Abstract
galleveier kreft (BTC) er ofte vanskelig å diagnostisere definitivt , selv gjennom histologisk undersøkelse. MicroRNAs (mirnas) regulere en rekke fysiologiske prosesser. I de senere år er det blitt foreslått at profiler for sirkulerende mirnas, så vel som de for vev mirnas, har potensiale til å bli brukt som diagnostiske markører for cancer. Målet med denne studien var å bekrefte eksistensen av miRNAs i human galle og for å vurdere deres potensial som kliniske biomarkører for BTC. Vi samplet galle fra pasienter som gjennomgikk galle drenering for gallesykdommer som BTC og choledocholithiasis. PCR-basert miRNA deteksjon og miRNA kloning ble utført for å identifisere galle miRNAs. Ved hjelp av høy gjennomstrømming real-time PCR-basert miRNA mikromatriser, ble uttrykket profiler av 667 mirnas sammenlignet hos pasienter med ondartet sykdom (
n
= 9) og alderstilpassede pasienter med benign sykdom choledocholithiasis (
n
= 9). Vi preget senere galle mirnas i form av stabilitet og lokalisering. Gjennom kloning og bruke PCR-metoder, fikk vi bekreftet at mirnas finnes i galle. Differensial analyse av galle mirnas viste at 10 av de 667 miRNAs ble betydelig mer høyt uttrykt i ondartet gruppen enn i benign gruppen på
P
0,0005. Stille spesifisitet terskelen til 100% viste at noen mirnas (
MIR-9
,
MIR-302c *
,
MIR-199A-3p Hotell og
speil 222 *
) hadde en følsomhet nivå på 88,9%, og mottaker-drift karakteristiske analyse viste at
MIR-9 Hotell og
MIR-145 *
kan være nyttige diagnostiske markører for BTC. Videre bekreftet vi den langsiktige stabiliteten i miRNAs i galle, en egenskap som gjør dem egnet for diagnostisk bruk i kliniske settinger. Vi bekreftet også at galle mirnas er lokalisert til ondartet /godartet galle epitel. Disse funnene tyder på at galle mirnas kan være informative biomarkører for hepatobiliære sykdom og at noen mirnas, spesielt
MIR
-9, kan være nyttig i diagnostisering og klinisk behandling av BTC
Citation. Shigehara K, Yokomuro S, Ishibashi O, Mizuguchi Y, Arima Y, Kawahigashi Y, et al. (2011) Real-Time PCR-basert analyse av Human Bile MicroRNAome Identifiserer
MIR-9
som en diagnostisk biomarkør for galleveier kreft. PLoS ONE 6 (8): e23584. doi: 10,1371 /journal.pone.0023584
Redaktør: Carlo Gaetano, Istituto Dermopatico dell’Immacolata, Italia
mottatt: 28 desember 2010; Godkjent: 21 juli 2011; Publisert: 17 august 2011
Copyright: © 2011 Shigehara et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Grants-in-Aid og «Forskning Kjerne» Project for Private University: Matching Fund Tilskudd (S0801034) fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi, Japan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blant de lever og galle ondartede svulster, galleveier kreft (BTC), som inkluderer intra- og ekstrahepatiske kolangiokarsinom og galleblæren kreft [1], er økende i forekomsten. BTC oppstår fra galleveiene epitel og ofte fører striktur eller obstruksjon av galle duct [2]. En konsekvens av denne hindringen er retensjonen av galle, noe som fører til gulsott. Pasienter mistenkt for å lide av BTC og presentere med kliniske symptomer som gulsott er vanligvis undersøkt ved hjelp av diagnostiske imaging teknikker, inkludert ultralyd, computertomografi (CT) og magnetisk resonans cholangiopancreatography (MRCP). Imidlertid har disse teknikker begrenset sensitivitet for påvisning av BTC [3], og å etablere en nøyaktig diagnose av kreft i et klinisk miljø er ofte vanskelig fordi mange godartede lidelser viser lignende symptomer. Resultatet er ofte en forsinket diagnose av BTC [4]. Tidlig påvisning av BTC er avgjørende for pasientens utfall fordi a) BTC er assosiert med dårlig prognose [4]; b) det er preget av ikke-respons /svakere respons på kjemoterapi og strålebehandling; og c) den eneste kurative behandling er kirurgisk reseksjon [5], [6]. BTC pasienter ofte gjennomgå en operasjon før deres tilstand er definitivt fast bestemt på å være ondartet [7]. Således er forbedringen i diagnostisk treffsikkerhet for BTC nødvendig, særlig i lys av den økende globale forekomsten av sykdommen. I løpet av de siste 10 årene, har betydelige fremskritt blitt gjort i å forstå patogenesen av BTC, og flere gener og proteiner som bidrar til de molekylære mekanismer for galleveiene karsinogenese er blitt identifisert [8], [9], [10], [11 ], [12].
