Abstract
Bakgrunn
mikroRNA (miRNA) er en voksende underklasse av små ikke-kodende RNA som regulerer genekspresjon og har en sentral rolle i mange fysiologiske prosesser, inkludert kreftutvikling. Nylige rapporter avdekket rolle mirnas som ideelle biomarkører og terapeutiske mål på grunn av deres vevs- eller sykdomsspesifikke natur. Hode- og halskreft (HNC) er en viktig årsak til kreftrelatert dødelighet og sykelighet, og strupekreft har høyest forekomst i den. Men de molekylære mekanismene som er involvert i strupekreft utvikling gjenstår å bli kjent og svært sensitive biomarkører og romanen lovende terapi er nødvendig.
Metodikk /hovedfunnene
For å utforske strupekreft-spesifikke miRNAs, RNA fra 5 strupehodet kirurgiske prøver inkludert kreft og ikke-kreft vev ble hybridisert til microarray frakte 723 mennesker miRNAs. De resulterende forskjellig uttrykt mirnas ble videre testet ved hjelp av kvantitativ real time PCR (QRT-PCR) på 43 laryngeal vevsprøver inkludert kreft, noncancerous kolleger, godartede sykdommer og forstadier dysplasier. Betydelige uttrykks forskjeller mellom matchet par ble gjengitt i MIR-133b, MIR-455-5p, og MIR-196a, blant annet MIR-196a som den mest lovende kreft biomarkør som validert av QRT-PCR-analyser på flere 84 vevsprøver. Deep sekvense Analysen avdekket både kvantitative og kvalitative avvik fra Mir-196a isomiR uttrykk i strupekreft. In situ hybridisering bekreftet strupekreft spesifikke uttrykk for MIR-196a i både kreft og kreft stromaceller. Til slutt, hemming av MIR-196a motvirket kreft celle spredning i både strupekreft-deriverte celler og mus xenograft modell.
Konklusjon /Betydning
Vår studie gitt de mulighetene som MIR-196a kan være svært nyttig i diagnostisering og behandling av strupekreft
Citation. Saito K, Inagaki K, Kamimoto T, Ito Y, Sugita T, Nakajo S, et al. (2013) mikroRNA-196a Er en antatt Diagnostic Biomarker og terapeutisk mål for Strupekreft. PLoS ONE åtte (8): e71480. doi: 10,1371 /journal.pone.0071480
Redaktør: Valerie W. Hu, The George Washington University, USA
mottatt: 08.02.2013; Godkjent: 28 juni 2013; Publisert: 14. august 2013
Copyright: © 2013 Saito et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. En del dette arbeidet ble støttet av en Grant for Industrial Technology Research i New Energy and Industrial Technology Development Organization (NEDO; https://www.nedo.go.jp/english/index.html). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser. Selv om noen av forfatterne er ansatt av kommersielle selskaper (Y. Ito, T. sugita, og S. Nakajo av SRL, Inc., T. Ishikura, H. Hanaoka, og T. Onozaki av livet Technologies Japan), har de ingen konkurrerende interesser vedrørende dette arbeidet. Disse ansettelser endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
I 2004 28,260 nye tilfeller av munnhulen og svelget kreft og 20,260 nye tilfeller av strupekreft ble diagnostisert i USA, noe som resulterer i 7,230 og 3,830 dødsfall, henholdsvis [1], [2]. Til tross for betydelige fremskritt innen kirurgi og strålebehandling i løpet av de siste tiårene, har 5-års overlevelse av hode og nakke plateepitelkarsinom (HNSCC) pasienter blitt forbedret bare moderat delvis på grunn av den relativt høye lokale tilbakefall. I dag er lokoregional HNC behandlet med en kombinasjon av kirurgi og bestråling med eller uten kjemoterapi, mens hver behandling alternativ resulterer i alvorlige konsekvenser på tale og svelging funksjon. I tillegg kirurgiske prosedyrer i hodet og nakken og munnhulen region ofte resultere i betydelige kosmetiske misdannelser. Selv med den kombinerte behandlingen tilnærminger nevnt, pasienter med avansert HNC er derfor behov for nye og mindre invasive behandlinger for deres høy sykelighet sykdom. I denne studien, tenker betydelig heterogenitet av HNSCC svulster, har vi fokusert på en enkelt veldefinert anatomisk plassering, strupehodet. Mens strupekreft er svært kureres enten ved kirurgisk fjerning eller bestråling når de blir funnet og behandlet på et tidlig stadium, avansert kreft forblir mye mindre kureres resulterer i ingen signifikant forbedring av samlet overlevelse siden 1975 [3]. Derfor, for å detektere svært følsomme biomarkører strupekreft, selv på et tidlig stadium uten kliniske symptomer, og i betydelig grad effektive nye terapeutiske midler er nødvendige for å ytterligere forbedre pasientens behandling av strupekreft. Videre er dagens metoder for å forutsi utfallet av HNSCC pasientene omfatter undersøkelse ved hjelp av clinicopathological parametere som primærtumor, regional node, fjerntliggende metastaser (TNM) – fasen, dybden av invasjon, og differensiering karakter. Men disse parametrene ikke nøyaktig gjenspeile prognose for pasientene og flere prediktorer og biomarkører vil være nyttig for pasientbehandling. Dermed er molekylær og cellebiologi en lovende fagområde som kan føre til oppdagelsen av nye biomarkører og nye terapeutiske mål.
