Abstract
Bakgrunn
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall i verden, og mer enn 90% av lungekrefttilfellene er sigarettrøyk-relatert. Nåværende behandlingsalternativer er utilstrekkelig, fordi det molekylære grunnlaget for sigarett-indusert lungekreft er dårlig forstått.
metodikk /hovedfunnene
Her viser vi at humane primære eller udødeliggjort bronkial epitelceller utsatt for sigarettrøyk i åtte dager i kultur raskt spre seg, viser forankringsuavhengig vekst, og danner svulster i nakne mus. Ved hjelp av denne modellen av de tidlige stadier av røk-indusert tumorgenese, undersøkte vi de molekylære forandringer som fører til lungekreft. Det ble observert at de embryonale signalveier mediert av pinnsvin og Wnt aktiveres av røyk. Farmakologisk hemming av disse banene blokkert transformert fenotype.
Konklusjon /Betydning
Disse eksperimentene gi en modell hvor de tidlige stadiene av røyk-indusert tumordannelse kan utløses, og bør tillate oss å identifisere molekylære endringer kjøre denne prosessen. Resultater oppnådd så langt tyder på at røyk-indusert lungesvulster er drevet av aktivering av to foster regulatoriske veier, Hedgehog (Hh) og Wnt. Basert på nåværende og kommende tilgjengelighet av narkotika å hemme Hh og Wnt signalering, er det mulig at en forståelse av rollen til Hh og Wnt i lungekreft patogenesen vil føre til utvikling av nye behandlingsformer
Citation.: Lemjabbar-Alaoui H, Dasari V, Sidhu SS, Mengistab A, Finkbeiner W, Gallup M, et al. (2006) Wnt og Hedgehog er viktige formidlere av sigarettrøyk-indusert lungekreft. PLoS ONE 1 (1): E93. doi: 10,1371 /journal.pone.0000093
Academic Redaktør: Carl-Philipp Heisenberg, Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, Tyskland
mottatt: 04.10.2006; Godkjent: 09.11.2006; Publisert: 20.12.2006
Copyright: © 2006 Lemjabbar-Alaoui et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd R01 HL075602 og P01 HL024136 fra National Institutes of Health
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
The World helseorganisasjon rapporterer at om lag 1,25 milliarder mennesker røyker sigaretter daglig [1] og at røyking vil føre til om lag 10 millioner dødsfall per år innen år 2030 [2]. Omtrent en fjerdedel av disse dødsfall vil være fra lungekreft. Den molekylære patogenesen av lungekreft forblir uklar, men når forstått, kunne åpne veien for terapi.
Flere tilnærminger er blitt anvendt til å evaluere den molekylære patogenesen av sigarettrøyk-indusert lungecancer [3]. En tilnærming bruker dyremodeller der mus er utsatt for røyk daglig i fem til ti måneder (for oversikt se [4]. Selv om kreftsvulster utvikler hos mus, de grunnleggende trinnene i tumorigenesis har allerede skjedd og svulster vise et mangfold av genetiske avvik. Videre , ingen dyrearter røyke sigaretter måten mennesker gjør. Gnagere, for eksempel, er obligate nese breathers, noe som resulterer i en helt annen mønster av filtrering av partikler i svelget og øvre luftveier fra det som produseres av munnen puste (dvs. sigarettrøyking i . mennesker) Dermed disse
in vivo
dyrestudier gir ufullkomne modeller for menneskelig eksponering Andre studier har evaluert de individuelle bidragene fra bestemte røyk komponenter som er tenkt å bidra til tobakk kreftutvikling (f.eks 4- (methylnitrosamino). – 1- (3-pyridyl) -1-butanon (NNK), [5], [6] og benzo (a) pyren [7]. Denne fremgangsmåten er problematisk på grunn av den iboende kompleksitet av sigarettrøyk. Således er det sannsynlig at den biologiske respons på en kompleks blanding, for eksempel sigarettrøyk er ikke bare summen av flere uavhengige toksisitet.
en annen metode er å ekstrahere komponentene i røk som avgis fra brennende sigaretter ved å boble det gjennom en vandig oppløsning. Slike preparater, betegnes sigarettrøyk ekstrakt (CSE), har vært mye brukt som kildemateriale i ulike systemer [8], [9]. Viktigere, inneholder CSE de fleste av forbindelsene inhalerte av røykere. Dermed bruk av denne type røyk forberedelse i kultur gir et viktig og nyttig modell for vurdering av sigarettrøyk toksisitet.
