Abstract
cyclin-avhengig kinase inhibitor 3 (
CDKN3
) genet er involvert i mitose, er oppregulert i livmorhalskreft (CC). Vi undersøkte
CDKN3
mRNA som en overlevelse biomarkør og potensiell terapeutisk mål for CC.
CDKN3
mRNA ble målt i 134 CC og 25 kontroller av kvantitativ PCR. En 5-års overlevelse Studien ble gjennomført i 121 av disse CC pasientene. Videre
CDKN3
-spesifikke sirnas ble brukt for å undersøke om
CDKN3
er involvert i spredning, migrasjon og invasjon i CC-avledet cellelinjer (Siha, CaSki, HeLa).
CDKN3
mRNA var i gjennomsnitt 6,4 ganger høyere i tumorer enn i kontrollgruppen (p = 8 x 10
-6, Mann-Whitney). Totalt 68,2% av CC pasienter over uttrykker
CDKN3
genet (endring ≥ 17) døde innen to år etter diagnose, uavhengig av klinisk stadium og HPV type (Hazard Ratio = 5,0, 95% KI: 2,5 -10, p = 3,3 x 10
-6, Cox proporsjonal farer regresjon). I kontrast, bare 19,2% av pasientene med lavere
CDKN3
uttrykk døde i samme periode. In vitro inaktivering av
CDKN3
nedsatt celleformering i gjennomsnitt 67%, selv om det ikke hadde noen effekt på cellemigrering og invasjon.
CDKN3
mRNA kan være en god overlevelse biomarkør og potensiell terapeutisk mål i CC
Citation. Barrón EV, romersk-Bassaure E, Sánchez-Sandoval AL, Espinosa AM, Guardado-Estrada M, Medina jeg, et al. (2015)
CDKN3
mRNA som en biomarkør for overlevelse og terapeutisk mål i livmorhalskreft. PLoS ONE 10 (9): e0137397. doi: 10,1371 /journal.pone.0137397
Redaktør: Zhi-Ming Zheng, National Institute of Health-National Cancer Institute, USA
mottatt: 18 desember 2014; Godkjent: 17 august 2015; Publisert: 15.09.2015
Copyright: © 2015 Barrón et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Council of Science and Technology (CONACYT, www.conacyt.mx), gi tall 8135 /A1, 24341 (til JB ), National University of Mexico (www.unam.mx), stipend nummer SDI.PTID.05.2 (JB), og National Council of Science and Technology (CONACYT, www.conacyt.mx), stipend (til EVB). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Forkortelser : CC, livmorhalskreft; HPV, Human papilloma virus; CDKN3, Cyclin-avhengig kinase inhibitor 3; FIGO, Fédération Internationale de Gynécologie Obstétrique; GAPDH, glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase; RT-qPCR, Retro transkripsjon-kvantitativ PCR; FC, Fold endring; ROC, mottaker Operator Karakteristisk; MW, Mann-Whitney test; HR, Hazard ratio
Innledning
Livmorhalskreft (CC) er den fjerde vanligste kreftformen hos kvinner over hele verden [1]. Hvert år 530.000 nye tilfeller blir rapportert, og er den ledende dødsårsaken av kreft hos kvinner fra utviklingsland [2, 3]. Humant papillomavirus (HPV) er til stede i nesten 100% av CCS pasienter og regnes som den viktigste årsaken til utvikling av CC. Worldwide, HPV 16 er den hyppigst påvist virustype i CC, som finnes i ca 50% av tilfellene, etterfulgt av HPV 18 (15%) [4, 5]. Vaksiner i dag benyttes er svært effektive i å forebygge infeksjoner med HPV-typene 16 og 18. De har også forebygge utvikling av høygradig cervikal intraepitelial neoplasi knyttet til disse virusene [6, 7]. Men siden disse vaksinene gir beskyttelse mot bare enkelte virus og varigheten av immunresponsen er ukjent, anbefales det at vaksinerte kvinner fortsetter å være registrert i tidlig deteksjon programmer for CC [8, 9]. I mange land har disse vaksinene blitt innlemmet i vaksinasjonsprogrammet for jenter i alderen 9-12 år [10, 11]. Til tross for vaksine gjennomføring, den naturlige historie av sykdom tyder på at en innvirkning på livmorhalskreftforekomst ikke vil bli sett i flere tiår. [10, 12]. Videre, i henhold til fordelingen av HPV-typene 16 og 18 mellom ulike aldersgrupper, omtrent halvparten av kvinner over 50 år med CC ville ikke være beskyttet av slike forebyggende vaksiner [13]. Derfor er det nødvendig å forbedre fremgangsmåtene for tidlig deteksjon og behandling av CC.
