Abstract
Tidlig oppdagelse og behandling er avgjørende for en vellykket utrydding av ulike kreftformer, og utvikling av økonomiske og ikke-invasive nye kreft screening systemer er kritisk. Tidligere rapporter som bruker canine duft påvisning påvist eksistensen av kreftspesifikke lukt. Imidlertid er det vanskelig å innføre tann duft gjenkjennelse i klinisk praksis på grunn av behovet for å opprettholde nøyaktighet. I denne studien har vi utviklet en nematode Scent Detection Test (NSDT) ved hjelp av
Caenorhabditis elegans
å gi en roman svært nøyaktig kreft deteksjon system som er økonomisk, smertefri, rask og praktisk. Vi demonstrerte villtype
C
.
elegans
vises attraktiv kjemotaksien mot menneskelig kreft celle sekreter, kreft vev og urin fra kreftpasienter, men unngikk kontroll urin; parallelt, responsen fra olfactory nevroner av
C
.
elegans
til urin fra kreftpasienter var betydelig sterkere enn å kontrollere urin. I motsetning til dette, ble G-protein α mutanter og lukt neuroner-ablasjon dyr som ikke er tiltrukket av kreftpasient urin, noe som tyder på at
C
.
elegans
sanser lukt i urinen. Vi testet 242 prøver for å måle ytelsen til NSDT, og fant var sensitiviteten 95,8%; Dette er markert høyere enn for andre eksisterende tumor markører. Videre spesifisiteten var 95,0%. Viktigere, denne testen var i stand til å diagnostisere forskjellige krefttyper som ble testet på et tidlig stadium (trinn 0 eller 1). For å konkludere,
C
.
elegans
duft baserte analyser kan gi en ny strategi for å oppdage og studere sykdomsassosierte dufter
Citation. Hirotsu T, Sonoda H, Uozumi T, Shinden Y, Mimori K, Maehara Y , et al. (2015) en svært nøyaktig Inclusive Cancer Screening Test Bruke
Caenorhabditis elegans
Scent Detection. PLoS ONE 10 (3): e0118699. doi: 10,1371 /journal.pone.0118699
Academic Redaktør: Myon-Hee Lee, East Carolina University, USA
mottatt: 26 september 2014; Godkjent: 22 januar 2015; Publisert: 11 mars 2015
Copyright: © 2015 Hirotsu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av en JSP Grant-i-hjelp for unge forskere (A), Grant-i-Aid for Scientific Research (C), Senri life Science Foundation, Inamori Foundation, The Kurata Memorial Hitachi Science and Technology Foundation, The Japan Health Foundation, Mishima Kaiun Memorial Foundation og Kyushu-universitetet tverrfaglige programmer i utdanning og prosjekter i Research Development (Type E-4, 24425). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft er en ledende dødsårsaken i verden, og utgjorde 7,6 millioner dødsfall (rundt 13% av alle dødsfall) i 2008; dette tallet er anslått til å fortsette å stige, med anslagsvis 17 millioner dødsfall i 2030 [1]. Få symptomer er tydelig i tidlig stadium kreft og kreft har ikke raskt forhånd uten å passere gjennom et tidlig stadium. Kreft er langt vanskeligere å behandle som det utvikler seg til et avansert stadium og symptomene blir tydelige. Det er derfor et presserende behov for utvikling av en ny økonomisk og ikke-invasiv screening metode som er i stand til å oppdage tidlig kreft. Det har blitt rapportert at kreft utstråler lukt som kan oppdages med høy nøyaktighet av hunder [2-5] eller mus [6]. Imidlertid er det praktisk å innføre hund duft påvisning i klinisk praksis vanskelig fordi nøyaktigheten er påvirket av hundenes konsentrasjon. Lavere organismer som kan oppdage lukt som slippes ut av kreft med høy nøyaktighet av hunder kan være egnet for utvikling av en teknologi for å detektere luktene som slippes ut av kreft. Nematoder som
Anisakis simplex
kan forårsake mage anisakidosis når mennesker ingest forurenset rå eller kokt fisk, og rapporter om ca 30 pasienter med tidlig stadium magekreft med Anisakis larver knyttet til deres svulster er spesielt provoserende (kasuistikk og gjennomgang av Sonoda, et al., 2014 [7]). Fordi genomet til
Caenorhabditis elegans
koder for minst 1500 spådde G-protein-koblede reseptorer (GPCR), inkludert luktreseptorer [8,9] er målet med denne studien var å bruke
C
.
elegans
å utvikle et system for å detektere dufter slippes ut av kreft. Vi kaller dette «nematode Scent Detection Test» (NSDT).