I denne studien har vi utviklet et
in vitro
modell for å vurdere fenotypiske endringer i røyk indusert tumordannelse som er en rask, enkel og reproduserbar analyse hvor dyrket bronkiale epitelceller blir utsatt for CSE.
Resultater
Kronisk røyk eksponering induserer fenotypiske endringer karakteristisk for tumorceller
Vi først etterlignet effektene av kronisk sigarettrøyk eksponering ved gjentatte ganger å behandle ikke-kreft menneskelige bronchial epithelial BEAS-2B celler [10] med CSE i kultur. Vi behandlet BEAS-2B celler for 0 til 8 dager med CSE etterfulgt av en frisk periode på tre uker. CSE induserte en tidsavhengig toksisitet hos BEAS-2B-celler (figur 1A). Vi genererte syv cellepopulasjoner, betegnet B1, B2, B3, B5, B6, B7 og B8, hver representerer celler som forble levedyktige etter det angitte eksponeringstiden punkt i dager. B0 celler representerer ubehandlede celler. Cellepopulasjoner som oppsto fra de få cellene som overlevde de toksiske effektene av røyk eksponering for 8 dager (B8 celler) kjøpte fenotypiske endringer som inkluderte økt celleproliferasjon (figur 1B), og kortere doblingstidene.
Kronisk røyk eksponering induserer giftighet og endringer knyttet til mobilnettet transformasjon. A: Toxicity forårsaket av røyk eksponering. Vist er dyrket BEAS-2B celler etter 0, 4 og 8 dager med vekst i medium som inneholder røykekstrakt. B: Proliferation analysen på cellelinjer dyrket i 1-5 dager, avledet fra CSE-eksponerte celler ved 4 tidspunkter (0,3,7 og 8 dager). Feilfelt representerer verdier ± S.E.M.. * P 0,001. C: Cell-substrat vedheft analyser på plast, morkake kollagen og fibronectin ved hjelp av dyrkede BEAS-2B celler etter den angitte tidspunkt i dagene av vekst i medium som inneholder røykekstrakt. Analyser ble analysert etter 60 minutter i kultur. Feilfelt representerer standardavvik n = 4 * P 0,001. D: Cell migrasjon analyser ved hjelp av etablerte cellelinjer etter 24 timer i kultur. Feilfelt representerer verdier ± S.E.M.. n = 4 * P 0,001. E: Actin cytoskjelettet av cellelinjer B0 og B8 fotografert av fluorescerende mikroskopi ved hjelp av Alexa Fluor 594 phalloidin. Skala barer representerer 20 mikrometer.
CSE-eksponerte celler viste redusert celle-substrat heft (figur 1C), økt cellemigrasjon (figur 1D) og endret morfologi og cytoskeletal struktur. B8 celler var mer avrundet og hadde økt aggregering og viste endret fordeling av aktin stresset fiber når farget med Alexa Fluor 594-konjugert phalloidin i forhold til foreldrenes kolleger (B0) (figur 1E). Endringer ble også observert for B6 og B7, men ikke for celler behandlet for kortere perioder. I samsvar med disse dataene, RNA-analyse av PCR, sammenligne B8 og foreldre motstykke B0, viste aktivering av gener som styrer cellevekst, inkludert cyclin D1 og c-myc (figur S1).