mikroRNA (miRNA), som koder for en liten ikke-kodende RNA av ~22 nukleotider, er nå anerkjent som en stor familie gen uttrykt i planter, dyr og virus, så vel som i encellede alger [4]. De fleste dyr mirnas er evolusjonært konservert og ofte funnet i klynger [5]. Primære mirnas (pri-mirnas) som utgjør stammeløkkestrukturer er hovedsakelig transkribert ved RNA polymerase II, og blir suksessivt behandlet med to RNase III-lignende enzymer, drosha i cellekjernen og dicer i cellecytoplasmaet, for å generere modne mirnas [6] , [7]. mirnas negativt regulerer genekspresjon på posttranskripsjonelt nivå ved spalting og /eller translasjonsbevegelse undertrykkelse av deres mRNA-mål via interaksjon ved hjelp perfekt baseparing i 5′-enden av det modne miRNA, også betegnet frøet region [8]. Siste bioinformatikk analyser rapportert at over 60% av proteinkodende gener har potensial til å koble til, og for å bli kontrollert av mirnas [9]. Ytterligere undersøkelser har vist at mirnas spiller ekstremt viktige roller i nesten alle aspekter av biologi, inkludert metabolisme, celleproliferasjon, apoptose, differensiering og utvikling [10], [11].
I de senere år har det vært en betydelig interesse for å forstå rollen som mirnas i sykdomsprosesser og deres feilregulering antas å fremme den ondartede svulster oppførselen til [12]. Koblingene mellom avvikende uttrykk for miRNAs og patogenesen av flere krefttyper [12] – [14] er dokumentert
Det har også blitt rapportert at mirnas kan være en ideell biomarkører for kreft påvisning fordi:. (Jeg ) miRNA uttrykk er hyppig dysregulerte i kreft [15], [16], (ii) ekspresjon mønstre av mirnas i kreft hos mennesker synes å være vev-spesifikk [17], og (iii) mirnas har uvanlig høy stabilitet selv i formalinfiksert vev [18]. Videre har nyere omfattende miRNA forskning viser også at mirnas er lovende terapeutiske mål i kreft, inkludert tykktarm, bryst, mage og hepatocellulære maligniteter [19] – [26]
Alle disse spørsmålene er viktige for å gi en dypere. forståelse av rollene mirnas i HNSCC patogenesen og som potensielle prognostiske og diagnostiske markører samt terapeutiske mål i HNSCC. I denne studien, har vi profilert ekspresjonen av 723 unike humane mirnas i 3 laryngeal kreft, 2 noncancerous laryngeal motstykker ved hjelp av oligonukleotid-mikromatriser med en hårnål struktur inkorporeres i 5′-enden av proben [27] fremstilt ved en blekkstråle oligonukleotidsyntesemaskin [28] (Agilent menneskelige miRNA V2, Agilent Technologies) og identifisert flere mirnas som kan tjene som potensielle diagnostiske sykdomsmarkører. Vi ytterligere bekreftet uttrykk for utvalgte mirnas hjelp QRT-PCR (TaqMan® miRNA analyser, Applied Biosystems) i 5 noncancerous kolleger, 14 polypper eller knuter, 12 dysplasier og 17 laryngeal kreft å gi data som tyder på at endrede uttrykk nivåer av miRNAs har en funksjonell konsekvens i strupekreft.