Materialer og Metoder
Utarbeidelse av dyrkingsmedium fra humane kreftceller og fibroblaster
Den menneskelige kreftcellelinjer SW480, COLO201, COLO205 og nontumorigenic udødelig fibroblast human cellelinje KMST-6 ble hentet fra den japanske Innsamling av forsknings Bioressurser Cell Bank (Tokyo, https://cellbank.nibio.go.jp). Den human-fibroblast-cellelinje CCD-112CoN, som ble avledet fra normal tykktarm vev, ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), og de andre cellelinjer beskrevet nedenfor var fra Celle Resource Centre for Biomedical Research, Institute of Development, aldring og kreft (Tohoku universitet, Sendai, Japan). Alle kreftcellelinjer ble holdt ved konfluens i RPMI 1640, KMST-6-celler ble dyrket i MEM, og CCD-112CoN-celler ble dyrket i EMEM. Alle dyrkningsmedier ble supplert med 10% føtalt bovint serum, og cellene ble opprettholdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% fuktet CO
2. Det klare lag på toppen av mediet ble innhentet og prikket inn analyseplatene for å avgjøre om de induserte en kjemotaktisk respons av
C
.
elegans
.
Kreft og normalt vev prøvetaking
Friske kirurgiske prøver ble innhentet fra pasienter med kolorektal eller magekreft og vedlikeholdes i 10 ml saltvann ved -20 ° C. Den normale vev ble ekstrahert fra den delen som ble skilt fra kreft så mye som mulig i den resekterte organ. Pasientene hadde gjennomgått kirurgi ved Imari Arita Kyoritsu Hospital (Arita, Japan) fra januar til mai 2014.
Pasient og kontrollutvalget givere
Deltakerne fra Imari-Arita Kyoritsu Hospital ble registrert fra 12 oktober 2011 til 4. april 2012 for utvidede analyser og fra 20 september 2012 til 22.mai 2013 begrensede analyser. Det var ingen restriksjoner på mat eller aktiviteter for prøvetaking. Deltakerne ble pålagt å være 20 år gammel. Deltakerne gjennomførte en spørreundersøkelse om hvilke faktorer som kan påvirke de flyktige molekyler i urinen eller serumprøver som alder, fysiske symptomer (f.eks matlyst, tretthet, hodepine, bryst eller abdominal oppblåsthet, hoste, blodig avføring, forstoppelse, diaré), graviditet, historien om kreftbehandling, dagens bruk av medisin, alkoholforbruk (3 eller flere dager per uke) og røyking i løpet av de siste 2 uker. Eksklusjonskriterier inkluderte deltakerne som hadde gjennomgått kreftkirurgi i året, de som ikke ble undersøkt for kreft tilbakefall til tross for at gått kreft kirurgi mer enn 5 år tidligere, og de som i dag mottar kjemoterapi. Som vi mistenkte at kjemoterapi behandling eller operasjon ville endre urin kjemikalier hos kreftpasienter, søkte vi pasienter som ennå ikke hadde gjennomgått noen behandling. En serienummeret ble skrevet på hver prøverør på tidspunktet for samlingen til å identifisere individuelle informasjon.
Etikk Godkjenning
Denne studien ble utført med samtykke fra de institusjonelle gjennomgang styrene i Imari-Arita Kyoritsu sykehus, og alle fag gitt skriftlig informert samtykke.
blod serum og urin prøvetaking
Hver serumprøver ble skilt fra ca 7 ml blod. Deretter ble 1 til 5 ml serum som inneholdes i et 10 ml polypropylenrør med skrukork og lagret ved -20 ° C frem til presentasjon på prøve.
Omtrent 10 ml urin ble samlet opp fra hver deltaker, tilsatt til en 10 ml skrukork av polypropylen rør og lagret ved -20 ° C til testing. Bare én prøve ble samlet inn fra hver deltaker.
