTN2
i LS174T celler. DNA ble ekstrahert og underkastet bisulfitt modifikasjon. Bisulfite modifiserte DNA ble forsterket av BSP og sekvensert som beskrevet under
Materiale og metode
. Spiss stjerne representerer denaturert CpG nettsider
doi:. 10,1371 /journal.pone.0076474.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Metylering profiler rundt transkripsjons start stedet for
OCTN2
i QBC-939 celler. DNA ble ekstrahert og underkastet bisulfitt modifikasjon. Bisulfite modifiserte DNA ble forsterket av BSP og sekvensert som beskrevet under
Materiale og metode
. Spiss stjerne representerer denaturert CpG nettsider
doi:. 10,1371 /journal.pone.0076474.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
Metylering profiler rundt transkripsjons start stedet for
OCTN2
i U251 celler. DNA ble ekstrahert og underkastet bisulfitt modifikasjon. Bisulfite modifiserte DNA ble forsterket av BSP og sekvensert som beskrevet under
Materiale og metode
. Spiss stjerne representerer denaturert CpG nettsider
doi:. 10,1371 /journal.pone.0076474.s003 plakater (TIF)
Figur S4.
transkripsjon faktor bindingssete analyse av promoter-regionen i
OCTN2
av TFsearch programvare. For å avdekke mekanismen der denaturert CpG nettsider hemme
OCTN2
transkripsjon, kartla vi de antatte konsensussekvenser for transkripsjonsfaktorer. CpG områder er på den røde linjer. Antatte konsensus sekvenser er angitt med stiplede linjer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0076474.s004 plakater (TIF)
Tabell S1.
Primere for Kvantitativ RT-PCR, MSP og BSP
doi:. 10,1371 /journal.pone.0076474.s005 product: (PDF)
Tabell S2.
Primere for bygging av luciferaserapportørplasmid vektorer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0076474.s006 product: (PDF)
Takk
Vi er takknemlige for Dr . Jie Liu og Dr. Helen Renaud, som ga språk hjelp.