microRNAs (mirnas) er endogent uttrykt, kort, ikke-kodende RNA 18-25 nukleotider i lengde som undertrykker protein oversettelse ved å binde seg til målet mRNA. I feltet av kreft, har en rekke studier utført på vev mirnas i et forsøk på å belyse sykdomsmekanismer og forbedre dagens diagnostiske og prognostiske indikatorer [13], [14], [15]. Nylig studier på nytten av miRNAs fra ekstracellulære komponenter, spesielt serum og plasma, har blitt rapportert [16], [17], [18]. For eksempel har det blitt vist at placenta-forbundet sirkulerende mirnas korrelerer med graviditet progresjon [16]. Cogswell
et al.
Utvinnes mirnas fra cerebrospinalvæsken og oppdaget Alzheimers sykdom spesifikke miRNA endres i samsvar med deres rolle som potensielle biomarkører for sykdommen [19]. Melkonyan
et al.
Oppdaget en rekke miRNAs i urin, inkludert noen utskilles transrenally, og foreslått nye diagnostiske muligheter for transrenal nukleinsyre analyse [20]. Andre steder, Michael
et al.
Hentet mirnas fra exosomes hentet fra spytt av friske kontroller og en pasient med Sjøgrens syndrom [21]. I sammenheng med kreft, har mirnas i serum fra pasienter med brystkreft og diffus stor-B-celle lymfom er vist å være stabil og meget prediktiv for malignitet og overlevelse [17], [18]. Disse rapportene tyder på betydelige roller for ekstracellulære mirnas, i tillegg til de av vev miRNAs, i regulering av mange fysiologiske prosesser. Ettersom dette feltet utvikler seg, kan disse mirnas bli diagnostiske og terapeutiske mål i klinisk relevante situasjoner. Disse rapportene forfremmet oss å spekulere i at mirnas kan være til stede og stabil i human galle, akkurat som de er i andre kroppsvæsker, og at galle-borne mirnas kunne brukes som nye biomarkører for BTC.
De viktigste komponentene av human galle er gallesyre, kolesterol, bilirubin, bikarbonater, elektrolytter og vann. Bile er produsert av hepatocyttene i leveren og strømmer via gallen kanalen inn i tolvfingertarmen, hvor det hjelper i lipid fordøyelse og absorbsjon [22]. Som blod, kan galle bli samlet fra pasienter som gjennomgår diagnostiske og /eller terapeutiske galle drenering. Man kan derfor forstå nytten av et BTC biomarkør i galle og /eller serum. En galle biomarkør kan fremskynde diagnosen BTC ved å spørre flere histologiske undersøkelser som galle cytologi, børste cytologi og tang biopsi av gallegang.
I denne studien, vi først undersøkt om mirnas eksisterer og kan påvises i human galle ved små RNA bibliotek sekvensering. Deretter bestemmes vi om uttrykket av spesifikke miRNAs i galle skiller mellom pasienter med kreft og de uten kreft ved hjelp av høy gjennomstrømming real-time PCR-basert miRNA uttrykk mikromatriser. Til slutt vurderes vi potensialet av galle mirnas som nye biomarkører for BTC.