Fastsettelse av tumor markører
tumormarkør konsentrasjoner ble bestemt ved Sentrallaboratoriet CRC Inc. i Fukuoka. Serum CEA-konsentrasjoner ble bestemt ved anvendelse av kjemiluminescens enzymimmunoassay [10], og den cut-off-verdien for serum CEA var 5,0 ng /ml. De serum anti-p53-Ab-konsentrasjoner ble bestemt ved enzymimmunoassay [11], med en cut-off verdi for serum-anti-p53-Ab på 1,30 U /ml. Urin DiAcSpm konsentrasjonene ble bestemt ved hjelp av en automatisk DiAcSpm reagenssett (Alfresa Pharma Co., Osaka, Japan). Denne analyse er basert på den spesifikke bindingen mellom et bovint serumalbumin-konjugat acetylspermine, som en DiAcSpm ligner, og en stabil rød-purpur oppløsning av kolloidale gull-antistoffkomplekser [12]. De cut-off verdier for urin DiAcSpm var 243 nmol /g Cre hos menn og 354 nmol /g Cre hos kvinner, henholdsvis.
Statistisk analyse
Forskjeller i deltakernes egenskaper, laboratoriedata og tumor markører mellom kontroll- og kreft deltakerne ble undersøkt ved hjelp av paret
t
-test for kontinuerlige variabler og χ
2 test for dikotomisert variabler. En
P
-verdi av 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Kreft iscenesettelse var basert på Union Internationale Contre le Cancer (UICC) kriterier. Deretter ble odds ratio (ORS) og 95% konfidensintervall (CIS) for kreft påvisning beregnes ved hjelp av fem logistikk regresjonsmodeller. Modell 1: NSDT, alder og klager [appetitt tap, forstoppelse eller diaré, noen klager]; Modell 2: NSDT, alder og andre sykdommer [hypertensjon, hyperlipidemi, cerebralt infarkt, noen andre sykdommer]; Modell 3: NSDT, alder, Plt, CEA, anti-p53 Ab og DiAcSpm /Cre; Modell 4: NSDT, alder, hypertensjon, noen andre sykdommer, CEA og noen TM; Modell 5: NSDT, alder og CEA. OR for hvert serievariabel ble uttrykt for ett standardavvik (SD) økning. Diagnostisk nøyaktighet ble beregnet som sensitivitet, spesifisitet positiv prediktiv verdi og effektivitet av CEA, anti-p53 Ab, DiAcSpm, noen TM, og NSDT av prøver, sammenlignet med dagens diagnose.
Worm kulturer og stammer
C
.
elegans
stammer ble dyrket ved 20 ° C under standardbetingelser på NGM plater [13] med
Escherichia coli
NA22, som vokser i tykke lag som fungerer som en egnet matkilde for storskala orm kulturer brukes for chemotaxis analyser [14-17]. Stammer brukt i denne studien var vill-type N2 og
ODR-3 (n2150)
.
Chemotaxis analyser
kjemotaksien analysene ble utført ved hjelp av 50-100 ca synkronisert ung voksne, og beregningen av kjemotaksen indeksen ble utført som tidligere beskrevet [16,18]. Det var viktig å opprettholde romtemperatur på 23 ± 1 ° C. Urinprøver lagret ved -20 ° C, ble tint og holdt ved værelsestemperatur like før analysene. Bare velfødde dyr ble brukt, fordi sult påvirker tiltrekning til kreft urin samt unngåelse av kontroll urin.
Genetisk ablasjon av sensoriske nevroner
Vi brukte mus caspase-1 (mCasp1) for ablasjon av AWC, AWA, aske og AWB nevroner [16,17].
CEH-36 product: [19],
ODR-10 product: [20],
SRA-6 product: [21] og
str-en product: [ ,,,0],22] aktivatorer ble anvendt for å drive ekspresjonen av mCasp1 i hver av disse neuroner, respektivt.