Kronisk røyk eksponering induserer anchorage -uavhengig cellevekst og tumordannelse naken mus
Siden de morfologiske vekst, vedheft og migrasjon endringer produsert av kronisk eksponering for CSE var minner om fenotyper karakteristisk for oncogent transformerte celler, ved siden spurte vi om CSE-behandlede celler var i stand av forankringsuavhengig vekst ved å dyrke dem i bløt agar. Vi fokuserte på B8 celler, som hadde den lengste eksponering for CSE. Ved 10 dager, kolonier av CSE-eksponerte celler dannet i myk agar, bekrefter forankringsuavhengig vekst, mens B0 cellene ikke danne kolonier (Figur 2A).
Kronisk røyk eksponering induserer vekst i myk agar og tumordannelse i nakne mus. A: Anchorage uavhengighet ble analysert ved evnen av CSE-eksponerte celler til å vokse i bløt agar. B0 eller B8 celler (1 x 10
3) ble dyrket i myk agar i 15 dager før fotografering. Kvantifisering av kolonier er vist til høyre. Resultatene er representative for 5 eksperimenter. B: Tumor dannelse i nakne mus, 4 uker etter inokulering med B0 eller B8 celler. Piler indikerer store tumormasser som dannes i mus injisert med B8 celler. C: Del av et representativt svulst fra en mus inokulert med B8 celler farget med H og E. D: Bilder av myke agar analyser ved hjelp av HBE celler etter ingen røyk eksponering (P0) eller gjenvinnes HBE celler etter 8 dager med CSE eksponering (P8) . Kvantifisering av kolonier er vist til høyre. Resultatene er representative for 5 eksperimenter. E: Tumor dannelse i nakne mus, 4 uker etter inokulering med P0 og P8 celler. Piler indikerer store tumormasser som dannes i mus injisert med P8 celler. F: Utsnitt av en representant svulst fra en mus inokulert med P8 celler farget med H og E. Scale søylene representerer 50 mikrometer.
neste implantert B0 eller CSE-behandlet (B1 til B8) celler i immunodeficient mus (nude) for å avgjøre om den onkogene transformasjon kommet hele veien til tumorigenitet. Det er ingen tumorer ble dannet selv etter 3 måneder i nakne mus injisert med kontrollceller (B0), eller B1-B7-celler (data ikke vist) (n = 5 for hver cellelinje). Men alle mus (n = 5) implantert med B8 celler utviklet svulster med en latenstid på ca. 4 uker, noe som indikerer en høy virkningsgrad av murine tumordannelse (figur 2B). Histologisk karakterisering bekreftet at B8 cellene dannet karsinomer. Svulstene var sammensatt av variabel størrelse reir av polyhedral celler, som ble koblet sammen med tynne stromale tråder. Disse kreftcellene var moderat pleiomorphic med figurer fra runde til å forlenge. Kjerner var fremtredende og ofte flere. Mitotiske tallene ble lett sett (figur 2C). Vi etablerte fire tumorcellelinjer fra B8 tumorer, som beskrevet i Materialer og Metoder. Når disse celler ble inokulert i nakne mus, dannet de tumorer på det injiserte område med en kortere tidsforsinkelse (1-2 uker) enn foreldreceller (data ikke vist).
Smoke eksponering bevirker transformasjon av humane primære epitelial celler
Siden BEAS-2B er et SV40-udødelig bronkial epiteliale cellelinje, så spurte vi om røykinduserte endringene som er observert i BEAS-2B celler kan reproduseres i primære humane bronkiale epitelceller (HBE). CSE eksponering førte til en rask endring i primær HBE celler som bekreftes av både
in vivo Kjøpe og kultur eksperimenter. Vi isolerte cellelinjer fra HBE utsatt for røyk for 0-8 dager og betegnet dem P0-P8. De P8 celler ervervet evnen til å vokse i soft agar, mens ueksponerte kontrollceller ikke (figur 2D). P8 celler, men ikke deres foreldre kolleger P0, viste aktivering av gener som kontrollerer cellevekst, inkludert cyklin D1 og c-myc (figur S1). Viktigere, åtte dager etter eksponering for CSE var tilstrekkelig til å gi malign transformasjon av HBE celler; de P8 cellene dannet tumorer i nakne mus i 5 uker etter inokulering, mens ueksponerte P0 kontrollceller ikke (figur 2E og 2F). Samlet utgjør disse dataene viser at CSE kan forvandle ikke-kreft humane bronkiale epitelceller til en kreft fenotype.