In situ
hybridisering (ISH) ytterligere beviste markant forskjells uttrykk for miRNAs i kreft lesjon i forhold til normal plateepitel epitel.
Vi videre undersøkt effekten av MIR-196a hemming
i
vitro Hotell og
i
vivo
på veksten av HNSCC å vurdere potensialet i miRNA som en roman terapeutisk mål for HNC.
materialer og metoder
Etikk erklæringen
den forskningsprotokoll med denne studien ble godkjent av Institutional Review board av Keio University School of Medicine og Sano Kousei General Hospital. Alle vevsprøver ble tatt i den hensikt diagnostisk biopsi eller behandlinger fra pasienter som gjennomgikk kirurgi etter godkjenning av studien av Institutional Review Board ved Keio University School of Medicine og Sano Kousei General Hospital. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter
Dyrene ble tatt vare på og brukes i henhold til protokoller godkjent av Animal Care og bruk komité Keio University School of Medicine (Permit nummer for denne studien. 10243- (0 )). Alle operasjoner ble utført under tribromoethanol anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
Pasienter og Prøvene
En del av prøven ble behandlet for formalinfiksert og parafininnebygd (FFPE) fremgangsmåte, etterfulgt av rutine patologisk analyse, mens det gjenværende vev ble mettet i RNA
senere
® (Ambion, Foster City, CA) og lagret ved -80 ° C inntil behandling. Alle FFPE- prøver ble gjennomgått av erfarne patologer å bekrefte diagnoser. Pasient egenskaper og patologisk staging er oppsummert i tabell 1.
Reagenser
Med mindre annet er angitt, rutine kjemiske materialer ble hentet fra enten Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO) eller Wako ( Osaka, Japan). MIR-196a inhibitor (HSA-MIR-196a miRIDIAN hårnål Sperre, IH-300529-06) og inhibitor negativ kontroll (kontroll, miRIDIAN mikroRNA hemmer negativ kontroll nr. 1, IN-001005-01) som brukes i denne studien ble kjøpt fra Dharmacon (Lafayette, CO). miRIDIAN hårnål Inhibitor er designet for å inhibere RISC funksjon av målet miRNA med sin dobbeltkjedet region [29]. For
in situ
hybridisering (ISH) av MIR-196a, 3′-DIG-merket låst nukleinsyre-innlemmet miRNA probe (miRCURY LNA ™ mikroRNA Detection Probe, Exiqon, Vedbæk, Danmark) ble brukt i dette studien.
RNA ekstraksjon og Microarray Analyse av miRNA
Total RNA inkludert lav molekylvekt RNA fra vevsprøver og kreftcellelinjer ble isolert ved hjelp av Mirvana ™ miRNA Isolation Kit (Ambion) ifølge produsentens instruksjoner. Kvaliteten på RNA prøver ble vurdert ved hjelp av en Agilent 2100 Bioanalyzer, og bare de prøvene som oppfyller kriteriene for 28S /18S 1 og RNA Integrity Number (RIN) ≥7.5 ble brukt for alle analyser
For. microarray analyse, brukte vi den menneskelige miRNA Microarray Kit V2 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), som inneholder 20-40 har rettet mot hver av 723 mennesker mirnas (Agilent motiv ID 019118) [30] som kommenterte i Sanger miRBase, utgivelse 10,1 [31]. Merking og hybridisering av total RNA prøver ble utført i henhold til produsentens protokoll. Ett hundre ng av total-RNA ble anvendt som et inngangssignal inn i merkingsreaksjonen, og hele reaksjonsblandingen ble hybridisert til hver matrise i 20 timer ved 55 ° C. Resultatene ble analysert ved hjelp av Agilent GeneSpring GX7.3. Normale kontroller og kreftprøvene ble sammenlignet ved bruk av Welch t-test (p 0,05) og differensielt uttrykte mirnas med minst en to-gangers forandring i ekspresjon ble ansett for å være potensielle biomarkører. Alle interne data for microarray analyse av miRNAs ble avsatt i Gene Expression Omnibus (GEO) med en tiltredelse antall GSE47610.