Kalsium avbildning
Fordi urinprøver flyte i tynne rør i bildebehandling eksperimenter ved anvendelse av en mikrofluidteknisk enhet, og utfelles faste legemer i urinen måtte fjernes ved sentrifugering og filtrering (porestørrelse 0,22 um, MillexGP, Merck Millipore). For å overvåke svarene av AWC og AWA nevroner, YC3.60 [23] ble uttrykt i disse nevronene av
ODR-1 product: [24] og
ODR-10 product: [20] fremmere, henholdsvis. Kalsium avbildning ble utført som tidligere beskrevet [25-27]. Hvert dyr ble immobilisert på en microchannel slik at nesen av dyret ble utsatt for en flytende strøm inneholdende urin ved 10
-1 fortynning. Svar på både kontroll urin og urin fra kreftpasienter ble testet i de samme individene. Fluorescent bilder av YC3.60 ble oppnådd ved hjelp av en Leica DMI3000B mikroskop utstyrt med en 40 × objektiv og en ORCA-D2 digitalkamera (Hamamatsu). Alle bildene ble tatt med eksponeringer av 200 ms. Tid stabler av AWC eller AWA celle organer ble tatt og analysert for utslipp forholdet mellom YFP til CFP fluorescens ved hjelp Metamorph programvare (Molecular Devices). Forholdet ble beregnet som YFP intensitet /CFP intensitet (= R), og gjennomsnittlig ratio i en 10-s vinduet (-10 til 0 s) ble satt som R0.
Diskusjon
Resultater og
C
.
elegans
er tiltrukket eller unngår ulike flyktige dufter [18]. For å undersøke om
C
.
elegans
oppdaget lukt utskilt fra kreftvev, vi først analysert responsen av individuelle
C
.
elegans
til kondisjonert medium fra kulturer av humane kreft og fibroblast cellelinjer. Cellelinjer avledet fra humane tumorer var som følger: tykktarmskreft, SW480, COLO201 og COLO205; brystkreft, MCF7; og magekreft, NUGC4, MKN1 og MKN7. Cellelinjer avledet fra normale menneskelige vev var som følger: embryo fibroblaster, KMST-6 (udødeliggjort ved hjelp av
60Co bestråling) og tykktarm fibroblaster, CCD-112CoN. Den klare lag på toppen av kulturmediet ble erholdt og prikket inn på analyseskålene for å vurdere den kjemotaktiske oppførsel av villtype
C
.
elegans
. For å utelukke noen effekt av lukten av mediet, fortynnet friskt medium ble oppdaget motsatt side av kondisjonert medium på analyseplater. Vi fant ut at villtype
C
.
elegans
viste signifikant tiltrekning til 10
-6 eller 10
-7 fortynninger av medium hvori kreftcellene hadde blitt opprettholdt (Fig. 1A). responser doseavhengig ble observert, og topp tiltrekning ble indusert ved 10
-6 og 10
-7 fortynninger av medium (S1 Fig. A). I motsetning til dette ble vill-type ormer ikke tiltrukket av et bredt spekter av konsentrasjoner av dyrkede mediet fra humane fibroblast-cellelinjer (Fig. 1A og S1B fig.). Villtype
C
.
elegans
også viste tiltrekning til media fra en annen dyrking linje av kreftceller, men ikke for de av fibroblaster (S2 fig.). Ved høyere konsentrasjoner, dyrene tendens til å vise unngåelsesatferd (S1 Fig. A), i tråd med vår forrige rapport at
C
.
elegans
unngår høyere konsentrasjoner av attraktive dufter [16-18,21,28,29].
(A) Chemotaxis av vill type
C
.
elegans
til 10
-6 og 10
-7 fortynninger av MEM, EMEM eller RPMI medium bare, eller kultur medium fra fibroblast (KMST-6 og CCD-112CoN), tykktarmskreft (SW480 , COLO201 og COLO205), brystkreft (MCF7-) eller magekreft (NUGC4, MKN1 og MKN7) celler (n ≥ 5 analyser). (B) Chemotaxis av villtype og
ODR-3
mutanter (n ≥ 5-analyser) i respons til et 10
-6 fortynning av kondisjonert kulturmedium av kolorektal, bryst eller mage kreftceller. (C) Chemotaxis av villtype til 10
-2, 10
-3 og 10
-4 fortynninger av saltvann med normale og kreft vev (n ≥ 5-analyser). (D) Chemotaxis til normal og kreft vev av villtype og
ODR-3
mutanter (n ≥ 5 analyser). (E) Chemotaxis av villtype til menneskelige urinprøver fra kontrollpersoner (blå søyler, c1-c10) eller kreftpasienter (oransje linjer; p1-p20) ved 10
-1 fortynning (n = 5-analyser). (F) Chemotaxis til urin fra kreftpasienter med villtype og
ODR-3
mutanter ved 10
-1 utvannings (n ≥ 6 analyser). Feilfelt representerer SEM. Vesentlige forskjeller fra kontrollprøvene er angitt med * (
P
0,05); ** (
P
0,01); *** (
P
0,001) av Dunnetts tester (A) eller Student
t
-UNDERSØKELSER (B, C, D, F). † indikerer en signifikant forskjell (
P
0,05) av Student
t
-UNDERSØKELSER (A)
I
C
..