Materialer og metoder
Bile samling
Studien protokollen ble godkjent av Human Etisk komité Nippon Medical School og forskningsetiske komité for Nippon Medical School. Pasienter som signerte en skriftlig informert samtykkeskjema ble inkludert i denne studien. Galleprøver ble samlet inn fra 18 pasienter som lider av gallesykdommer (inkludert BTC og choledocholithiasis) som gjennomgikk diagnostiske og /eller terapeutiske galle drenering via perkutan transhepatisk cholangiodrainage, perkutan transhepatisk galleblæren drenering, eller endoskopisk nasobiliary drenering. Ni pasienter ble diagnostisert histologisk med adenokarsinom (syv med kolangiokarsinom og to med galleblæren kreft). Vi inkluderte ni alderstilpassede kontrollpasienter diagnostisert med choledocholithiasis uten nåværende eller tidligere malignitet eller en betennelsestilstand (tabell 1).
Utvalgets behandling og RNA ekstraksjon
RNA ble ekstrahert fra 5 ml av galle fra hver enkelt på den samme dag som samling. Nukleinsyren fraksjon ble erholdt ved ekstrahering i fenol-kloroform-isoamylalkohol (25:24:1) etterfulgt av etanolutfelling (-80 ° C i 30 minutter). Totalt RNA ble oppnådd ved bruk av RNAiso Plus (Takara Bio, Tokyo, Japan) ifølge fremstillingen protokoll. Ekstraherte RNA prøver ble lagret ved -80 ° C inntil bruk.
Sanntidshenholdsvis PCR
Totalt RNA ble revers-transkribert ved hjelp av ikke-spesifikke primere /primere som var spesifikke for hver mRNA /miRNA, . Triplikate prøver av den resulterende cDNA ble utsatt for real-time PCR bruker TaqMan miRNA primere /prober (Applied Biosystems, Tokyo, Japan) med en 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems).
Små RNA bibliotek sekvense av galle mirnas
miRNA kloning metoder er beskrevet i vår forrige rapport [23]. Kort sagt ble totalt RNA prøver ekstrahert fra galle ved hjelp RNAiso Plus (Takara Bio) (se ovenfor) og separeres i en denaturerende polyakrylamidgel. 18-24-nt fraksjon ble deretter utvunnet. Deretter 5′- og 3′-adaptere ble ligert til RNA, og real-time PCR ble utført. Amplifisering av cDNA-fragmenter ble oppnådd ved to etterfølgende runder med PCR. Spesifikk restriksjonsenzymspaltning av adapterne er tillatt for concatemerization av cDNA til større fragmenter. Disse fragmentene ble deretter klonet inn i en vektor for å skape et cDNA-bibliotek. Concatemerization øker lengdene av de informative sekvenser som kan oppnås fra hver klon. De små RNA sekvenser ble analysert med henblikk på homologi med kjente mirnas. Annotering av miRNAs ble utført ved hjelp av miRBase (siste versjon) homologi analyse funksjon.
Real-time PCR-basert miRNA uttrykket profilering
Totalt miRNA (350 ng) ble revers-transkribert ved hjelp Megaplex RT Primere (Applied Biosystems). De resulterende cDNA ble pre-forsterket ved hjelp megaplex preamp Grunning (Applied Biosystems) og pre-forsterket produkter brukes på en TaqMan Menneskelig mikroRNA Array Panel (A og B, v2.0). Real-time PCR ble utført ved hjelp av en 7900HT Fast Real-Time System (Applied Biosystems). De Real-Time PCR data innhentet ved bruk av TaqMan mikroRNA Panel ble analysert med Applied Biosystems programvare (SDS ver. 2.3 og RQ leder ver. 1.2). mirnas ekspresjonsnivåer av pasienten M9 (se tabell 1) ble satt til 1,0. mirnas som uttrykk var ikke påvises i pasient M9 (se tabell 1) ble ekskludert fra videre analyse. For kvantifisering, ble den relative CT-metoden (ΔΔCT metoden) anvendt. U6 ble anvendt som en intern kontroll. For alle 18 pasienter, ble dette assay utført ved anvendelse av Panelene A og B. Vi bestemt cut-off for signifikans ved hjelp av en avstemningsparameter delta, valgt på basis av en falsk-positiv hastighet på null. Matrisen data ble brukt til å konstruere mottaker ende karakteristiske (ROC) kurver ved å plotte forholdet mellom sanne positive (sensitivitet) og falske positiver (1 – spesifisitet). Arealet under kurven (AUC), et mål på diskriminering nøyaktighet, ble også beregnet.
