Abstract
Prognosen for pasienter med eggstokkreft har vært dårlig hovedsakelig på grunn av aggressiv kreft progresjon. Siden epitelial-mesenkymale overgang (EMT) er en viktig mekanisme mediere invasjon og metastase av kreftceller, rettet mot EMT prosessen med mer effektive og mindre toksiske forbindelser for å hemme metastase er av stor terapeutisk verdi for behandling av eggstokkreft. Vi har funnet for første gang at ginsenoside 20 (S) -Rg3, en farmakologisk aktiv komponent i tradisjonell kinesisk urt
Panax ginseng
, potent blokker hypoksi-indusert EMT av eggstokkreft celler
in vitro Hotell og
in vivo
. Mekanistiske undersøkelser bekrefter virknings av 20 (S) -Rg3, noe som reduserer ekspresjon av hypoksi-induserbar faktor 1α (HIF-1α) ved å aktivere ubiquitin-proteasom-reaksjonsveien for å fremme HIF-1α degradering. En reduksjon i HIF-1α i sin tur fører til oppregulering, via transcriptional undertrykkelse av snegle, av den epiteliale cellespesifikk markør E-cadherin og nedregulering av den mesenchymale celle-spesifikk markør vimentin henhold hypoksiske betingelser. Viktigere, -Rg3 20 (S) effektivt hemmer EMT i nakne mus xenograft modeller av eggstokkreft, lovende en roman terapeutisk middel for kreftbehandling
Citation. Liu T, Zhao L, Zhang Y, Chen W, Liu D, Hou H, et al. (2014) Ginsenoside 20 (S) -Rg3 Targets HIF-1α til Block Hypoksi-Induced Epitelial-Mesenchymale Overgang i eggstokkreft celler. PLoS ONE ni (9): e103887. doi: 10,1371 /journal.pone.0103887
Redaktør: Joseph Najbauer, Universitetet i Pécs Medical School, Ungarn
mottatt: 31 oktober 2013; Godkjent: 04.07.2014; Publisert: 08.09.2014
Copyright: © 2014 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (nr 30973429). Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
eggstokkreft, eksisterende hovedsakelig i form av ovarialcancer (EOC), er den mest dødelige gynekologisk kreft [1], [2]. Den lave overlevelsen av pasienter med eggstokkreft er assosiert med sin onde natur invasjon og metastasering. Blant de viktige bidragsytere til invasive og metastatisk evne av eggstokkreft celler er hypoksi i tumoren mikromiljøet [3], [4], som formidler tumorcelle-invasjon og metastase ved stabilisering av hypoksi-induserbar faktor-1 alfa (HIF-1α) [5], [6].
i normoksisk celler, er HIF-1α hydroksylerte av en familie av prolin hydroksylaser (PHD1-3) på Pro402 og Pro564, som fører til en konformasjonsendring som fremmer HIF-1α bindende til von Hippel Lindau protein (VHL) – en komponent av den store E3 ubiquitin ligase kompleks som medierer proteasomal nedbrytning av HIF-1α [7], [8]. Under hypoksiske betingelser, lavt oksygennivå være til hinder prolin hydroksylering, noe som fører til HIF-1α stabilisering og etterfølgende dannelse av en heterodimer med konstitutivt uttrykte HIF-1β. Det bioaktive HIF-1 dimer regulerer, som en transkripsjonsfaktor, ekspresjonen av et bredt spekter av gener som er involvert ikke bare i cellesyklus, apoptose [9], angiogenese [10], [11] og metabolisme [12] som respons på hypoksisk miljø, men også i en cellulær prosess som kalles epitelial-mesenkymale overgang (EMT) [13] – [15]
Identifisert først i embryonisk utvikling, har EMT vist seg senere til å være sterkt involvert i prosessen. kreft invasjon og metastasering [16], [17]. Under EMT prosess celler gjennomgår en overgang fra et polarisert epitel fenotype til en mesenchymale fenotype [18], et biologisk hendelse, karakterisert ved cellemorfologi skifte fra en brostein form til en dispergert fibroblastoid form, tap av epitel-celle-spesifikke proteinmarkører og oppkjøpet av mesenchymale cellespesifikke egenskaper, og forbedret cellemotilitet og invasjon. Selv om en rekke faktorer, inkludert vekstfaktorer og en hypoksisk mikromiljøet blir demonstrert som induserer EMT, er mange transkripsjonsfaktorer slik som sneglen bekreftet å være viktige mediatorer for emt [19]. EMT undertrykker epitelial celle-spesifikke E-cadherin via virkningen av forskjellige mediatorer, som fører til tap av apikal-basal polaritet og celle-celle adhesjon krysset, og opp-regulerer mesenchymale celle-spesifikk vimentin [20] som resulterer i cytoskjelett omleiring og cellemotilitet ekstrautstyr. Disse hendelsene utgjør de grunnleggende funksjonene i EMT på molekylært nivå. Av notatet, er EMT også innblandet i kreft narkotika motstand og vanskeliggjør effektiv terapeutisk intervensjon av kreft i avansert stadium [21]. Selvfølgelig vil målrette EMT prosessen gi en ny idé for kreftbehandling, spesielt for eggstokkreft-en svulst som viser et stort potensial til å spre.