elegans
er attraktive odorants registrert av AWC og AWA olfactory nevroner [18]. I disse sensoriske nevroner, ODR-3 (G protein α) fungerer som en viktig del av en luktesignalveien, og
ODR-3
mutanter ikke kan svare på attraktive odorants [30]. Imidlertid er ODR-3 ikke involvert i svarene til andre typer attraktive kjemikalier inkludert vannløselige stoffer. Vi observerte at
ODR-3
mutanter viste alvorlige mangler ved tiltrekning til medium fra kreftcellelinjer (Fig. 1B), noe som indikerer at
C
.
elegans
registrerer stoffer som lukter fra dyrkede kreftceller.
Neste, vi testet om
C
.
elegans
viser tiltrekning mot menneskelig kreft vev fra en kreftpasient. Vi fant villtype
C
.
elegans
utstilt åpenbar tiltrekning til kreft vev av 0,1-0,8 mm i diameter fra en kreftpasient (sigmoid tykktarmskreft, magekreft eller endetarmskreft), men svakt unngått normalt vev fra samme deltaker (S3 fig.) . Når kreft eller normalt vev ble plassert på motsatte punkter hverandre på samme plate, vill-type
C
.
elegans
foretrukne kreftvev (S1 Fig. A).
For å kvantitativt vurdere dette problemet, vi skåret kreft og normalt vev på 0,5 cm hver fra den samme stadium II sigmoid tykktarm kreft pasient og vedlikeholdes dem i 10 ml saltvann. Villtype
C
.
elegans
viste tiltrekning til 10
-3 eller 10
-4 fortynninger av kreftvev vedlikeholdt saltvann, mens det viste unngåelse til saltvann med normalt vev (Fig. 1C). I likhet med den ovennevnte resultat av kjemotaksen til kreftceller, dyrene hadde en tendens til å vise svak tiltrekning ved høyere konsentrasjoner [16]. Disse resultatene indikerer at
C
.
elegans
vise tiltrekning til kreft vev. Videre
ODR-3
mutanter viste ikke tiltrekning til kreft vev (Fig. 1 D), noe som indikerer at
C
.
elegans
sanser stoffer som lukter av kreft vev. Det motsatte, mutantene hadde normal unngåelse av normalt vev, som sannsynligvis er i samsvar med den forrige resultat ODR-tre formidler hovedsakelig tiltrekning mens delvis regulerer unngåelse og andre G-proteiner er involvert i sensing repellents [16,30].
for å finne ut om NSDT kan være et effektivt verktøy for screening av kreft hos mennesker, sammenlignet vi svarene av
C
.
elegans
til serum og urin av kontrollpersoner og pasienter med kreft (begrenset karakterisering). Vi testet 30 serum og urinprøver; 10 prøver fra kontroller med ingen historie av kreft og 20 prøver fra pasienter med kolorektal, mage eller kreft i bukspyttkjertelen (S1 tabell). I respons til serum, ble det ikke observert noen forskjell mellom prøver fra kontrollpersoner og kreftpasienter, selv om konsentrasjonene av serum ble endret (S4 fig.). Dette kan være på grunn av tilstedeværelsen av andre sterke odoranter eller molekyler som maskerer lukten av molekyler utskilt til sirkulasjonen. Men
C
.