TaqMan® Kvantitativ Real-Time PCR-analyse av miRNAs
uttrykk nivåer av hver miRNA ble bekreftet med TaqMan® Kvantitativ real-Time PCR (QRT-PCR) analyse ved hjelp av individuelle spesifikke primere og prober i henhold til produsentens instruksjoner (Applied Biosystems, Foster City, CA). I korthet ble 10 ng av total RNA ble revers transkribert med miRNA-spesifikk stem-loop-primere (Applied Biosystems), og PCR ble utført med den genererte RNA-spesifikke cDNA i genspesifikke TaqMan® miRNA real-time PCR assay løsning på en StepOnePlus real-Time PCR System (Applied Biosystems). Reaksjonen ble utført ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 45 sykluser på 95 ° C i 15 s, og 60 ° C i 60 sek. Alle prøvene ble målt i tre eksemplarer, inkludert templat-kontroller. Normalisering ble utført med den lille kjernefysiske RNA U6 (RNU6B, Applied Biosystems) og relative uttrykk ble beregnet ved hjelp av sammenlignende Ct (Cycle terskel) -metoden. Statistiske analyser ble utført med paret t-test for å sammenligne uttrykk nivåer i matchede par og Tukey-Kramer test for å sammenligne uttrykket nivåer mellom flere sykdommer og videre analyser ble utført ved parvis Mann-Whitneys U-test. Signifikansnivået ble satt til p. 0,05
Next Generation Sequencing av miRNAs
Neste generasjons sekvensering analyse ble utført ved hjelp av Applied Biosystems solid ™ systemet og solid ™ små RNA Expression Kit ifølge solid ™ System 3 Brukerhåndbok (Applied Biosystems). Prosentandelen av små RNA pr total RNA massen ble beregnet ved Agilent 2100 Bioanalyzer. Den lille RNA innholdet ble beriket hjelp flashPAGE ™ fraksjone (Ambion) hvis nødvendig. De små RNA arter (10-40 NT) ble deretter konvertert til cDNA bibliotek ved hjelp av solid ™ små RNA Expression Kit (Applied Biosystems), fulgt av opprydding og størrelse utvalg av PAGE rundt ~105-150 bp. Klonal forsterkning på perler med emulsjon PCR ble utført ved hjelp av solid ™ ePCR kit. Preparerte perler ble utsatt for kvalitetssjekk løp og ble deretter sekvensert på solid ™ 3 Analyzer. Totalt 11,6 til 35900000 sekvens leser innhentet fra hvert enkelt bibliotek og nedstrøms analyse ble utført ved hjelp av rørledning Solid ™ System små RNA-analyse Pipeline Tool (corona RNA2MAP versjon 0.50). Alt lesninger ble kartlagt sekvensielt mot (1) ribosomalt RNA og overføring RNA, (2) kjente referanse sekvenser av mirnas i Sanger miRBase Slipp 18, (3) hg19 human referanse genom sammenstilling (Genome Referanse Consortium GRCh37) så vel som human mitokondrie genome ( NC_001807.4). Summen av antall korte lesninger som tilordnes til hver region av interesse ble normalisert til den totale referanse-kartlagt kort leser i hvert bibliotek prøve, og anvendes som rå uttrykk verdier av den tilsvarende regionen. Bevaring og gjenta informasjonen ble innhentet ved hjelp av University of California Santa Cruz tabellen nettleser. Analyserte prøvene inkluderer 2 strupehodet kreft (T416, 66 yo mannlige, T3N0, T506, 74 yo mannlige, T3N2c) som avanserte kreftprøver og 3 strupehodet papillomer (T421, 33 yo mannlige, voksen debut, T484, 33 yo mannlige, voksen utbruddet; T502, 38 yo mann, voksen angrep) som ikke-kreftprøver. Alle interne data for neste generasjons sekvensering av miRNAs ble avsatt i DDBJ Sequence Les Archive (SRA) med en tiltredelse antall PRJDB994.