Ginsenosides er farmakologisk aktive komponentene i
Panax ginseng
[22] som lenge har vært anvendt som en tradisjonell kinesisk medisin for officinal eller rekuperative formål [23], [24]. Hittil har mer enn 40 ginsenoside forbindelser er identifisert [25]. Noen av dem, RG1, RG3, RH1 og Rh2, for eksempel, viser potent anticancer aktivitet [24], [26] – [28]. Ginsenoside RG3, noen bioaktive ekstrakter av
Panax ginseng
, har ulike medisinske effekter, slik som anti-tumor [29] – [32], antioksidant, anti-betennelse egenskaper [33], [34], hemme arr hyperplasi av huden [35] og angiogenese [36]. I tillegg stereoisomerer 20 (R) -Rg3 og 20 (S) -Rg3 er to optisk aktive chirale molekyler som avviker i orienteringen av hydroksyl (OH) gruppe på karbon-20 [24]. Selv om begge har blitt rapportert å inhibere tumormetastase [30], vises stereospecifity av RG3 å være knyttet til deres bioaktivitet. I denne studien har vi oppdaget for første gang som 20 (S) -Rg3 effektivt hemmer hypoksi-indusert EMT av menneskelige eggstokkreft celler ikke bare
in vitro
men også i nakne mus xenograft modeller, lovende en roman naturlig middel for anti-eggstokkreft terapi.
Materialer og metoder
narkotika og antistoffer
20 (S) -Rg3 og 20 (R) -Rg3 ble oppnådd fra Tasly Pharmaceutical Company (Tianjin, Kina) og renheten ble ≥99% som bestemt ved høy-ytelses væskekromatografi (HPLC). RG3 stereoisomerer ble oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO) i en 4 mg /ml stamløsning og lagret ved -20 ° C. Aliquoter av lagerløsningen ble tilsatt direkte til kulturmediet
De følgende antistoffer ble anvendt:. Kanin-antistoff til vimentin, VHL, museantistoff p-aktin (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), kanin antistoff mot E-cadherin (BioWorld Technology, Louis Park, MN, USA), mus antistoff mot HIF-1α (Abcam Inc., Cambridge, MA, USA), sau antistoff mot PHD1 (R D Systems Inc., Minneapolis, MN , USA), kanin antistoff mot Snail (Abnove, Taipei, Kina). Pepperrotperoksidase (HRP) konjugert geite-anti-muse-immunoglobulin (IgG), geite-anti-mus-IgG og kanin-anti-sau IgG (Pierce, Rockford, IL, USA), HRP-Polymer anti-muse /Kanin IHC Kit (Fuzhou Maixin Biology Co Ltd, Fouzhou, Fujian, Kina)
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og kultur
den menneskelige eggstokkreft cellelinje SKOV3 ble innhentet fra Shanghai Cell Bank of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina), 3AO ble kjøpt fra Shandong Academy of Medical Sciences (Jinan, Kina) .Cells ble opprettholdt i RPMI 1640 supplert med 10% nyfødt bovint serum (GIBCO, Grand Island, NY, USA) under normoksisk forhold (21% O
2, 5% CO
2, 37 ° C, 100% fuktighet) i 24 timer før videre behandling. For hypoksi induksjon, ble cellene inkubert ved 1%, O
2, 5% CO
2, 94% N
2, 37 ° C, 100% fuktighet i en HF100 hypoksi kammer (Heal Force, Hong Kong , Kina) i ytterligere 24 timer med eller uten eksponering til 80 ug /ml 20 (S) -Rg3 (for SKOV3) eller 160 ug /ml 20 (S) -Rg3 (for 3AO) eller 80 160 eller 320 ug /ml 20 (R) -Rg3 (for SKOV3 og 3AO celler).