elegans
ble tiltrukket av 10
-1 fortynning av urinprøver fra kreftpasienter, mens de unngikk alle kontroll urinprøver (Fig. 1E og S5 fig.). Vi testet forskjellige konsentrasjoner av urin og funnet at tiltrekning til kreft urin og unngåelse av kontroll urin nådde en 10
-1 fortynning av hver (S6 fig.). Dette resultatet viser muligheten for at
C
.
elegans
diskriminert mellom urin fra kontroller og kreftpasienter. Blant pasientene som ble testet, var det seks tilfeller av tidlig stadium kreft (trinn 1) (P1, P3, P6, P8, p11 og p12) (S1 tabell), noe som tyder på muligheten for at NSDT kan anvendes for screening av tidlig kreft . Videre
ODR-3
mutanter utstilt betydelige mangler i sin tiltrekning til urin fra kreftpasienter, videre tyder på at
C
.
elegans
registrerer lukt i urinen (Fig. 1F).
Som nevnt ovenfor, er attraktive odorants registrert av AWC og AWA olfactory nevroner i
C
.
elegans
, mens insektmidler er registrert av ASH, AWB og andre sensoriske nevroner [21,22,31,32]. For å finne ut hvilke sensoriske nevroner forstand kreft lukter urin, analyserte vi svarene av dyr med sensorisk neuron ablasjon. En tidligere rapport indikerte at uttrykk for mus caspase 1 (mCasp1) effektivt dreper AWC, AWA, ASH og AWB nevroner [16,17]. Vi fant ash eller AWB- ablasjon forårsaket defekter i unngåelse av kontroll urin (Fig. 2A), noe som tyder på at disse nevronene regulere denne oppførselen. I motsetning til dette, AWC- eller AWA-ablasjon dyr som viste betydelige mangler i deres tiltrekning til urin fra kreftpasienter (fig. 2A), noe som indikerer at AWC og AWA olfaktoriske nerveceller medierer tiltrekning til kreft lukt i urinen.
( A) Chemotaxis til urin fra kontroller (c5 og C10) eller kreftpasienter (p5, P8 og p18) i vill-type dyr med AWC, AWA, ASH eller AWB nevron ablasjon (n ≥ 5-analyser). (B) Chemotaxis av vill type
C
.
elegans
til urinprøver fra kontroller (A og B) eller kreftpasienter (C og D) med eller uten filtrering som ble brukt i bildebehandling eksperimenter (n ≥ 5 analyser). Filtrering av urin hadde ingen signifikant virkning. (C) Kalsium responsene til AWC olfaktoriske nerveceller for fjernelse av kontroll eller kreftpasient urin. (D) Gjennomsnittlig fluorescens endringer i AWC i 10 s følgende urin fjerning (n ≥ 8 dyr). Verdien er normalisert til den gjennomsnittlige endring i forholdet mellom kontroll-A. (E) Kalsium svarene av AWA olfactory nevroner etter tilsetning av urin fra kontroller eller kreftpasienter. (F) Gjennomsnittlig fluorescens endringer i AWA i 10 s etter urin stimulering (n ≥ 8 dyr). Verdien er normalisert til den gjennomsnittlige endring i forholdet mellom kontroll-A. Den brune skyggelegging indikerer at urinen var til stede. Feil barer og skyggefulle områder rundt kurvene representerer SEM. Vesentlige forskjeller fra kontrollprøvene er angitt med * (
P
0,05); ** (
P
0,01); *** (
P
0,001). Beregnet ved Dunnetts tester (A, D, F)
Basert på resultatene som er beskrevet ovenfor, til direkte overvåke svarene
C
.
elegans
olfactory nevroner til urin fra kreftpasienter, vi utførte kalsium bildebehandling eksperimenter ved hjelp av genetisk kodet kalsium indikator, gul Cameleon (YC) 3,60 [23,25-27]. For bildebehandling eksperimenter, fikk vi store mengder urin fra kontroller (A og B) og pasienter med magekreft (C og D), og observerte unngå eller tiltrekning til disse urinprøver av
C
.
elegans
henholdsvis (Fig. 2B). For bildebehandling eksperimenter, utfellinger og faste legemer i urinen ble fjernet ved sentrifugering og filtrering (se Methods). Slik behandling påvirket ikke kjemotaktisk oppførsel av
C
.
elegans
mot urinprøver (Fig. 2B). Fordi våre tidligere resultater viste at AWC og AWA olfactory nevroner megle
C
.