Nåværende behandling for CC omfatter kirurgi, kjemoterapi, strålingsterapi eller en kombinasjon av disse behandlinger, avhengig av den kliniske stadium av sykdommen. Selv om suksessen til disse konvensjonelle metoder er avhengig av den kliniske stadium av sykdommen, generelt, avtar pasientoverlevelse med fasen av sykdommen [14]. Mens det er målrettet terapi for mange typer kreft [15], er det ingen spesifikke målrettet terapi mot CC. Muterte teinene, spesielt protein kinaser, er målene for de fleste spesifikke målgruppen kreftmedisiner [16]. I tillegg er noen bestemte legemidler rettet mot normale proteiner oppregulert i tumorer, slik som HER2 /neu i brystkreft [17, 18]. Identifisering av oppregulert molekylære mål i CC, som er avgjørende for tumorvekst og fraværende i sunn livmorhalsen, er det første skrittet mot utvikling av konkrete mål legemidler for behandling av CC.
hemming av mitose er en velkjent strategi for å bekjempe kreft [19, 20]. Legemidler som inhiberer prosessen med celledeling er vanligvis effektive som anticancermidler. De taxaner og vinca-alkaloider, som hemmer dannelsen av den mitotiske spindel, er velkjente eksempler på slike medikamenter. Imidlertid er deres effektivitet begrenset, fordi de også påvirker mikrotubul nettverk av celler som ikke deler seg å påvirke endotel-funksjoner, og fremstilling av nevrotoksiske effekter.
I et tidligere arbeid har vi vist at genet «cyklin-avhengig kinase inhibitor 3 «(
CDKN3
), som er involvert i mitose, er oppregulert i CC i forhold til at det i normal cervical epitel. Videre i en foreløpig 3,5-års overlevelse analyse, inkludert et lite utvalg av CC pasienter (n = 42) positive for HPV16, høy uttrykk nivåer av
CDKN3
har blitt funnet i forbindelse med en kortere pasient overlevelse [21 ]. Disse dataene tyder på at
CDKN3
kan være involvert i tumorprogresjon, i det minste i CC positiv for HPV16. Det er ikke kjent hvorvidt over uttrykk for
CDKN3
er også assosiert med en overlevelse nedgang i CC pasienter positive for andre enn HPV16 HPV.
For å demonstrere entydig om overekspresjon av
CDKN3
er assosiert med redusert overlevelsestid i CC pasienter, ble en 5 års overlevelse analyse utført på en større prøve (n = 121). Dette inkluderte en gruppe pasienter som var positive for andre formål enn HPV16 HPV og en større gruppe av HPV16-positive pasienter. Videre, for å undersøke hvorvidt
CDKN3
er involvert i kreftutvikling prosessen, analyserte vi effekten av inhibering av
CDKN3
genekspresjonen på proliferasjon, migrering og invasjon av cellelinjer avledet fra HPV16 -positive (Siha og CaSki) og HPV18-positive (HeLa) CCs.