miRNA stabilitet analysen
For å vurdere stabiliteten av endogene miRNAs i galle, målte vi miRNA nivåer i galle fra tre individer som var blitt inkubert ved romtemperatur i 0 til 24 timer. I korthet, 5 ml av hver galle prøven ble inkubert, og mirnas ble hentet ut og renset ved planlagte tidspunkter ved hjelp av metoden beskrevet ovenfor. RNA prøver ble deretter reversere-transkribert og utsatt for real-time PCR. For å måle stabiliteten av eksogene miRNA, et syntetisk
Caenorhabditis elegans
miRNA (
cel-MIR-39
) ble tilsatt til hver galle prøve i starten av inkubasjonstiden (0 h) og utsatt for de samme ekstraksjons- og kvantifisering prosedyrer. For å normalisere data, syntetisk
C. elegans
miRNA
cel-MIR-238
ble satt til nukleinsyre brøkdel umiddelbart før revers transkripsjon for å tjene som en intern kontroll i real-time PCR.
Bile fraksjone
Galle blir rapportert som skal fraksjoneres i fire deler ved å øke både sentrifugalkraften og varigheten av sentrifuger [24]. For å vurdere galle miRNA lokalisasjon, fraksjonert vi 12 ml prøver av galle fra tre individer ved differensiell sentrifugering [25] og sammenlignet ekspresjonsnivået av de mirnas i hver fraksjon (fig. 1). Relativt store komponenter som hele celler, kjerner og cellulære cytoskeletons sedimentere på en
lav hastighet plakater (1000 ×
g
for 10 min). Pellets inneholder mitokondrier, lysosomer, og peroxisomes ble oppnådd på et
middels hastighet plakater (20.000 x
g
i 20 min), og mikrosomer og små blærer på
høy hastighet product: ( 80.000 ×
g
i 1 time). Til slutt ble de minste komponenter (f.eks, ribosomer, virus og store makromolekyler) oppsamles ved en
svært høy hastighet
med en lang periode med sentrifugering (150000 x
g
i 3 timer) ( Figur 1). RNA ble ekstrahert fra hver pellet ved hjelp av RNAiso Plus (Takara Bio) i henhold til produsentens protokoll, og ekspresjon av enkelte vilkårlig utvalgte mirnas ble målt ved hjelp av sanntids-PCR som beskrevet ovenfor. Ekspresjonsnivået av mRNA som koder for galle epiteliale markør cytokeratin 7 (CK-7) ble også målt for å bekrefte at fraksjoneringen var blitt foretatt på riktig [26], [27], [28], [29].
human galle ble utsatt for gjentatt sentrifugering ved stadig høyere hastigheter for å separere celler og organeller. Sentrifugering forhold (tyngdekraft og tid) var som følger: lav hastighet, 1000 x g i 10 min; middels hastighet, 20 000 x g i 20 min; høy hastighet, 80 000 x g i 1 time; svært høy hastighet, 150 000 × g for 3 timer.