elegans
tiltrekning til urin fra kreftpasienter (Fig. 2A), overvåket vi svarene på disse nevronene følgende urin stimulering. Tidligere rapporter viste økning i kalsiumkonsentrasjonen oppstå i AWC nevroner ved lukt fjerning (en lukt-OFF respons) [25], mens det i AWA nevroner oppdages etter lukt tillegg (en lukt-ON respons) [33]. Vi fant AWC olfactory nevroner klart svart på urin fra pasienter med magekreft (Fig. 2C og S1 Movie). Økt intracellulær Ca
ble observert 2 + nivåer i AWC neuroner etter fjerning av urin, mens AWC neuronal respons på kreftpasient urin var vesentlig sterkere enn de som er å få tak urin (fig. 2D), noe som indikerer at disse nevronene spiller viktige roller i diskriminerende mellom urin fra kontroller og cancerpasienter. Vi har observert signifikant sterkere responsene fra AWC nerveceller for å urin fra pasienter med andre typer kreft (rektal og sigmoid kolon kreft) (S7 fig.). AWC neuroner også svakt reagert for å kontrollere urin, noe som tyder på tilstedeværelsen av urenheter i urinen som kan lett aktivere AWC nerveceller. Også i AWA olfactory nevroner, svake, men signifikante responser tillegg av urin fra kreftpasienter ble observert (Fig. 2E og F), men ingen forskjeller mellom urin fra kontrollene og pasientene ble påvist i bildebehandling eksperimenter fordi svarene av AWA nevroner var veldig svak i forhold til AWC nevroner
for å undersøke nøyaktigheten av NSDT, analyserte vi 242 urinprøver.; 218 kontrollprøver og 24 prøver fra kreftpasienter (utvidet karakterisering) (S2 tabell). Alle urinprøver ble fortynnet til 10
-1 konsentrasjon og kjemotaksis analyser ble utført tre ganger for hver prøve. Når resultatet av tre ganger analyser straddled 0 ble tre ganger analysene utføres på nytt for samme prøve.
C
.
elegans
viste tiltrekning til ulike kreft pasienten urinprøver (23/24) (Fig. 3). Følsomheten av NSDT var 95,8% (tabell 1). Men
C
.
elegans
utstilt unngåelse av de fleste kontroll urinprøver (207/218) (Fig. 3). Spesifisiteten av NSDT var 95,0%, og den positive prediktiv verdi og effektiviteten av testen var 67,6% og 95,0%, henholdsvis (tabell 1). Vi har også analysert pasienten spørreskjema og andre eksisterende tumor markører inkludert serum CEA [10], serum anti-p53 antistoff (anti-p53 Ab) [11] og urin N
1, N
12-diacetylspermine (DiAcSpm) [12] i de samme deltakere. Sammenlignet med disse eksisterende tumor markører, spesifisiteten av NSDT var mye høyere (tabell 1). Ikke desto mindre, følsomheten av de eksisterende tumormarkører tendens til å være lavere, med tidlig stadium kreft, men som av den NSDT vært høy for alle faser av kreft. Vi målte også urin kreatininkonsentrasjonen, som ble brukt som en indikator på urinkonsentrasjonen for alle prøver. Men svarene av
C
.