Metoder
Pasient utvalg, studiedesign, og endepunkter
forsøks~~POS=TRUNC inkluderte 134 pasienter diagnostisert med CC ved Institutt for Oncology og 25 kvinner med normale livmorhals epitel (eksperimentelle kontroller) evaluert ved Institutt for obstetrikk og gynekologi ved Hospital General de México i Mexico City. CC prøvene var en undergruppe valgt fra totalt 462 pasienter med CC som ble rekruttert med følgende inklusjonskriterier: klinisk diagnose av invasiv CC ved Onkologisk avdeling, ingen tidligere behandlinger, og er født og bosatt i Mexico med en meksikansk avstamning kommer tilbake to generasjoner. Pasienter som oppfylte inklusjonskriteriene ble deretter rekruttert i perioder fra november 2003 til april 2005 og januar 2006 til juli 2007, og representerte ca 80% av pasientene diagnostisert med CC i denne perioden. Utvalgskriteriene for CC undergruppe var basert på tilgjengeligheten av høy kvalitet RNA ekstrahert fra frisk svulst biopsi med mer enn 70% tumorceller i morfologisk analyse og virustypen positivitet av svulster. Basert på kvaliteten av RNA, ble de fleste tilfeller (88%) valgt i løpet av den andre perioden rekrutteringen. CCs inkludert 90 prøver positive for HPV16 (42 tidligere rapportert [21], som ble oppdatert med de 5-års overlevelsesdata, og 48 nye prøvene analysert for denne rapporten) og 44 positive for andre HPV-typer: 18, 31, 33, 35 , 45, 51, 52, 53, 58, 59, og 68. kvinnene i denne rapporten var sammenlignbare med de som er unntatt basert på alder (gjennomsnitt = 50 år), rase /etnisitet, histologi, og tumorstadium. Frekvensen av HPV-typer i denne undergruppen var ikke sammenlignes med frekvensen i hele prøven [13], ettersom en høyere andel av HPV16-positive tumorer ble valgt. Svulstene av CC pasienter ble iscenesatt i henhold til Fédération Internationale de Gynécologie Obstétrique (FIGO) [22]. To biopsiprøver ble tatt fra svulstene under colposcopy eksamen. En prøve ble delt i to like deler: en del ble fiksert i bufret formalin for morfologisk analyse og den andre delen, sammen med den andre biopsiprøve, ble hurtigfrosset på tørris og lagret ved -80 ° C inntil analyse. Kontrolllivmorhalsprøver ble innhentet fra pasienter som gjennomgår hysterektomi grunn myomatosis. Løpet og gjennomsnittsalder (49 år) av disse pasientene var lik som pasienter med CC. De ble tidligere diagnostisert med en normal cervix ved cytologi og kolposkopi. Umiddelbart etter å ha mottatt en cervical fragment fra operasjonsstuen, dissekert vi exocervical epitheliums under et stereoskopisk mikroskop for å unngå stromale celler. Bare fire prøver (16%) var positivt for HPV, men signalene var svakt. Det primære endepunktet var 5-års overlevelse. Studien protokollen ble godkjent av vitenskaps og etiske komiteer av Hospital General de Mexico (godkjenningsnummer DIC /03/311/04/051) og informert skriftlig samtykke ble innhentet fra alle deltakerne før deres inkludering.
DNA og RNA isolering
DNA ble renset fra biopsiprøver ved bruk av en PureLink Genomisk DNA Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og holdt ved -20 ° C inntil analyse. Total RNA ble isolert fra halvdel av den delte biopsi ved hjelp av TRIzol reagens (Invitrogen) i følge produsentens protokoll. Kvaliteten på RNA ble bekreftet med agarosegel-elektroforese, som demonstrert ved tilstedeværelsen av intakt ribosomalt RNA, med 28S bandet dobbelt så intens som den 18S bandet.
Detection og HPV skrive
HPV testing ble utført ved PCR ved bruk universelle primere som ligger i HPV L1 gener
MY09 Twitter /
MY11
,
GP5 + Twitter /
6+
, og
L1C1
, som beskrevet tidligere [23-25].
HBB
genet ble brukt som en intern kontroll for å vurdere kvaliteten på DNA. De HPV-typer ble identifisert ved sekvensering av forsterkede band ved hjelp av fluorescerende syklus-sekvenseringsmetode (BigDye Terminator Klar Reaction Kit, Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Sekvensanalyse ble utført ved hjelp av en ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer system (Applied Biosystems). Hvert bånd sekvensert ble analysert med FASTA sekvenslikhet verktøy [13, 26]. Den gjennomsnittlige identitet andel av HPV-typer oppdaget var 98,7% sammenlignet med referansesekvenser.
Måling av
CDKN3
genuttrykk bruker kvantitativ real-time revers transkripsjon polymerase chain reaction (QRT-PCR)
Revers transkripsjon av total RNA ble utført ved hjelp av High-Capacity cDNA Arkiv kit (Applied Biosystems) i et totalt volum på 20 mL. Blandingen inkludert 2 mikrogram av RNA, 2 mL av 10 × RT buffer, 0,8 pl 100 mM dNTP, 2 mL av 10 × RT Tilfeldige Grunning, 1 mL av MultiScribe
TM revers transkriptase (5 U /mL), og 1 mL av RNase inhibitor (2 U /mL). Reaksjoner ble inkubert ved 37 ° C i 120 minutter, og deretter lagret ved -20 ° C.