CSE induserer Wnt og Hedgehog signalveier
Vi neste undersøkt mulige molekylære mekanismene bak overgangen til tumorvekst indusert ved eksponering til CSE. Den upassende re-aktivering av embryonale signalveier hos voksne celler som Wnt [11], Hedgehog [12] og Notch [13], kan gi en pådriver for tumorvekst. Derfor har vi analysert for Wnt, pinnsvin og Notch aktivitet ved hjelp av luciferase journalister responsive til transkripsjonsfaktorer som representerer den bortre effektor armen hver vei, ansette TOPFLASH, Gli-luciferase og Hes-luciferase journalister hhv.
Vi fant at størrelsen av TOPFLASH rapportøraktivitet, øket progressivt med eksponering til tobakksrøyk fra 1 til 8 dager (figur 3A), med B8-celler som viser en 25 gangers induksjon sammenlignet med B0 celler. Gli-luciferase reporter aktivitet økte også med langvarig eksponering tid til CSE, med B8 celler som gir et 7 ganger induksjon løpet B0 celler (Figur 3B). I motsetning til CSE-eksponering hadde ingen virkning på Hes1-luciferase-aktivitet (figur 3C), noe som indikerer at hakk banen ikke ble aktivert i CSE-eksponerte celler.
Kronisk eksponering til tobakksrøyk induserer Wnt og pinnsvin signalveier A : Wnt signale analysen av røyk utsatt Beas-2b cellepopulasjoner etter transfeksjon med TOPFLASH /FOPFLASH luciferase reporter konstruksjoner. B: Beas-2b-celler ble transfektert med Gli-TK eller TK alene for å bestemme Hh signalering. C: Notch signale analysen i Beas-2b celler ved hjelp av HMS-luciferase reporter. D, E og F: Samme som i A, B og C, ved hjelp av HBE celle populasjoner. Feilfelt representerer verdier ± S.E.M.. n = 6 * P 0,001.
Disse mønstrene av reporter aktivitet ble også replikert for eksperimenter utført med primære HBE celler eksponert for CSE. Både TOPFLASH (figur 3D) og Gli (figur 3E) reporter aktiviteten økt gradvis med røyk eksponering fra P1 til P8, mens ingen signifikante forskjeller ble observert for Hes-en luciferase aktivitet (figur 3F).
For å bekrefte at reporter aktivitet reflektert økt Wnt signal, vi undersøkte subcellulære plasseringen av β-catenin. I samsvar med et aktivert Wnt /β-catenin vei, observerte vi atom akkumulering av β-catenin i B8 og P8 celler ved immunocytokjemi (figur 4A og B). Videre, ved immunocytokjemi det var tydelig at Gli1 translokert til kjernen i B8 og P8 celler demonstrerer Hh bane aktivering (figur 4C og D).
Wnt og pinnsvin signalering er koblet til fenotypiske endringer indusert av kronisk eksponering til tobakksrøyk. A: Immunfarging viser økte nivåer av β-catenin (grønn) i kjernen av B8-celler sammenlignet med celler B0 og B: i kjernen av P8 celler sammenlignet med P0. C: Immunfarging viser økt ekspresjon av Gli (rød) i kjernen av B8-celler sammenlignet med B0 celler og D: i P8 celler sammenlignet med P0. Scale bar representerer 20 mikrometer.