Celleviabilitet assay
celler ble sådd ut ved en tetthet på 5000 celler per brønn i 96-brønners plater i 200 ul RPMI 1640 inneholdende 10% nyfødt bovint serum (NBS). Etter 24 timers inkubering, økende konsentrasjoner av 20 (S) -Rg3 og 20 (R) -Rg3 ble tilsatt. 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5- difenyltetrazoliumbromid (MTT) analyser ble foretatt etter henholdsvis 24 timer og 48 timers behandling,. 20 ul av 5 mg /ml MTT ble tilsatt til hver brønn. Cellene ble deretter inkubert i 4 timer ved 37 ° C, etterfulgt av tilsetning av 150 ul DMSO. De 570 nm bølgelengde absorpsjons-verdier ble målt ved bruk av enspire multimode plateleser (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). Alle forsøk ble utført in triplo, og gjentatt tre ganger.
Sanntids polymerase kjedereaksjon (PCR)
Total RNA ble ekstrahert fra dyrkede celler ved hjelp RNAfast 200 (Fastagen Biotech Co. Ltd. , Shanghai, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. RNA konsentrasjon og renhet ble bestemt på et UV spektrofotometer (BioRad Inc., Hercules, CA, USA) ved 260 nm absorbans og 260/280 nm absorbans forhold, henholdsvis. cDNA syntese ble utført med RevertAid første tråd cDNA syntese Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Reaksjonene ble utført ved 25 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 42 ° C i 60 min og 70 ° C i 5 minutter. CDNA ble lagret ved -80 ° C for senere bruk. Kvantitativ real-time PCR ble utført på en CFX-96 real-time PCR system (Bio Rad, Hercules, CA, USA) ved hjelp av SYBR Grønn Master Mix (Takara Bioteknologi Co Ltd, Dalian, Kina). For normalisering ble genet β-aktin brukt. Sykkelforholdene var som følger: initial denaturering ved 95 ° C i 30 sekunder, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 5 s og 60 ° C i 31 s. Hver måling ble utført in triplo, og ikke-templat-kontroller ble inkludert i hver analyse. Etter PCR ble det dissosiasjonskurve analyse utført. Relativ genekspresjon ble beregnet automatisk ved hjelp av to
-ΔΔCt metode. Alle oligonukleotidprimere ble utformet og syntetisert av Shanghai Shenggong Bioteknologisk Ltd (Shanghai, Kina). De følgende primer-sekvenser ble anvendt: HIF-1α-fram, 5′-ATCCATGTGACCATGAGGAAATG-3 «; HIF-1α-revers 5»-TCGGCTAGTTAGGGTACACTTC-3 «; PHD1 fremover, 5»-AGGCTGTCGAAGCATTGGTG-3 «; PHD1- omvendt, 5»-GGGATTGTCAACGTGCCTTAC-3 «; PHD2 fremover, 5»-AAGCCCAGTTTGCTGACATT-3 «; PHD2-revers, 5»-TTACCGACCGAATCTGAAGG-3 «; PHD3 fremover, 5»-AGCCCATTTTTGCCAGACTCC-3 «; PHD3-revers, 5»-GATTTCAGAGCACGGTCAGTC-3 «; VHL fremover, 5»-GCAGGCGTCGAAGAGTACG-3 «; VHL- omvendt, 5»-CGGACTGCGATTGCAGAAGA-3 «; Snail fremover, 5»-TCCAGAGTTTACCTTCCAGCA-3 «; Snail- omvendt, 5»-CTTTCCCACTGTCCTCATCTG-3 «; β-aktin-forward, 5’TCCCTGGAGAAGAGCTACGA-3 «; β-actin- omvendt, 5»-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3 «.