CDKN3
genekspresjon ble målt i 134 CC og 25 friske cervical Epitel kontrollprøver av revers transkripsjon-kvantitativ PCR (RT-qPCR) bruker TaqMan prober.
GAPDH
ble brukt som intern kontroll. TAQMAN genekspresjon analysene ble brukt (
CDKN3
, Hs00193192_m1;
GAPDH
, Hs02758991_g1, Applied Biosystems). Eksperimentene ble utført i triplikat i et endelig volum på 20 ul, inkludert 200 ng av cDNA-templat, 10 ul av 2 x TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), 1 ul 20 x TaqMan Gene Expression Assay, og 7 ul RNase-fritt vann. Den sykkel program ble kjørt i en Rotor-Gene (Corbett Research, Sydney, Australia), som ble satt som følger: en innledende PCR aktiveringstrinn ved 50 ° C i 2 minutter etterfulgt av 95 ° C i 10 minutter, og deretter 40 sykluser som smelter ved 95 ° C i 15 s og gløding /forlengelse ved 60 ° C i 1 min. Måling av genekspresjon var basert på relative standardkurver konstruert av et 10-ganger seriefortynnet basseng av CC cDNA som strekker seg 500 til 0,05 ng. Ekspresjonen av
CDKN3
genet ble normalisert i hver tumor og kontrollprøve til intensiteten av det indre referanse (
GAPDH
) ved anvendelse av en tidligere beskrevet metode [21]. De normaliserte intensitetsverdier ble målt i ng /mL. En normalitet test (Shapiro-Wilk) ble utført for å teste for en normalfordeling av genuttrykk data. Fold-change-ekspresjon ble beregnet ved å dividere den midlere normaliserte intensiteten for hver tumorprøve ved median normaliserte intensiteten til kontrollprøvene. Den statistiske signifikans mellom medianer av svulster og kontroller ble beregnet med Mann-Whitney (MW) ikke-parametrisk test.
Identifikasjon av
CDKN3
RNA-varianter ved hjelp av RT-PCR og DNA-sekvensering
CDKN3
RNA-varianter ble bestemt i cDNA av 45 tumorer, 22 normal cervikal epitel, og tre cellelinjer (CaSki, Hela, og Siha) ved hjelp av RT-PCR. Primerne benyttet for RT-PCR ble tidligere beskrevet [27] eller utformet i henhold til publisert varianter sekvenser [28] (S1 tabell). PCR-produktene ble analysert ved hjelp av agarosegel-elektroforese, og sekvensert ved anvendelse av fluorescerende syklus-sekvenseringsmetode (BigDye Terminator Ready Reaction Kit; Applied Biosystems). Sekvensanalyse ble utført ved hjelp av en ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer system (Applied Biosystems). Sekvensene ble analysert med FASTA sekvenslikhet verktøy [13, 26], SeqScape programvare (Applied Biosystems), og ClustalW2 justeringsverktøy (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/).