elegans
til urinen var ikke forbundet med urin konsentrasjon, noe som tyder på at kreft lukt sekresjon er uavhengig. Selv om DiAcSpm nivåene ble øket åpenbart i urinen hos alle tre gravide kvinner som ble testet, ble det NSDT ikke påvirket av graviditet. Også chemotaxis til urin hadde ingen sammenheng med kjønn på deltakerne, de fleste fysiske plager og sykdommer enn kreft, inkludert diabetes, eller den type medisin administreres (S2 tabell). Det var signifikante forskjeller i NSDT, deltaker alder, appetitt tap, forstoppelse eller diaré, noen klager, hypertensjon, hyperlipidemi, hjerneslag, enkelte andre sykdommer, blodplater, CEA, og enkelte tumormarkører (TMS) mellom kreftpasienter og kontrolldeltakere (S2 tabell). Logistisk regresjon ble utført for å identifisere uavhengige faktorer for kreft gjenkjenning og effekten av NSDT ble undersøkt via disse analysene. Appetite tap, forstoppelse eller diaré, noen klager, hypertensjon, hyperlipidemi, hjerneslag, enkelte andre sykdommer, blodplater, anti-p53 Ab og DiAcSpm /Cre ble ikke signifikant assosiert med kreft påvisning (S3 tabell). Som et resultat, NSDT og deltaker alder var uavhengige variabler for diagnose av kreft i alle modellene i den logistiske analysene. Den odds ratio for 0,2 økning i NSDT var mellom ca 30,4 til 49,8 for alle modeller (S3 Table). Disse resultatene indikerer at den NSDT spesifikt kan oppdage kreft. Deltakerne i denne test omfattet pasienter med tidlig kreft (stadium 0 eller 1) (tabell 1), noe som indikerer at NSDT kan oppdage tidlig stadium av kreft. Merk at i fem deltakere som ikke ble kategorisert som kreftpasienter når urinen ble oppnådd i 2011, den NSDT identifisert urin av disse deltakerne som kreft-positiv; kreft ble funnet i løpet av de påfølgende to årene. Den NSDT kunne gjenkjenne ulike typer kreft testet i denne undersøkelse, inkludert øsofageal, gastrisk, kolorektal, bryst, pankreas og prostatakreft i alle faser (fig. 3 og tabell 1), noe som tyder på at denne testen kan anvendes for inklusive kreft screening.
Boksplott plott~~POS=HEADCOMP (A) og prikkplotter (B) av chemotactic reaksjoner fra villtype
C
.
elegans
til urinprøver fra kontrollpersoner (n = 218) eller kreftpasienter (n = 24). Værhår indikere 10. og 90th persentiler.
I denne studien, viser vi at
C
.
elegans
diskriminert effektivt mellom urinen til kreftpasienter og kontrollpersoner. Likevel, identifisering av unike kreft lukt i urinen og bekreftelse av svarene til
C
.
elegans
er nødvendig for å støtte den konklusjon at
C
.
elegans
oppdager kreft lukter urin. Vi mener at de data som presenteres her indikerer at bruk av
C
.
elegans
viser løfte om kreftdiagnose. Erfarne klinikere vet at den menneskelige nese er et verdifullt verktøy i sengen diagnose, men muligheten for mennesker til å diagnostisere sykdom ved lukt har bare svært sjelden vært gjenstand for kvantitative studier. Nylig har mange duft gjenkjenning studier utført med dyr [2-6,34], gasskromatografi /massespektroskopi (GC /MS) [6,35-39] eller elektroniske neser (Enoses) [40-42]. Diagnose av kreft ved GC /MS eller Enoses er problematisk med hensyn til følsomhet, støy av de flyktige organiske forbindelser som finnes i miljøet, og høye kostnader. Selv om ingen direkte sammenligning studier er utført, hunder ser ut til å utkonkurrere GC /MS eller Enoses [43]. Imidlertid intelligens og konsentrasjonen av disse dyrene er ufordelaktig i kreft screening som krever den mekaniske undersøkelse av tallrike prøver. Derfor postulerte vi at hvis vi kunne skille duft påvisning fra intelligens vi kunne undersøke forholdet mellom sykdommer og dufter. Vi har observert ivrig duft påvisning av nematode
C
.
elegans
, som ikke er påvirket av eller avhengige på intelligens.
For å oppdage kreft lukter mer presist og kvantitativt, er det nødvendig å identifisere spesifikke kreft lukt og deres reseptorer. Flere flyktige organiske forbindelser er blitt identifisert som kandidat stoffer for diagnose av kreft ved bruk av gasskromatografi /massespektroskopi (GC /MS) [6,35-39] eller Enoses [40-42] i cancercellelinjer, urin eller utåndet pust. Men mens disse dataene er lovende, er de foreløpige funn. Ved å bruke
C
.
elegans
å teste et stort antall prøver, omfattende screening av kreft lukt kan utføres effektivt. Videre olfactory reseptorer som binder kreft lukter ennå ikke er identifisert, fordi molekylære og genetiske analyser er vanskelige eller utilgjengelige i høyere organismer som for eksempel hunder. Gitt kraften i genetikk og molekylære teknikker i
C
. Feilfelt representerer SEM.