Resultater
Bekreftelse på eksistensen av miRNAs i human galle
Til dags dato har det ikke vært noen rapport på tilstedeværelsen av mirnas i gallen. Vår første prioritet var å avgjøre om mirnas finnes i galle, og hvis så, for å identifisere dem. Real-time PCR med spesifikke primere /prober viste at
MIR-21
var til stede i galle (Fig. 2A). Ved hjelp av galle som kildematerialet, små RNA-bibliotek sekvensering bekreftet tilstedeværelsen av flere mirnas, med
la-7b
å være den mest vanlige klonet (Fig. 2B og 2C). Disse funnene viser at mirnas er til stede i galle og at galle er en attraktiv biologisk materiale for miRNA analyse.
(A) Real-time PCR-basert miRNA påvisning av
MIR-21
. TaqMan miRNA real-time PCR ved hjelp av en sonde /primere spesifikke for
MIR-21
ble utført på tre galleprøver og en nei-mal kontrollprøve (NC). Legg merke til mangelen på et PCR-produkt i den negative kontroll (NC). (B) Representant kromatogram av sekvense resultatene etter kloning galle miRNA. Vannrette streker over kromatogrammet viser hver miRNA og linker (se Materialer og metoder). (C) Tabell som viser mirnas identifisert fra kloning, deres relative frekvens, og om de ble klonet fra BTC eller godartet tilfeller.
High-throughput og kvantitativ mikroRNA uttrykk profilering av galle fra pasienter med galleveier kreft
For å identifisere galle mirnas som er avvikende uttrykk i galleveissykdommer, spesielt galleveis kreft, analyserte vi galleprøver fra alle 18 pasienter ved real-time PCR-basert miRNA uttrykket profilering (fig. 3A og Tabell S1 ). Relativ kvantifisering av dataene viste at 335 av de 667 mirnas var signifikant mer høyt uttrykt i ondartet gruppen enn i benign gruppen (
P
0,05) (Fig. 3A og tabell S1). Av disse, fremhevet vi 10 mirnas (
MIR-9
,
MIR-145 *
,
MIR-105
,
MIR-147b
,
la-7F-2 *
,
la-7i *
,
MIR-302c *
,
MIR-199A-3p
,
MIR -222 * Hotell og
MIR-942
) som uttrykk var betydelig høyere på
P
. 0,0005 (fig 3A). Stille spesifisitet terskelen til 100% [17], [30] viste at
MIR-9
,
MIR-302c *
,
MIR-199A-3p
, og
MIR-222 *
hadde en følsomhet nivå på 88,9%, noe som indikerer at disse miRNAs kan tjene som biologiske markører for galleveier kreft (fig. 3B). Følsomhetsnivået for
MIR-145 *
,
MIR-105
, og
MIR-942
var 77,8%, og at for
MIR-147b
,
la-7F-2 *
, og
la-7i *
var 66,7% (fig. 3B). I tillegg er området under ROC-kurven analyse viste at
MIR-9 Hotell og
MIR-145 *
kan være gode diagnostiske markører for BTC (Fig. 3C). Til sammen våre data viser at galle mirnas, særlig
MIR-9
, har potensial til å bli brukt som diagnostiske indikatorer for galleveiskreft.
(A) miRNA uttrykk varmekartet, med mirnas sortert i henhold til
P
-verdier. Prøver som er vist i rader, og mirnas i kolonner. miRNA ekspresjon i pasienten M9 (se tabell 1) ble satt til 1,0. Komplett microarray resultater kan bli funnet i den utfyllende informasjon. (B) Dot plott som viser uttrykket nivåer av de 10 mirnas som var betydelig mer høyt uttrykt i ondartet gruppen enn i godartet gruppe (
P
0,0005). Den vertikale logaritmisk aksen viser relative kvantifisering verdier oppnådd i en TaqMan matrise analysen. Stille spesifisitet terskelen til 100% viste følsomhetsnivået til å være 88,9% for
MIR-9
,
MIR-302c *
,
MIR-199A-3p
, og
MIR-222 *
; 77,8% i
MIR-145 *
,
MIR-105
, og
MIR-942
; og 66,7% i
MIR-147b
,
la-7F-2 *
, og
la-7i *
. ○, medianverdi. (C) ROC-kurve analyse. Uttrykket profil for hver miRNA ble brukt som inngang for mottakeren opererer karakteristikk (ROC) analyse. ROC kurven viser følsomhet mot 1 – spesifisitet. Arealet under kurven (AUC), et mål på diskriminering nøyaktighet, ble også beregnet.