Western Blot
Totalt celle protein ekstrakter ble utarbeidet ved lyse celler i RIPA buffer på is. Cellene ble samlet ved å skrape og overført til mikrofugerør. Prøvene ble kortvarig ultralydbehandlet og sentrifugert ved 12000 rpm i 30 min for å fjerne uoppløselige rester. Supernatanten ble samlet og kvantifisert ved hjelp av hurtigstart Bradford Protein Assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Proteiner ble kokt før de ble separert ved elektroforese på natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) geler og overført til nitrocellulosemembraner (Pall Life Science, NY, USA) ved bruk av en våt transmembrananordning (Amersham Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ , USA). Membranene ble blokkert med 5% ikke-fettholdig melk ved romtemperatur i 1 time, probet over natten med primært antistoff (E-cadherin 1:500, vimentin 1:2000, β-actin 1:1000, HIF-1α 1:500, PHD1 1:2000, VHL 1:1000) i TBST, fulgt av inkubering med passende pepperrotperoksidase (HRP) konjugert sekundært antistoff (geite-anti-muse /kanin-IgG 1:2000, kanin-anti-sau IgG 1:1000) som angitt. ECL-reagens (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) ble brukt til å utvikle blotter. Alle verdier ble normalisert til p-aktin.
sårtilheling analysen
Celler ble sådd på seks-brønns plater 24 timer før behandling. Monolagene ble skrapet med en 200 ul pipette og vasket med medium uten serum for å fjerne de frigjorte celler. Celler ble opprettholdt i medium uten serum i henhold normoxia, hypoksi eller hypoksi i nærvær av 20 (S) -Rg3 i 24 timer, henholdsvis. De sårede områder ble deretter fotografert etter inkubasjon i en indikert periode.
Cell migrasjon analysen
Cells (1 × 10
5 /brønn) i 100 ul media uten serum ble lagt inn i millicells med 8 um porestørrelse (Millipore Co., Bedford, MA, USA), innføres i brønner inneholdende RPMI 1640 med 20% føtalt bovint serum som kjemotaktisk faktor. Etter 24 timers inkubering ble cellene igjen på den øvre overflaten av filteret fjernet med en bomullsdott, og de migrerende cellene ble fiksert med 5% glutardialdehyd, etterfulgt av Giemsa-farging for kvantifisering av celletallet. Antallet av migrerende celler i tre kraftige felt av de nedre overflater av membranene ble telt. Minst tre brønner ble talt opp per eksperiment.
Små interfering RNA (siRNA) knockdown
knockdown av PHD1 og VHL ble utført med bestemte sirnas kjøpt fra GenePharma Company (Shanghai, Kina). Sekvenser sirnas er som følger: siPHD1-A, 5′-GCAUCACCUGUAUCUAUUATT-3 «; siPHD1-B, 5»-CCAACAUCGAGCCACUCUUTT-3 «; siPHD1-C, 5»-GCUAGCAUCAGGACAGAAATT-3 «; siVHL-A, 5»-CCACCCAAAUGUGCAGAAATT-3 «; siVHL-B, 5»-GUCUCAUUCUCAGAGUAAATT-3 «; siVHL-C, 5»-AACUGAAUUAUUUGUGCCAUCTT-3 «. En kryptert siRNA (5»-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 «) ble anvendt i parallelle forsøk som negativ kontroll. sirnas ble transfektert til SKOV3 og 3AO celler ved 40-50% samløpet med siRNA transfeksjon reagens (Roche, Indianapolis, IN, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Effektive sirnas ble undersøkt i henhold til resultatene av sanntids RT-PCR etter 48 timers inkubering og ved western blot etter 72 timer, henholdsvis. Da de effektive sirnas ble transfektert inn i cellene og inkubert i 24 timer fulgt av hypoksi induksjon med eller uten 20 (S) -Rg3 behandling i ytterligere 24 timer. Effekten av PHD1 og VHL stillhet på undertrykkelse av HIF-1α av 20 (S) -Rg3 ble vurdert på proteinnivå.
luciferase reporter-analyse
Etter blir sådd ut på 24-brønners plater for 24 timer, celler ble transient transfektert med E-cadherin promoter luciferase reporter plasmid pGL2Basic-E-cadK1 (Addgene, Cambridge, MA, USA) og phRL-TK vektor (Promega, Madison, WI, USA). 24 timer senere ble cellene behandlet med eller uten 20 (S) -Rg3 i hypoksiske innstillinger i 24 timer med normoxically dyrket transfektert celle som kontroll. Cellelysatet ble høstet 24 timer senere og luciferaseaktivitet ble målt ved hjelp av et luminometer (Promega, Madison, WI, USA) ved bruk av dual-luciferase reporter System (Promega, Madison, WI, USA). E-cadherin luciferase-aktiviteten ble normalisert til den av Renilla luciferase. Resultatene ble hentet fra tre uavhengige eksperimenter og hver analyse inneholder tredoble brønner.