Survival analyse
Ifølge FIGO iscenesette pasienter med livmorhalskreft fått individuell behandling basert på retningslinjer for behandling for livmorhalskreft av American Cancer Society (S2 tabell). Etter at behandlingen var ferdig, ble hver pasient klinisk evaluert for hver 1, 3 eller 6 måneder ved en erfaren onkolog. Kliniske data fra oppfølgingsstudie ble hentet fra pasientenes journal. Også en sosialarbeider utføres telefonsamtaler og hjemmebesøk til pasienter hver 6. måned i løpet av studien. Bare 121 av 134 pasienter undersøkt med QRT-PCR ble inkludert i oppfølgingsstudie, og inkluderte 83 prøver positive for HPV16 og 38 prøver positive for andre HPV-typer, inkludert HPV18, 31, 33, 35, 45, 51, 52, 53, 58, 59 og 68. overlevelse analyse ble utført på alle pasienter som fikk behandling og ble fulgt opp i minst 10 måneder. De som er merket med en stjerne i tabell S2 fikk ikke behandling (n = 8) eller gikk tapt i løpet av oppfølgingen i de første 10 måneder (n = 5). Median følgende tids av de 121 pasientene var 64 måneder etter innledende diagnose. Status i live ble registrert i siste oppfølging, død ble forårsaket av primærtumor av livmorhalskreft, bortsett fra saken er merket med en dobbel stjerne i S2 Table (R221), og ukjente saker ble henvist til de pasientene vi mistet oversikten over sin status før 60 måneders oppfølging (R251, R278, R289 og R379). Disse tapte tilfeller og pasienten døde fra andre enn livmorhalskreft (R221) årsaker ble utpekt som sensurert. Sensurert og avdøde pasienter ble fulgt opp for antall måneder som er angitt i S2 tabell. Pasienter ble ansett som tapt når ikke delta på medisinsk avtaler for sykdomskontroll, ikke ble funnet på hjemmebesøk eller ikke svare på telefonsamtaler. Dødsårsaken av alle pasientene i løpet av oppfølgingen ble bekreftet av den medisinske posten og dødsattesten. Foreningen av FIGO, HPV-type og
CDKN3
uttrykk med overlevelse ble undersøkt av overlevelsesanalyse (se nedenfor i den delen av statistisk analyse).
Cellelinjer
CC cellelinjer positive for HPV16 (CaSki, Siha) og HPV18 (HeLa) ble gitt av Dr. JC Gomora fra Institutt for biofysikk av IFC-UNAM, Mexico by. Cellene ble dyrket med Dulbeccos modifiserte Eagle Medium (Gibco® DMEM Cat: 12100-038, Life Technologies, Grand Island, NY) supplert med føtalt bovint serum (Gibco® Cat: 16000-044, Life Technologies) og antibiotika-antimycotic løsning ( Gibco® Cat: 15240-062, Life Technologies) ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator. Cellelinjer ble godkjent av kort tandem repeat profilering før forsøkene (data ikke vist).
Transfeksjon av siRNAs
Forsøkene ble gjentatt to ganger i tre eksemplarer. Totalt 2 x 10
5-celler ble sådd ut i hver brønn av en tolv-brønns plate og dyrket til 60-80% konfluens før transfeksjon. Cellene ble transfektert med en blanding av tre spesifikke siRNAs mot
CDKN3 product: (
CDKN3
siRNA, SC-43877) eller kontroll sirnas som inneholder tre egge sekvenser som ikke vil føre til den spesifikke nedbrytning av noe vet cellulær mRNA (kontroll siRNA-A, sc-37007), ved hjelp av siRNA Transfeksjon Reagens (sc-29528) i henhold til produsentens instruksjoner (alle regenter fra Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA). Forskjellige konsentrasjoner av sirnas ble undersøkt (80, 100, og 120 nM) for å undersøke den passende konsentrasjon for å inhibere
CDKN3
mRNA i cellelinjene, inkubere cellene 48 timer etter transfeksjon.
CDKN3
genekspresjon nivået ble målt ved hjelp av RT-qPCR som beskrevet ovenfor.
Immunofluorescence farving
CDKN3 protein-ekspresjon ble bestemt i de tre cellelinjene transfektert med den spesifikke
CDKN3
eller egge sirnas ved immunfluorescens. Transfekterte celler ble dyrket på dekkglass direkte avsatt i platebrønner. -Celler dyrket 96 timer etter transfeksjon ble løst i absolutt etanol i 20 minutter ved -20 ° C. Deretter ble en oppløsning inneholdende 5% bovint serumalbumin i PBS og 0,05% Triton X-100 for celle permeabiliseringen ble tilsatt og inkubert i 30 min. (. Cat 118702; Abcam Biochemicals, Cambridge, MA) den primært kanin-polyklonalt antistoff mot CDKN3, oppnådd fra Abcam, ble fortynnet 1: 200 i 5% bovint serumalbumin i PBS og 0,05% Triton X-100. Et totalt volum på 20 ul ble tilsatt til hver dekkglass, som ble inkubert over natten ved 4 ° C i et fuktig kammer. Etter vasking med PBS, ble antigen-antistoffkompleksene påvist ved å inkubere Dekkglass med 20 ul anti-kanin FITC-konjugert sekundært antistoff (1: 100; ZyMax
TM, Life Technologies Jackson Labs) i 2 timer ved romtemperatur. Cellekjerner ble motfarget med DAPI [4 «, 6-diamidino-2-fenylindol-dihydroklorid] (1: 1000; Invitrogen). Analyser ble utført in triplo. Som vi har rapportert tidligere [21], i vev lysbilder av normal cervical epitel, dette CDKN3 detection system, som involverer primære og sekundære antistoffer, ikke gi noe signal (data ikke vist). Tilsvarende, i cellelinje-forsøk benyttet for å teste spesifisiteten av det system, i hvilket det primære antistoff ikke ble inkludert, deteksjonssystemet ga ikke noe signal (S1 Fig). Disse dataene indikerer at systemet vårt er spesifikk for CDKN3 protein deteksjon. Bilder ble sett ved 60 × forstørrelse ved hjelp av en confocal Olympus fluorescens mikroskop (Olympus FV1000, Center Valley, PA), og digitale bilder ble kjøpt med en CCD-kamera. Den grønne fluorescens intensitet ble kvantifisert i 140 innen hvert eksperiment ved hjelp ImageJ programvare [29].