In situ
Hybridisering for MIR-196a
in situ
påvisning ble utført på serie 4-mikrometer parafinsnitt inkludert normal slimhinne og strupekreft materiale av en 74 yo mannlig pasient som gjennomgikk total laryngectomy for fullstendig fjerning av den avanserte T3 tumor. Snittene ble deparaffinized og deretter fordøyet med proteinase K (10 pg /ml) i 5 minutter ved 37 ° C. Etter proteinase K-fordøyelse, ble seksjonene fiksert i 4% paraformaldehyd, og objektglassene ble deretter hybridisert med 4 pmol Exiqon største miRCURY LNA deteksjon probe komplementær til MIR-196a i hybridiseringsbuffer (50% formamid, 5 x SSC, 0,1% Tween, 9.2 mM sitronsyre (pH 6), 50 ug /ml heparin, og 500 ug /ml gjær RNA) over natten ved 50 ° C. En kryptert og en RNU6B sonde (Exiqon) ble også anvendt som negative og positive kontroller, henholdsvis. Deretter, etter inkubasjon med anti-DIG-AP Fab-fragmenter konjugert til alkalisk fosfatase fortynnet 1:50 i blokkeringsløsning (Roche, Basel, Sveits) i 3 timer ved romtemperatur, ble den hybridiserte prober detektert ved å anvende nitro tetrazoliumklorid /5- brom-4-klor-3-indolylfosfat farge substrat (Roche) til skinnene. Lysbilder ble kontra med atom rask rød og analysert ved hjelp av et Nikon ECLIPSE 55i mikroskop.
Cell Kultur og Transfeksjon
hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) cellelinjer, avledet fra tungen (HSC- 2, HSC-3, HSC-4), gingiva (SAS), munnhulen (Ca9-22), strupehode (JHU-011) og farynks (Fadu), ble alle opprettholdt i RPMI-1640 medium supplert med 10% varme -inactivated føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin ved 37 ° C i 5% CO
2.
For transfeksjon assays,-celler ble transfektert med enten MIR-196a-inhibitor eller inhibitor negativ kontroll ved hjelp av Lipofectamine ™ 2000 reagens (Invitrogen, Carlsbad, California) i henhold til produsentens instruksjoner. Den hemmer negativ kontroll ble basert på C. elegans miRNA og tilsvarer cel-MIR-239b. Kontrollen har blitt analysert ved BLAST mot alle menneskelige, mus og rotte genomiske sekvenser og miRNA sekvenser i miRBase sekvens database. Dette molekylet har identisk utforming og modifikasjoner som miRIDIAN mikroRNA inhibitorer som er kjent for å målrette mRNA. Hvert forsøk ble utført i triplikat og uavhengig av hverandre minst tre ganger.
celleviabilitet og Cvtotoksisitetsmålinq
JHU-011-celler ble sådd ut i en 24-brønns plate ved en densitet på 2 x 10
4 celler /brønn og sådd i 24 timer. Deretter ble cellene transfektert som beskrevet ovenfor, og celleformering ble bestemt ved direkte celle-telling ved 0, 3 og 5 dager etter transfeksjon. I korthet ble cellene trypsinert og farget med 0,4% trypanblått for å måle omfanget av celledød ved hjelp av Grevinne ™ (Invitrogen). En kjernefysisk kontra hjelp Hoechst 33258 ble også utført for å visualisere levedyktige celler på 3 dager etter transfeksjon.
Videre ble celleviabilitet og cytotoksisitet vurdert av differensial protease aktiviteter ved hjelp MultiTox-Fluor Multiplex Cvtotoksisitetsmålinq (Promega, Fitchburg, WI) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet ble cellene sådd ut i en konsentrasjon på 5 x 10
3 celler /brønn i en 96-brønners plate og transfeksjon prosedyrer ble utført 24 timer etter såing. Deretter ble den levende celle proteaseaktivitet og død celle protease aktivitet målt 3 dager etter transfeksjon ved tilsetning av glycyl-fenylalanyl-aminofluorocoumarin (GF-AFC) eller bis-alanyl-alanyl-pnenylalanyl-rhodamin 110 (bis-AAF-R110) som peptidsubstrater, henholdsvis. Celler ble inkubert i 30 minutter ved 37 ° C og resulterende fluorescens ble målt (levende celle fluorescens 400
Ex /505
Em; dead-celle fluorescens 485
Ex /520
Em) for å oppnå den relative fluorescensen Units (RFU).