Karakterisering av galle mirnas
For galle mirnas skal brukes diagnostisk i en klinisk setting, de trenger å være stabil. Vurderer sin nedbrytende natur, var det viktig å finne ut hvor lenge miRNA integritet kan opprettholdes i galle. Som vist på fig. 4, vi bekreftet at de endogene galle mirnas
MIR-21
,
la-7c
, og
MIR-9
var stabile i galle og at deres uttrykk nivåer holdt seg høy , spesielt innen 4 timer etter 24 timers inkubering. Men det eksogene miRNA
cel-MIR-238
ble umiddelbart degradert når det legges til de tre individuelle galleprøver (se Materialer og metoder). Disse observasjonene tyder på at endogene galle mirnas er i en stabil form som tåler ugunstige forhold, for eksempel potent RNase aktivitet og sterk syre, som forårsaker eksogene mirnas å bli degradert. Videre fraksjonerings analysene viste at, for alle tre prøver ble testet, alle mirnas, inkludert
MIR-9
, ble detektert i komponent inneholdende galle epitelceller, kjerner, og cytoskeletons, noe som indikerer at galle mirnas befinner seg hovedsakelig inne celler og kjerner. (Fig. 5).
De endogene menneskelige galle mirnas
HSA-MIR-21
,
HSA-la-7c
, og
HSA-MIR-9
er relativt stabile. I motsetning til syntetiske eksogene miRNA
cel-MIR-39
var raskt degradert når det legges til gallen.
Nivåer av mRNA og mirnas i hver fraksjon ble beregnet ut fra resultatene av fast -time PCR og volumet av total RNA for å sammenligne det forenklede absolutte antallet i hver komponent. (A) mRNA som koder for galle epitelet markør CK 7 ble hovedsakelig påvist i subcellulære komponenter, som omfattet hele celler, cellekjerner og celle cytoskeletons. (B) Den mirnas
MIR-21
,
MIR-9
, og
RNU6B
viste et lignende mønster, noe som indikerer at de fleste mirnas i galle ble avledet fra galle epitelceller . Fraksjonene ble innhentet gjennom lav hastighet (1), middels hastighet (2), Internett-tilgang (3); og svært høy hastighet sentrifugering (4).
Diskusjoner
Her rapporterer vi på tilstedeværelse og stabilitet av galle miRNAs, deres relative uttrykk nivåer, målt ved høy gjennomstrømming real-time PCR, og forskjeller i miRNA profiler mellom galleprøver fra pasienter med godartet og ondartet galleveier sykdom. Etter å ha bekreftet eksistensen av miRNAs i galle ved hjelp av spesifikke miRNA primere, utførte vi en mer omfattende analyse ved hjelp av miRNA mikromatriser, som tillater oss å teste for tilstedeværelse av 667 miRNA arter. Selv om dette er en liten studie, har vi tillit til at vårt konsept med å bruke mirnas å skille godartede /ondartede galleveissykdommer vil bli validert som mer store studier er utført i fremtiden. I tillegg til å foreslå diagnostisk bruk av galle miRNAs, har vi utviklet pålitelige metoder for å trekke ut og evaluere mirnas som er kompatible med klinisk testing. Komparativ analyse av uttrykket nivåer identifisert 10 mirnas hvis nivåene varierer mellom ondartede og godartede tilstander (
P
0,0005) (Fig. 3B). ROC analyse identifiserte to av disse mirnas som er egnet for anvendelse som BTC biomarkører (Fig. 3C). Spesielt,
MIR-9
viste pålitelig diagnostisk spesifisitet og sensitivitet.