Immunohistochemistry (IH)
protein uttrykk for CDKN3 ble bestemt i 37 CC (22 og 15 positive for HPV16 og andre HPV, henholdsvis) og 21 kontrollprøver ved hjelp av immunhistokjemi (IH). Fem microarray (TMA) ble bygget med hver inneholder 10-12 CCs og 4-5 kontroller. Analysen ble utført som tidligere beskrevet [21]. I korte trekk, ble TMA deparaffinized i xylen, og deretter rehydrert sekvensielt med graderte konsentrasjoner av alkohol. Det primære antistoff mot CDKN3 (sc-475, 1: 100) ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Antigen-antistoff-kompleksene ble påvist ved anvendelse av avidin-biotin-peroksidase-metoden, med 3,3′-diaminobenzidin-tetrahydrocloride som et kromogent substrat (. Cat KO679 LSAB + Sys /HRP; Dako-Cytomation Carpinteria, CA, USA) og ble seksjonene kontra med hematoksylin. Analyser ble utført in triplo. Den cellulære lokalisering av immunoreaksjonen ble identifisert, og intensiteten ble scoret 0-4, hvor 0 indikerte ingen farging og 4 den mest intense farging.
Western blotting
CDKN3 proteinekspresjon ble bestemt ved anvendelse av western blotting i de tre cellelinjer transfektert med den spesifikke CDKN3 eller egge sirnas. Proteiner ble oppnådd i radioimmunopresipitasjonsanalyse assay (RIPA) lysereagensen (Cat: 89900, Life Technologies). Proteininnholdet av hvert lysat ble bestemt ved hjelp av en Bradford proteinanalyse (Cat: B6916, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) med bovint serumalbumin (BSA) som en standard. En 50 ug prøve av hvert lysat ble løst i 12% denaturerende polyakrylamidgeler (med 5% polyakrylamid gel stabling) og overført elektroforetisk til en nitrocellulosemembran. Etter blokkering med 5% fettfri tørrmelk i Tris-bufret saltvann plus Tween (TBST), ble membranen inkubert med et kanin polyklonalt antihuman CDKN3 antistoff (sc-475 Santa Cruz Biotechnology, Inc.) og et muse-monoklonalt anti-humant antistoff aktin (i monoklonalt anti-aktin antistoff ble velvillig donert av Manuel Hernámdez, Ph.D, CINVESTAV) over natten ved 4 ° C. Membranen ble deretter inkubert med pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundære antistoffer (GE Healthcare Bio-fag) i 1 time ved romtemperatur. Etter vask med TBST ble immunreaktive proteiner utviklet ved hjelp av forbedret chemiluminescence kit (GE Healthcare Bio-Sciences).