Siden Wnt og Hh trasé er viktig i embryonale og stamcelle utvikling, vi spurte om noen embryonale markører ble reaktivert etter kronisk CSE eksponering. Spesielt, CSE-transform HBE og BEAS-2B celler uttrykte to stamcellespesifikke markører, Stellar og Oct4 [14] (figur S2). Til sammen disse resultatene indikerer at kronisk CSE eksponering induserer de embryonale Wnt og Hh signalveier samtidig at cellene tilegne seg evnen til å vokse i myk agar og danner svulster i nakne mus.
hemmere av Wnt og Hh påvirke transformasjon av CSE
siden brukte hemmere for å avgjøre hvorvidt disse aktiveres signalveier var ansvarlige for de funksjonelle endringer i CSE-transform bronkial celler. Den Hh sti-spesifikke inhibitor, cyclopamine undertrykte betydelig evne til B8 og P8 celler til å danne kolonier i bløt agar (figur 5A og B). Sulindak, en Wnt sti-spesifikk hemmer, også redusert koloni formasjon, men var noe mindre effektiv enn cyclopamine. I motsetning tomatidine, en inaktiv cyclopamine analog, NS-398 (COX-2-blocker) og GSI (en potent Notch pathway inhibitor) var uten effekt.
hemmere av Hh og Wnt signal blokkert forankringsuavhengig vekst og celle hyper av CSE utsatt celler. A: Evnen til kroniske røyk utsatt celler (B8), eller B: (P8), å vokse i soft agar i 15 dager ble analysert etter behandling med tomatidine, cyclopamine, sulindak, NS398, GSI eller kjøretøy kontroll. Kvantifisering av kolonier er vist til høyre. Resultatene er representative for 5 eksperimenter. C: B0 og B8 celler i kultur etter behandling med tomatidine, cyclopamine, sulindak eller kjøretøy kontroll.
Behandling av B0 celler i enlagskultur med cyclopamine eller sulindak endret ikke forandringer i celletetthet eller morfologi etter 6 dager i kultur i forhold til kontroller som inkluderte ubehandlede celler eller celler behandlet med tomatidine, NS 398 eller GSI (figur 5C). I motsetning til dette ble det observert en markert reduksjon i celletetthet i B8 celler behandlet med cyclopamine eller sulindac, sammenlignet med ubehandlede celler eller celler behandlet med tomatidine. Celler behandlet med NS-398 eller GSI (data ikke vist) var uendret. Flertallet av cyclopamine-behandlede B8 cellene løsnet fra dyrkningsplaten løpet av behandlingsperioden, og de få gjenværende cellene først aplastisk, dvs. ikke oppviser vekst eller endring i struktur. Dermed blir forankringsuavhengig og monolaget vekst av CSE-transformerte celler krever Hh vei og, i mindre grad, den Wnt pathway. For å bestemme virkningsmekanismen av Wnt og Hh pathway hemmere, evaluert vi spredning, levedyktighet og apoptose (figur S3 og S4). Ved hjelp av BrdU inkorporering og celle levedyktighet analyser for å måle celleproliferasjon og annexin analyser for å vurdere celle apoptose, fant vi at verken cyclopamine eller sulindak produsert endringer i B0 celler. Imidlertid cyclopamine induserte en markert apoptose i B8-celler, som ble fulgt av en signifikant reduksjon i celleformering. Sulindac behandling induserte en moderat, men betydelig økning i B8 celle apoptose (men mindre enn cyclopamine) og en reduksjon i celleformering. Kontroll behandlinger med kontroll medium som inneholder tomatidine eller DMSO alene var uten effekt. Disse resultatene forsterke den konklusjon at aktiveringen av embryonale trasé Wnt og Hh, men ikke Notch, er en stor bidragsyter til spredning og overlevelse av CSE-transformerte celler.