I forbindelse med kreft biologi, avvikende uttrykk for
MIR-9
har vært forbundet med spredning [31 ], [32], [33], [34].
MIR-9
familien er oppregulert [32], [33] eller nedregulert [31], [35] i ulike kreft hos mennesker. Forskjellen i
MIR-9
uttrykk sett her kan ligne på scenen spesifikk regulering som ble demonstrert for
MIR-200
i leveren kreft [36]. Tidlig, når kreftceller blir invasiv og gjennomgår epitelial-mesenkymale overgang,
MIR-200
blir nedregulert, men det er senere oppregulert under reepithelialization av distale metastaser når cellene gjennomgå mesenchymale-epitelial overgang [36]. Mekanismen for
MIR-9
feilregulering i vår studie er fortsatt ukjent, men kan innebære avvik metylering av er promoter-regionen [31], [34], [37] eller f aktivering av transkripsjonsfaktoren MYC /MYCN [32 ]. Videre funksjonelle studier av
MIR-9
i BTC er nødvendig.
Vi har senere undersøkt biokjemiske egenskaper mirnas i gallen. Plasma har blitt rapportert å vise sterk RNase aktivitet [38]. Mitchell
et al.
Bekreftet dette RNase-aktivitet og vist at nakne mirnas var utsatt for degradering, mens endogene mirnas holdt seg stabil i plasma, selv i nærvær av RNase potent aktivitet [39]. Interessant, observerte vi tilsvarende forskjeller i stabilitet mellom endogene og eksogene mirnas i gallen (fig. 4). Stabiliteten av endogene galle mirnas gjør dem egnet som pålitelige biomarkører i kliniske situasjoner.
Hvordan endogene mirnas tåle de denaturerende betingelser for galle har ennå ikke forklart. Nyere studier har vist at de fleste av de sirkulerende mirnas finnes i exosomes, som beskytter dem mot nedbrytning og er ansvarlig for sin gode stabilitet [40], [41], [42]. Exosomes er 40-100 nm-membranvesikler av endocytic opprinnelse som inneholder både mRNA og miRNA. Exosomes kan overføres fra en celle til en annen, og deres komponenter kan fungere i det nye miljøet. Flere miRNA profilering studier har blitt gjennomført på exosomes som sirkulerer i blodet [40], [41], [42]. Vi først antas at stabiliteten av endogene galle mirnas resulterte fra deres tilstedeværelse i exosomes. Men i motsetning til våre forventninger, cellefraksjoneringsforsøk viste at de fleste av galle mirnas ikke ble funnet i små blærer, men i hele celler og kjerner (Fig. 5). Selv om det er ingen bevis for at galle mirnas har de samme funksjonene som i serum eller plasma, våre funn fra fraksjoneringsstudier og PCR-analyse av CK-7 tyder på at mirnas hentet fra galle er i hovedsak hentet fra intakte epitelceller eller ondartede celler som har blitt desquamated fra galle kanalen. Således endogene mirnas forbli stabil i gallen til nedbrytning av desquamated celler i hvilke de inneholdes. Når mirnas er gitt ut fra disse strukturene i gallen, er de sannsynligvis raskt degradert.
Det er et reelt behov for innovative verktøy for å diagnostisere BTC. For tiden, nærværet av carcinoembryonic antigen (CEA) og karbohydrat-19-9 (CA 19-9) i serum tjene som en standard for den kliniske diagnose av BTC. Som vist i tabell 1, er imidlertid følsomheten av denne testen ikke så høy som den som oppnås ved vår miRNA analyse. I åtte av ni BTC tilfeller gjorde serum CEA nivåer ikke øke, selv om kreft var til stede. I tillegg serum CA-19-9 nivåene ble bare økt i enkelte pasienter, sannsynligvis på grunn av kolestase. Diagnostiske Imagining teknikker som endoskopisk ultralyd (EUS) og intraductal ultralyd brukes når BTC er mistenkt. EUS gir en god oversikt over den distale ekstrahepatiske galletreet, galleblære, regionale lymfeknuter og blodkar [5]. Rösch
et al.