spredningsanalyse
Forsøkene ble gjentatt to ganger i tre eksemplarer. Celler transfektert enten med de spesifikke sirnas mot
CDKN3
mRNA eller styre sirnas ble sådd ut i hver brønn av tjuefire-brønners plater og høstet ved 24, 48, 72 og 96 timer etter transfeksjon. Celleproliferasjon ble målt med en kolo metode basert på konvertering av tetrazoliumsalter til formazanforbindelsen av dehydrogenase aktivitet i aktiv mitokondriene (Vybrant
® MTT Cell Proliferation Assay Kit, V-13154, Life Technologies). I korthet, etter å ha erstattet kulturmediet med 400 ul friskt kulturmedium (Gibco ® DMEM uten fenolrød, Life Technologies), 20 ul av MTT (3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-difenyltetrazoliumbromid ) oppløsning ble tilsatt i hver brønn, også negative kontroller uten celler. Cellene ble inkubert ved 37 ° C i 3 timer, deretter alle av kulturmediet ble fjernet og erstattet med 350μl av dimetylsulfoksyd (DMSO), blandet forsiktig og inkuber ved 37 ° C i 10 min. Platene ble avlest med et spektrofotometer ved 560 nm (BioPhotometer Eppendorf). Cellevekst følger en eksponentiell trend spådd av ligningen y
t = y
0 * e
rx, hvor y
t = absorbans ved bestemt tidspunkt, x = inkubasjonstid i timer, y
0 = en konstant absorbans ved tid = 0 og r = hastighet vekst. Celle doblingstid (Td) ble beregnet i henhold til to forskjellige fremgangsmåter: 1) formelen: Td = (t
2-t
1) x [log2 /(log y
t2-log y
t1)], hvor y
t1 er absorbansen ved t
1 (24 t), y
t2 er absorbansen ved t
2 (96 h), og 2) med formel Td = ln (2) /r. Effekten på dobbeltarbeid ble beregnet ved å dele doblingstiden for de transfekterte celler med bestemte sirnas mot
CDKN3
av doblingstiden for de transfekterte cellene med egge siRNAs.
Invasion og migrasjon analyser
eksperimentene ble gjentatt to ganger i tre eksemplarer. Invasion analysen ble gjort i en 24-brønns transwell kammer (BD BioCoat ™ Matrigel ™ Invasion Chamber # 354480; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Celler suspendert i 250 ul serumfritt medium (5,0 x 10
4 celler) ble tilsatt til Matrigel-belagte filtre i triplikate brønner. I det nedre kammeret av kamrene 500 mL av storfe-foster-serum-kondisjonert medium ble brukt som cellegift tiltrekkende. Etter 48 timers inkubering ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator, celler som invaderte gjennom filtrene ble samlet opp fra det nedre rom og farget med MTT kolorimetrisk analyse som beskrevet ovenfor. Migrasjonen Analysen ble utført med en lignende fremgangsmåte. Celler ble lastet på Transwell polykarbonat membran inserts (BD BioCoat ™ Control Setter 24-vel, Cat # 354578; Becton Dickinson) i tre eksemplarer brønner. Platene ble inkubert i 22 timer ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator. Cellene som hadde migrert til den nedre kammer av kamrene ble samlet og farget med MTT kolo analysen beskrevet ovenfor.
Statistisk analyse
Den statistiske signifikans av forskjeller i
CDKN3
uttrykket mellom tumorer og kontroller ble beregnet med Mann-Whitney (MW) ikke-parametriske test. Receiver Operator Karakteristisk (ROC) kurve analyse ble utført og Youden indeksen ble brukt [21] for å velge de beste loddepunkter for å skille svulster fra død og levende pasienter i de tilfeldige utvalgte treningssett, ved hjelp av FC uttrykk verdier av
CDKN3
genet oppnådd ved RT-qPCR. I korte trekk, med hele prøvesett, 500 treningssett av 60 prøver ble tilfeldig opprettet. Å kategorisere
CDKN3
genuttrykk data kvantifiseres ved QRT-PCR ble utført ROC analyse i hvert treningssett. Denne analysen ble gjort for å sette en cut-off for genekspresjon som representerte disse verdiene med høyest sensitivitet og spesifisitet for å differensiere mellom døde og overlevende pasienter. Hele Prøvesettet ble deretter analysert med gjennomsnittlig cut-off, beregnet fra verdiene for de 500 treningssett. Prøver med
CDKN3
genekspresjon verdier lik eller over cut-off ble satt til 1 og de med verdier under cut-off ble satt til 0.