Videre behandling med enten cyclopamine eller sulindak avskaffet transkripsjonen aktiviteten av Wnt veien bestemmes av TOPFLASH aktivitet i B8 celler (figur 6A), men var uten virkning i B0-celler. Tomatidine-behandlede celler viste ingen signifikante endringer i TOPFLASH aktivitet sammenlignet med ubehandlede celler. Viktigere, mens cyclopamine behandling forårsaket betydelig reduksjon i Hh pathway transkripsjonen aktivitet målt med Gli-luciferase aktivitet i B8 celler, sulindak var uten effekt på TOPFLASH aktivitet (figur 6B). Verken stoffet påvirket B0 celler. Disse dataene antyder at Hh veien kan drive oppstrøms av Wnt veien i B8 celler
Hemming av Wnt og Hedgehog signale reduserer tumorstørrelse i hårløse mus A:. Effekt av Wnt og Hh-hemmere på Wnt signal i B0 vs . B8 celler ved hjelp TOPFLASH /FOPFLASH luciferase reporter konstruksjoner. B: Effekt av Wnt og Hh-hemmere på Hh signalisering i B0 vs. B8 celler transfektert med Gli-TK eller TK alene. C: Representative tumorer skåret ut fra mus etter ingen behandling (Con) eller etter 15 dagers behandling med legemidler som angitt. Grafene viser sammenligning av tumorvolum (cm
3) og vekt (g). Veh er bilen alene. Feilfelt representerer verdier ± S.E.M.. n = 5 * P 0,001. D:. H og E farging av representative svulster som dannes i mus injisert med B8 celler og behandles med legemidler som angitt
CSE-behandlet HBE celler viste også eksponering tidsavhengig aktivering av Hh og Wnt signalveier i rapportør analyser (figur 3) og ved kjerne akkumulering av β-catenin og Gli1 (figur 4). Igjen, hemmere av Hh og Wnt signal, men ikke Notch signale hemmere (Figur 5B og figur S5) blokkert deres forankringsuavhengig vekst og celle hyper. Disse resultatene indikerer at den transformerte fenotypen til røyktransformerte primærceller HBE er også Hh og Wnt signaleringsavhengig.
Behandling med inhibitorer av Wnt og pinnsvin trasé reduserer veksten av tumorer som oppstår fra røyk-transform bronkiale epitelceller hos mus
Vi så bestemt om hemme wnt og Hh trasé vil påvirke
in vivo
veksten av svulster forårsaket av CSE-transformerte celler. Nakne mus med etablerte subkutane xenografttumorer avledet fra B8-celler viste en reduksjon i tumormasse og volum 80% og 92% henholdsvis etter 15 dager med behandling cyclopamine sammenlignet med den ubehandlede kontrollgruppe og den bærerbehandlede gruppe (figur 6C). På samme måte ble det observert en reduksjon i tumormasse og volum 53% og 72% henholdsvis i sulindac-behandlede dyr sammenlignet med ubehandlede kontroller. Videre samtidig behandling med sulindak og cyclopamine (begge inhibitorer ble anvendt ved halvparten av den konsentrasjon som brukes i tidligere forsøk), resulterte i signifikant større reduksjon i CSE-transformerte celleproliferasjon, sammenlignet med enkeltbehandlinger med hver inhibitor alene (figur S6). Histologiske analyser av de høstede tumorer viste en fibrotisk degenerering av svulster i både cyclopamine og sulindac behandlede grupper (figur 6D). Disse svulstene viste løse epitelceller tilslag med en stor mengde ispedd mesenchyme. Svulster fra ubehandlede kontroller eller bærer-behandlede dyr viste en kompakt masse av epitelceller. Disse forsøkene viste at de embryonale signalveier Hh og Wnt er viktige bidragsytere til spredning, overlevelse og svulstdannelse av CSE-transform BEAS-2B celler.
Diskusjoner
I denne studien har vi vist at kronisk eksponering for sigarettrøyk trekke lett kan skade lunge epitelceller, indusere hyperplasic vekst, ondartede celletransformasjon og kreftutvikling. Våre resultater viser at primære humane bronkiale epitelceller og SV40-udødelig BEAS-2B celler overlevende 8 dager med gjentatt CSE eksponering er utstyrt med fenotypiske endringer som er karakteristisk for onkogene transformasjon: endring i vekstkinetikk, økt celledeling, redusert celle-substrat heft , økt migrasjon aktivitet, forankrings-uavhengig vekst, og, viktigst av alt, evnen til å produsere tumorer i nakne mus. Vi viser for første gang at kronisk CSE eksponering effektivt kan forvandle ikke-kreft primære og udødeliggjort, menneske bronkial epitelceller
in vitro
inn en kreft fenotype. Denne tilnærmingen gir et nytt verktøy for å studere utviklingen av lungekreft.