Dyrestudier
Den omsorg og bruk av forsøksdyr ble godkjent av etisk komité av First Affiliated Hospital, og var tilhenger til institusjonelle retningslinjer og etiske standarder. Alle seks-ukers gamle BALB /c-hunn nakne mus ble plassert i SPF barriere anlegg under en 12 timers lys /mørke syklus. Dyrekroppsvekt og subkutan tumor perpendikulære diametere ble registrert annenhver dag. Tumor volum ble beregnet i henhold til formelen V = 0.5236 × (L × B
2) (V: tumor volum, L: lengde, W: bredde).
For subkutan xenograft eksperiment, SKOV3 celler ble trypsinisert og resuspendert i PBS til en sluttkonsentrasjon på 2 x 10
7 celler /ml. 2 x 10
6-celler ble injisert subkutant i flanken av musene. 10 dager senere, nakne mus ble tilfeldig inndelt i behandlingsgruppe (n = 4) og kontrollgruppen (n = 4). Mus i disse to gruppe ble behandlet med intravenøse injeksjoner av enten 5 mg /kg av 20 (S) -Rg3 eller like stort volum av PBS i halevenen hver annen dag deretter. Etter 30 dager på eksperimentell behandling, ble musene avlivet av CO
2 kvelning. Tumorprøver ble oppsamlet og fiksert i 4% paraformaldehyd i 24 timer ved værelsestemperatur, parafin-innleiret, og seksjonert for immunhistokjemisk analyse.
For intraperitoneal xenograft modell, ble SKOV3-celler trypsinisert og resuspendert i PBS ved en konsentrasjon på 1 × 10
8 /ml. Mus ble inokulert med 1 x 10
7-celler i bukhulen på dag 0. Fra dag 1, 5 mg /kg av 20 (S) -Rg3 (behandlingsgruppe, n = 7) eller tilsvarende volum av PBS (kontroll gruppe, n = 7) ble injisert via halevene-annenhver dag. Musene ble observert daglig og avlivet etter 30 dager. Obduksjon ble utført, spres svulster ble resected fra mus, og ascitesvæske ble samlet inn. Totale tumorvekt og volum av ascitisk fluid i hver mus ble målt. Alt innholdet i dyreforsøk vi har rapportert her er i samsvar med de ankommer retningslinjer.
Immunohistochemistry
Histologiske lysbilder ble fremstilt fra de parafininnstøpte ovarialcancer vevsblokker. Prøvene ble avvokset i xylen, rehydrert i en avtagende alkohol serie etterfulgt av oppvarming i 0,01 M citratbuffer (pH 6,0) i en dampkoker i 1,5 minutter for å hente antigeniske bindingsseter. Påvisning av antigener ble utført ved anvendelse av inkubasjon med de primære antistoffer (E-cadherin 1:200, vimentin 1:400, HIF-1α 1:200), i 2 timer ved romtemperatur, etterfulgt av inkubasjon med HRP-merket sekundært antistoff ( MaxVision HRP-Polymer anti-muse /Kanin IHC Kit, 1:200) ved romtemperatur i 30 minutter, og fargefremkalling med DAB. Negative kontrollprøver ble inkubert i PBS uten det primære antistoff under de samme betingelser. Lysbilder ble kontra med hematoxylin, dehydrert i en stigende alkohol-serien, og montert for analyse. Digitale bilder ble ervervet på et Olympus BH-2 mikroskop (Tokyo, Japan) installert med DeltaPix kamera og programvare (Maalov, Danmark).
Statistisk analyse
statistiske forskjeller ble bestemt av to- tailed
t
-test eller Wilcoxon rank sum test (bare for volumet av ascites). Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS programvare (Chicago, IL, USA). Forskjeller ble betraktet som signifikant (*) på
P
0,05 og høyst signifikant (**) på
P
. 0,01 for alle sammenligning
Resultater
20 (S) -Rg3, men ikke 20 (R) -Rg3, blokker hypoksi-indusert EMT i SKOV3 og 3AO eggstokkreft kreftceller
Vi først undersøkt effekten av 20 (S) -Rg3 og 20 (R) -Rg3 på cellelevedyktigheten av de to humane ovarie cancer-cellelinjer og SKOV3 3AO i en serie av MTT-analyser. Strukturene av 20 (S) -Rg3 og 20 (R) -Rg3 ble vist i Figur S1-A. 20 (S) -Rg3 hemmet cellevekst i en doseavhengig måte, noe som gir opphav til IC
50 (hemmende konsentrasjon ved hvilken 50% celleviabilitet inhiberes) verdier på 146,8 og 242,6 ug /ml, henholdsvis, for SKOV3 og 3AO celler 24 timer (eller 48 h) etter behandling (fig S1-B.). I motsetning til dette, 20 (R) -Rg3 viste ingen tydelig inhibering av proliferasjonen av begge celletyper i konsentrasjoner opp til 640 ug /ml (figur S1 AC).