Strupekreft kreft~~POS=HEADCOMP xenograft modeller,
Forsøkene ble utført på seks uker gamle BALB /c naken mus nu /nu. Dyrene ble tatt vare på og brukes i henhold til protokoller godkjent av Animal Care og bruk komité Keio University School of Medicine (Tokyo, Japan). Ti mus ble tilfeldig delt i 2 grupper på 5 mus. Effekt av behandling med både tumorer og deres lokoregional lymfeknutemetastase ble undersøkt i hver av de følgende 2 grupper: Gruppe 1, MIR-196a-inhibitor; Gruppe 2, inhibitor negativ kontroll (kontroll). Mus ble bedøvd ved intraperitoneal injeksjon av 5-7 mg tribromoethanol. Ortotopiske xenografttumorer ble etablert rundt halsen på nivået av strupehode ved subkutan injeksjon av 5 × 10
6 JHU-011 celler med en 25 gauge nål. Etter en uke ble tumorene målt i tre dimensjoner ved hjelp av målepunktene, og deretter enten MIR-196a-inhibitor eller kontroll kombinert med AteloGene ™ (Koken, Tokyo, Japan) (1 nmol /200 ul) ble injisert i de subkutane mellomrom rundt svulster. Ytterligere behandlinger ble utført på 13 og 19 dager etter inokulering av tumorceller og periodisk måling av tumoren ble utført inntil 12 uker etter injeksjon. Musene ble avlivet og tumormasser ble høstet, deretter kuttet i 2 deler. Halvparten av hver tumor ble fiksert i 10% nøytral buffret formalin over natten, dehydratisert med trinn-for-trinn etanol, og innstøpt i parafin. Gjenværende halvdel av tumoren ble mettet i RNA
senere
® (Ambion) og lagret ved -80 ° C. Bilaterale cervical lymfeknuter ble høstet, snap-frosset og parafin innebygd. Hematoxylin-eosin-farging ble utført på parafin innleiret prøver for histologiske analyser. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av t-test for å sammenligne den terapeutiske effekten av MIR-196a hemmer mot strupekreft
i
vitro Hotell og
i
vivo
. Signifikansnivået ble satt til p. 0,05
Resultater
Mikromatrise Screening av Altered miRNA uttrykk i Strupekreft
For å identifisere mirnas feilregulert i strupehodet kreft, må vi først undersøkte uttrykk profiler av 723 mennesker modne mirnas i 5 laryngeal vev (3 laryngeal kreft og 2 tilstøtende noncancerous strupehodet kolleger) ved hjelp av mikromatriser. Resultatene viste at 5 mirnas (MIR-130b-5p (tidligere betegnet som MIR-130b *), MIR-196a, MIR-455-3p, MIR-455-5p, og MIR-801) eller 2 mirnas (MIR-133b og MIR-145) var signifikant oppregulert eller nedregulert, henholdsvis i strupehodet kreft (Figur 1a). Interessant, uttrykk nivåer av enten la-7 familie, MIR-15, MIR-16, eller MIR-17-92 klynge, kjent for å være assosiert med ulike andre kreftformer, var ikke åpenbart forskjellig mellom strupekreft vev og andre noncancerous vev (Figur 1B).
datasett blir sammenlignet mellom kreft og tilstøtende noncancerous motstykker, plotting overflod av en gitt miRNA i en datasettet mot den tilsvarende verdi i et annet datasett både på en loggskala. 723 mennesker mirnas ble inkludert i Agilent microarray. (A) Sammenligning mellom normale kontroller og kreftprøver viste oppregulering av 5 mirnas (MIR-130b-5p, MIR-196a, MIR-455-3p, MIR-455-5p, og MIR-801) og ned- regulering av 2 mirnas (MIR-133B og MIR-145). (B) Expression nivåer av la-7 familie, MIR-15, MIR-16, eller MIR-17-92 klynge, kjent for å være involvert i en rekke andre kreftformer, var ikke signifikant forskjellig mellom normale kontroller og kreft (
over høyre panel Hotell og
nedre paneler
). Expression nivåer av 723 menneske mirnas er også vist (
øvre venstre panel
).