Tumor progresjon vanligvis oppstår i tid og rom overlappende stadier, som består av premaligne hyperplasia, dysplasi, carcinoma
in situ
, og invasiv kreft [15]. Effekten av eksponering til tobakksrøyk forekommer også i etapper. Ved røykeksponering vi først se hyper av lungeceller. I tidligere arbeid rapporterte vi at denne celle hyperplasi ble fremkalt av røk-indusert aktivering av epidermal vekstfaktor-reseptor [16]. Den resulterende lunge celle hyperplasi er skadelig fordi addukter forårsaket av røyk karsinogener produsere mutasjoner under DNA replikasjon. Vi har også observert en tidlig induksjon av ekspresjon av oncoproteinet BCL2, et anti-apoptotiske proteiner som regulerer celleoverlevelse (upublisert observasjon). Samlet utgjør disse dataene dokumentert røyk-indusert transformasjon av normale bronkial epitelceller til tumorigene celler i systemet vårt.
Aberrant reaktivering av utviklingsveier Hh og Wnt har vært innblandet i kreft vekst [11], [17 ]. I lungen, disse banene spille en mangefasettert rolle; deres aktivering er kritisk for utvikling lunge, mens deres deregulering kan føre til inflammatoriske sykdommer så som lungefibrose og kreft transformasjon. β-catenin er en sentral aktør i Wnt veien, overføre Wnt signaler til kjernen og kritisk bidra til tumorigenesis gjennom aktivering av onkogener (f.eks cyclin D1 og c-myc) eller gjennom egne sporadiske mutasjoner (anmeldt i [18]. Viktigere , Wnt /β-catenin komponenter er ofte mutert eller overuttrykt i lungekreftceller og deres inhibering induserer apoptose i disse celler [19], [20].
Tidligere studier har vist at akutt luftveis epiteliale restitusjon resulterer i utstrakt aktivering av intraepitelial Hh signalering, som angitt ved markert ekspresjon av både Hh ligander og den Gli transkripsjonsfaktor, som er det effektor komponenten av Hh-signalering i pattedyr [11]. i mennesker, småcellet karsinom, en dødelig luftveis malignitet sterkt knyttet sigarettrøyk eksponering avhenger av aktivering av Sonic Hh veien [11]. Denne veien er også aktivert i humane lunge squamous karsinomer og adenokarsinomer noen lunge forårsaket av sigarettrøyk eksponering [12], [21].
våre resultater viser at CSE eksponering aktiverer Wnt /β-catenin og Hh signalisering i bronchial epitelceller. Videre er stimulering av disse reaksjonsveier faller sammen med fasen når cellene tilegne seg evnen til å vokse i myk agar og danne tumorer i nakne mus. Behandling av slike transformerte celler med Hh eller wnt inhibitorer blokkert kolonidannelse i myk agar, og mus inokulert med røyk-transformerte celler viste degenerasjon av tumorer når de ble behandlet med noen av disse inhibitorer. Disse resultatene tyder på at Wnt /β-catenin og Hh trasé spille en kausal rolle i initiering, vedlikehold, spredning og overlevelse av CSE-transformerte epitelceller.
Fra våre studier synes Wnt veien aktivering gå forut Hh pathway aktivering ved kronisk CSE eksponering, som utledes av de observasjoner som cyclopamine behandling sterkt redusert Wnt signal aktivitet i disse cellene, men behandling med sulindak ikke påvirke Hh signalering. Videre vises det Hh vei til å spille en relativt sterkere rolle enn Wnt signal i vedlikehold av celleproliferasjon og celleoverlevelse i CSE-transformerte celler.