Sammenlignet den diagnostiske nøyaktigheten av ercp (ERCP), MRCP, CT, og EUS i 50 pasienter med galle strikturer. Sensitiviteten /spesifisitet for diagnosen kreft var 85% /75% for ERCP, 85% /71% for MRCP, 77% /63% for CT, og 79% /62% for EUS [43]. I en prospektiv studie av pasienter med mistanke om kolangiokarsinom, EUS hadde en diagnostisk sensitivitet på 79% og en spesifisitet på 62% [44]. Videre, i en fersk meta-analyse, EUS hadde en sensitivitet på 78% og en spesifisitet på 84% [45]. Intraductal ultralyd med wire-styrt, tynn-kaliber, høyfrekvente sonder er utført under ERCP, og i tidligere studier viste nøyaktighet prisene for å skille godartede og ondartede strictures av 76-90% [46], [47], [48]. I tillegg til bildeteknikker, histologiske metoder som galle cytologi, børste cytologi og tang biopsi er obligatoriske for definitiv diagnose. Bile cytologi og børste cytologi har bare beskjedne nøyaktighet prisene for bestemmelse av malignitet, som strekker seg fra 30 til 70% i de fleste publiserte studier [5], [49], [50], [51], [52], [53]. Tang biopsi, som har en høyere nøyaktighet enn de andre histologiske prøver (43 81%), ikke er mye brukt fordi det krever en spesiell anordning og teknikk [54], [55], [56]. Tilsvarende mer spesialiserte EUS styrte finnålsaspirasjon biopsi, med en diagnostisk sensitivitet på 43 86% for galle strikturer [7], [57], [58], [59], [60], [61], er foreløpig kun brukes for bukspyttkjertelsvulster og dårligere gallegang strikturer og er ikke godkjent for bruk i andre forhold. Den lave diagnostisk nøyaktighet av noen av de nåværende brukte prøver bekrefter at BTC kan være vanskelig å diagnostisere. I lys av den dårlige prognosen for BTC [4], er det ønskelig å forbedre enkelheten og nøyaktigheten av testing. Resultatene fra vår undersøkelse viser at måling av galle mirnas kan forbedre hastigheten og nøyaktigheten av diagnostisering BTC. Videre er galle analyse gjennomførbart fordi galles mirnas er stabile og kan enkelt trekkes ut og analysert i kliniske settinger.
Videre undersøkelser med større antall pasienter og ulike studiepopulasjoner, samt studier av differensial skjerm mellom BTC og pre -malignant sykdommer, slik som primær skleroserende kolangitt er nødvendig for å oppnå klinisk aksept. Likevel, våre resultater viser at måling av galle miRNA nivåer er en praktisk tilnærming for å hjelpe vurderingen av BTC og kan sammenlignes med mange av dagens diagnostiske metoder, inkludert cytologi. Vi konkluderer derfor med at måling av miRNA uttrykket i galle ville være nyttig å skille mellom godartede og ondartede tilstander, spesielt i tilfeller som forblir udiagnostisert. Spesielt, galle
MIR-9
har stort potensial for bruk som en klinisk markør for galleveiskreft.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Expression nivåer av miRNAs i galle. En varme kartet ble bygget ved hjelp av data fra miRNA mikromatriser som brukes til å analysere galleprøver fra pasienter med ondartet og godartet sykdom. miRNA ekspresjon i pasienten M9 (se tabell 1) ble satt til 1,0. B, analyse av galle fra en pasient med godartet sykdom; M, analyse av galle fra en pasient med ondartet sykdom
doi:. 10,1371 /journal.pone.0023584.s001 plakater (XLSX)
Takk
Vi takker Takuji Kosuge og Yoshimi Hinohara for sine ekspert teknisk assistanse.