Kvantitativ Real-time PCR Validering av miRNA uttrykk i Strupekreft
Neste, for å bekrefte og validere funnene hentet fra vår microarray analyse, utførte vi kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) analyse (TaqMan® mikroRNA analyser, Applied Biosystems) med 5 par primære laryngeal kreft og deres matchet noncancerous vev. Selv om mikromatriseanalyse viste oppregulering av 5 mirnas og nedregulering av 2 mirnas, er MIR-801 nå anses for å være et fragment av U11 spliceosomal RNA og fjernes fra miRBase [31]. MIR-145 ble også utelatt fra videre studier, fordi det har blitt rapportert å være ofte nedregulert i kreftformer hos flere organer, inkludert prostata kreft [32], brystkreft [33], blærekreft, [34], tykktarmskreft [35 ], [36], eggstokk-kreft [37], spiserørskreft [38], lungecancer [39], [40], nasofaryngeal kreft [41], magekreft [42], i tillegg til B-celle-maligniteter [43] og anses å være ikke en skikkelig biomarkør for strupekreft.
MIR-455-5p istedenfor MIR-455-3p ble brukt i videre studier, fordi mirnas 3p og 5p genereres fra begge sider av samme forløper demme å ha lignende sekvenser og fersk rapport antydet potensialet involvering av MIR-455-5p i kreft progresjon [44]. Dermed ble utført QRT-PCR-analyse på rest 4 mirnas (dvs. MIR-130b-5p, MIR-196a, MIR-455-5p, og MIR-133b). Ekspresjonsnivåene av disse mirnas ble sammenlignet mellom 5 cancervev og deres tilstøtende noncancerous vev. Resultatene var i overensstemmelse med de som er oppnådd fra mikromatriseanalyse, spesielt når passet prøvene ble sammenlignet i de samme pasientene (figur 2A og B). Høyere uttrykk nivåer av MIR-130b-5p ble observert hos kreft vev sammenlignet med nabo kontroller i fire av fem par. Videre uttrykk nivåer av MIR-196a og MIR-455-5p var signifikant høyere i kreftvev sammenlignet med nabo kontroller (MIR-196a, p = 0,0460, MIR-455-5p, p = 0,0286) (figur 2A), mens uttrykk nivå av MIR-133b var signifikant lavere hos kreftprøver sammenlignet med kontroller (p = 0,0274) (figur 2B).
Relative uttrykk for strupekreft-forbundet mirnas i 5 sammenkoblede prøvene ble målt ved TaqMan® qRT- PCR-analyse og vist i
forlot paneler
. Uttrykk nivåer i tilstøtende noncancerous kolleger (NCS) i hvert par er satt til å være en i
høyre panel
for tydelig visualisering av vesentlig ganger forskjell i hvert miRNA. Data er uttrykt som middelverdier med standardavvik. (A) oppregulering av 2 mirnas (MIR-196a og MIR-455-5p) ble bekreftet i kreft da 5 kreft ble sammenlignet med sine norsk sokkel. *,
p
0,05. (B) MIR-133b ble nedregulert i kreft i alle 5 matchet par. Det ble ikke observert statistisk signifikante forskjeller i uttrykket nivåer av MIR-196a, MIR-455-5p, og MIR-133b mellom matchet par. *,
p
. 0,05
Dermed av disse 4 miRNAs, 3 mirnas (dvs. MIR-196a, MIR-455-5p og MIR-133b) viste signifikant forskjellige ekspresjonsnivåer i kreftvevet sammenlignet med deres matchede kontroll vev og ytterligere kvantifisering av mirnas ble utført ved å bruke 48 laryngeal prøver. Disse prøvene tatt 5 noncancerous kolleger, 14 godartede lesjoner (polypp, nodule, polypoid, eller hyperkeratose), 12 dysplasier, og 17 laryngeal kreft. Når 48 prøver ble undersøkt, uttrykket nivået av MIR-455-5p var betydelig høyere i kreft sammenlignet med tilstøtende noncancerous kolleger og godartede laryngeal vev (p = 0,0113). Videre uttrykk nivå av MIR-196a var klart høyere i kreftvev sammenlignet med noncancerous andre vev (tilstøtende noncancerous kolleger og godartede laryngeal vev, p = 0,0003, dysplasier, p = 0,0040) (figur 3A). Selv MIR-133b viste signifikant lavere uttrykk nivåer når kreftprøver ble sammenlignet med matchet noncancerous laryngeal vev (figur 2B), uttrykk nivå av denne miRNA var ikke signifikant lavere hos kreftprøver sammenlignet med noncancerous andre vev (noncancerous kolleger og godartede laryngeal vev, p = 0,8353; dysplasier, p = 0,2185) i studien ved hjelp av flere prøver (Figur 3B)