Akkumulert total overlevelse tid ble beregnet av Kaplan-Meier metoden og analysert av log-rank test. FIGO iscenesettelse,
CDKN3
genekspresjon og HPV-type ble inkludert i univariate og multivariable Cox regresjonsmodeller. Den statistiske signifikans mellom de gjennomsnittlige forskjellene i cellelinjer eksperimenter ble beregnet med t-test. Alle testene var 2-sidig, og p-verdier mindre enn 0,05 ble betraktet som statistisk signifikant. Dataanalyse ble utført ved hjelp av Sigma Stat og SPSS ver. 17 programvare.
Resultater
CDKN3
genuttrykk i livmorhalskreft
Boksplott (fig 1A) viser tydelig at
CDKN3
uttrykket var signifikant høyere i CC enn i friske vev i livmor (FC = 6,4, p = 8 x 10
-6, MW test). Dessuten, når kreft prøver ble gruppert i henhold til HPV16 status, en forskjell i uttrykk, sammenlignet med kontrollgruppen, ble opprettholdt i både CC positive for HPV16 (FC = 6,6; p = 8 x 10
-5, MW) og CC positive for andre HPV-typer (FC = 5; p = 8 x 10
-6, MW) (fig 1A). Selv
CDKN3
ekspresjon ble funnet å bli nedregulert (FC mindre enn 1), eller FC-verdien var lik eller mindre enn 1,5 på 10,4% (n = 14) av tumorer, hovedsakelig fra tumorene positive for HPV-typer annet enn HPV16 (p 0,05, Chi-kvadrat test; figur 1B), disse dataene støtter konklusjonen om at
CDKN3
uttrykk ble økt i de fleste CC uavhengig av HPV type
uttrykk. av cyklin-avhengig kinase inhibitor 3 (
CDKN3
) ble målt ved hjelp av RT-qPCR i 25 normale, friske livmorhalsen prøver og 134 livmorhalskreft (CC) prøver som var positive for humant papillomavirus (HPV) 16 (n = 90) eller for andre HPV-typer (n = 44), inkludert 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52, 53, 58, 59, og 68. (A) Intensitet av genekspresjon, uttrykt i log2 verdier, i boksplott . De øvre og nedre grense for boksene representerer 75-og 25. percentil, henholdsvis. Den svarte og stiplede linjer i boksene representerer median og middelverdier, henholdsvis, og værhårene representerer minimums- og maksimumsverdiene som ligger innenfor 1,5x det interkvartile området fra slutten av boksen. Verdier utenfor dette området er representert med svarte sirkler. Folden endring (FC) ble beregnet ved å dividere den midlere av hver CC gruppe ved medianen for kontrollgruppen. Statistiske forskjeller mellom gruppene ble beregnet ved hjelp av parametriske Mann-Whitney U test. (B) Frekvens (%) fordeling av
CDKN3
FCS, som ble beregnet i hver svulst vurderer median kontrollgruppen.
Association of
CDKN3
genuttrykk, klinisk stadium og viral type med overlevelse
Vi undersøkte om oppregulering av
CDKN3
ble assosiert med redusert overlevelse i 121 CC pasienter, og om noen effekt på overlevelse var avhengig av klinisk stadium og HPV type. Å etablere en skillelinje mellom døde og levende pasienter og den potensielle verdien av
CDKN3
uttrykk som en markør for å overleve, en gjennomsnittlig cut-off FC ble beregnet ved hjelp av ROC-kurver (se Materiale og metode). Den gjennomsnittlige cut-off oppnådd var FC = 17. Av de 121 prøvene, 83 var positive for HPV 16 og 38 for andre HPV-typer (S2 Table). Median tid oppfølgingstid var 64 måneder fra den opprinnelige diagnosen. Kliniske faser (Figo) av de 121 pasientene var IA1 (n = 1), IB1 (n = 35), IB2 (n = 29), IIA (n = 7), IIB (n = 35), IIIB (n = 9 ), og IV (n = 5). Den totale overlevelsen av alle pasienter var 71,9% og for Figo kliniske faser IA1 /IB1, IB2, IIA, IIB, IIIB og IV var 94,4%, 79,3%, 57,1%, 57,1%, 55,6% og 20%, respektivt. Disse forskjellene var statistisk signifikant (p = 1,2 x 10
-6, log-rank test, S2A figur).
Pasientene med høy uttrykk for
CDKN3
genet (FC ≥ 17