Dermed våre data argumentere for en hierarkisk og synergistisk forhold mellom Hh og Wnt signalveier i sigarettrøyk-indusert lungekreft. Dette i motsetning til en fersk rapport at indiske Hh motvirker Wnt signal i differensiere kolonepitelet og colonic kreftceller [22]. Dermed kan klare sammenhenger mellom disse embryonale trasé innenfor ulike typer svulster.
En viktig, men uløst spørsmål er om aktivering av disse embryonale trasé er tilstrekkelig til å fremkalle lungekreft utvikling.
resultatene viser at Wnt veien er aktivert i celler eksponert for røyk i kortere perioder (≥ 2 dager) (figur 3A og D). Det er imidlertid bare 8 dager røyk eksponeres cellene var i stand til forankringsuavhengig vekst og tumordannelse in vivo. Disse resultatene indikerer at Wnt bane aktivering alene ikke er tilstrekkelig til å indusere fullstendig ondartet transformasjon av normale lungeceller. Etter avtale med dette, har det vist seg at Wnt veien er en fremmende faktor av humant papillomavirus (HPV) indusert human keratinocyte malign transformasjon. Likevel er denne studien viser også at aktivering av Wnt reaksjonsveien i fravær av HPV var ikke tilstrekkelig til å indusere malign transformasjon [23].
Våre data viser også at Hh-aktivering forekommer i cellene gjentatte ganger utsatt for røyk for ≥ 7 dager i udødeliggjort BEAS2B celler og ≥2 dager i primær HBE celler (figur 3B og E). Selv om celle-proliferasjon og overlevelse av disse cellene som kreves Hh-aktivitet (data ikke vist), ble det ikke dannet tumorer, selv etter 3 måneder i nakne mus injisert med B0-B7-celler eller P0-P7-celler (data ikke vist). Men alle mus implantert med B8 eller P8 celler utviklet tumorer. Disse observasjonene hevder også at Hh aktivisering er ikke tilstrekkelig til å indusere fulle malign transformasjon av lungeceller.
Tatt sammen våre funn tyder på at mens aktivering av kanoniske Wnt og Hh pathway er nødvendig for tumordannelse, annen røyk-indusert genotypisk endringene er også nødvendig for å skape full malign transformasjon av lungeceller.
til slutt, våre resultater tyder på at CSE-transformerte celler uttrykker stamcellespesifikke markører. Nyere bevis tyder på at stamceller kan være kilden av mutante celler som gir opphav til svulster og opprettholde sin vekst [24]. Svulster kan oppstå og vokse som et resultat av dannelsen av kreft stamceller, som selv kan omfatte bare en mindre del av cellene i en svulst, kan det likevel være kritisk for dens formering. Dette øker muligheten for at CSE eksponering kan målrette stamceller eller indusere kreft stamcelle formasjon. Videre undersøkelser er nødvendig for å teste denne hypotesen.
Disse funnene øke muligheten for at Wnt og Hh pathway hemmere kan være grunnlag for nye behandlingsformer for behandling av røyking-indusert lungekreft.
Materialer og Methods
Cell Culture
human bronkial epitelcellelinje BEAS-2B (oppnådd fra ATCC) ble anvendt i disse studiene. Disse cellene er forankringsavhengige og ikke-tumorigen i nakne mus. BEAS-2B-celler ble utviklet ved transformasjon med SV40 stort T-antigen. BEAS-2B-celler ble holdt i RPMI-medium supplert med 10% føtalt kalveserum og 1% (v /v) 10.000 enheter /ml penicillin /streptomycin i en atmosfære av 5% CO
2 ved 37 ° C.
primære humane bronkiale epitelceller (HBE) celler ble også brukt i disse studiene. Vi definerte primær (P0) kulturer som celler belagt direkte etter isolering. Bronkiale epitelceller ble isolert ved anvendelse av fremgangsmåter som er beskrevet tidligere [25], [26].