(A) Expression nivåer av MIR-455-5p og MIR-196a ble målt ved TaqMan® QRT-PCR. bruker 48 vevsprøver. Tilstøtende noncancerous vev (noncancerous kolleger, NCS) er vist som åpne firkanter. Betydelig oppregulering av MIR-455-5p ble observert i kreft sammenlignet med norsk sokkel og godartede prøver. Expression nivåer av MIR-196a var signifikant høyere i kreftvev sammenlignet med enten norsk sokkel og godartede prøver eller forstadier dysplasi prøver. Linjene indikerer gjennomsnittsverdien for hver gruppe. *,
p
0,05. (B) Expression nivåer av MIR-133b ble også undersøkt i flere prøver. Selv om forholdsvis lavere ekspresjon ble observert i kreftformer, forskjellene var ikke statistisk signifikant sammenlignet med andre grupper. Linjene indikerer gjennomsnittsverdien for hver gruppe. *,
p
. 0,05
Derfor, for ytterligere å utforske betydningen av MIR-196a som en lovende biomarkør for strupekreft, QRT-PCR analyse av MIR-196a var utført på 84 histologisk verifisert prøver (15 noncancerous kolleger, 24 godartede sykdommer, 18 dysplasier, 27 strupehodet kreft) og 7 HNSCC cellelinjer. Studien viste at ble observert økende tendens av MIR-196a uttrykk nivå når kreftprøver ble sammenlignet med noncancerous kolleger, godartet vev, eller dysplasier (Figur 4A). Uttrykket av MIR-196a i kreft var betydelig høyere enn deres matchede parvise prøver (p = 0,005) og var også tydelig i strupekreft cellelinje JHU-011 celler (data ikke vist). Videre fant vi uttrykket av MIR-196a var betydelig høyere i avansert kreft enn tidlig kreft (p = 0,0045, figur 4B,
venstre panel
), og også i begynnelsen av kreft enn forstadier dysplasi (p = 0,0263; Figur 4B,
Høyre panel
). Sammen med disse funnene, kan MIR-196a være en gunstig markør for strupekreft.
(A) Betydningen av MIR-196a som en lovende biomarkør for strupekreft ble bekreftet av TaqMan® QRT-PCR bruker 84 vev prøver. Analysen omfattet også 7 HNSCC cellelinjer. Noncancerous kolleger (NCS) er vist som åpne firkanter. Linjene indikerer gjennomsnittsverdien for hver gruppe. (B) Expression nivå av MIR-196a var høyere i avansert (T3 og T4) kreft sammenlignet med tidlig kreft (T1 og T2) (
venstre panel
). Videre ble betydelig høyere nivå av MIR-196a uttrykk observert i begynnelsen T1a kreftprøver sammenlignet med forstadier dysplasi prøver (
høyre panel
). Linjene indikerer gjennomsnittsverdien for hver gruppe. *,
p
. 0,05
kvalitativ forskjell fra Mir-196a isomiRs avslørt av Deep Sekvense
Den nylige advent av dyp sekvenseringsteknologi avdekket at det er vanligvis variasjoner i modne miRNA sekvenser som skapt med begrepet «isomiR» [45]. Slike variasjoner er først og fremst forårsaket av en forskyvning av kutteseter når modne mirnas behandles av drosha og dicer, men blir også introdusert av terminal nucleotide tillegg eller intern RNA redigering. Selv om fysiologiske betydninger for mangfoldet av isomiR forbli unnvikende, akkumulerende bevis tyder på at det eksisterer utviklings /vev-spesifikk preferanse i spekteret for isomiRs.
Således, for å utforske det mulig heterogenitet i ekspresjons-profiler av MIR-196a isomiRs mellom strupekreft og ikkekreft-vev, var dypt sekvensanalyse av små RNA gjennomføres ved anvendelse av Applied Biosystems faststoff-system (Kamimoto T et al., manuskript presentert).