neste undersøkt muligheten av 20 (S) -Rg3 og 20 (R) -Rg3 å påvirke hypoksi-indusert EMT. Som vist på fig. 1A, når de utsettes for en% O
2 i 24 timer både SKOV3 og 3AO celler gjennomgikk EMT er kjennetegnet ved en cellemorfologi endring fra den tett junctioned brostein-lignende utseende til en dissosiert spindel-lignende form. Denne endringen ble fulgt av en betydelig nedregulering av den epiteliale markør E-cadherin og et merket opp-regulering av mesenchymale markør vimentin som vist ved Western blot-analyse (Fig. 1B). Behandling av SKOV3 og 3AO celler med 20 (S) -Rg3 ved 80 ug /ml 160 ug /ml, henholdsvis, effektivt hindret morfologisk endring assosiert med hypoksi-indusert EMT (fig. 1A), i samsvar med et forhøyet nivå av E -cadherin og et redusert nivå av vimentin henhold hypoksiske betingelser (fig. 1B). I motsetning til behandling av SKOV3 med 20 (R) -Rg3 ved 80 ug /ml og 160 ug /ml, henholdsvis, ikke klarte å redde cellene fra gjennomgår EMT (fig. 1A), som gjenspeiles av uendrede nivåer av E-cadherin og vimentin etter hypoksisk kultur tilstand (fig. 1C). For ytterligere å bekrefte at 20 (S) -Rg3 blokkert hypoksi-indusert EMT, cellemobilitet ble evaluert i sårheling og
in vitro
migrasjon analyser. Som vist på fig. 2A og B, mens hypoksi uten tvil fremmet cellemobilitet og sårheling, vil disse effektene i stor grad motvirket av behandling av SKOV3 og 3AO celler med 20 (S) -Rg3.
(A) Celler ble først dyrket i vanlig tilstand i 24 timer. For hypoksi induksjon in vitro, ble SKOV3 og 3AO celler inkubert i en hypoksi kammer av 1% O
2, 5% CO
2 og 94% N
2 i ytterligere 24 timer uten (hypoksi) eller med RG3 (hypoksi + RG3) på angitte konsentrasjon i 24 timer. Kontrollene ble dyrket under normoksiske tilstand (normoxia) i 24 timer. Celle bildene ble tatt med et fasekontrastmikroskop (100 ×). (B) Proteiner av celler eksponert for normoxia, hypoksi og hypoksi pluss 20 (S) -Rg3 ble høstet, og uttrykk for E-cadherin og vimentin ble undersøkt ved western blot, ved hjelp av β-actin som en lasting kontroll. Hypoksi nedgang E-cadherin protein og øke vimentin protein, som ble reversert med 20 (S) -Rg3 co-behandling. (C) Effekten av 20 (R) -Rg3 på ekspresjon av EMT markører i SKOV3-celler. Det ble ikke observert noen effekt av 20 (R) -Rg3 på uttrykk for hypoksi-indusert EMT markører. Alle behandlinger i denne figur ble utført i tre eksemplarer.
(A) Celle bevegelighet detektert ved sårheling assay. Celler ble inkubert i henhold til normoksisk betingelse i 24 timer fulgt av skraping av konfluent cellelaget og utsette til normoxia, hypoksi eller hypoksi + 20 (S) -Rg3 i ytterligere 24 timer, henholdsvis. Nedleggelsen av grunnen ble overvåket under 24 timer og bildene ble vist på 0 t og 24 timer etter riper. (B) Cell mobilitet undersøkt av
in vitro
migrasjon analysen. Normoxically dyrkede celler ble sådd inn i millicells, etterfulgt av inkubering i 24 timer under normoxia, hypoksi eller hypoksi + 20 (S) -Rg3, respektivt. Antallet celler som passerte gjennom membranen pr 20 x forstørret linse ble talt og anvendt for å representere overføringskapasiteter celler. Alle behandlinger i denne figur ble utført i tre eksemplarer, og resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD. *
P
0,05, **
P
0,01,
t
-test
Til sammen våre funn sterkt. indikerer at 20 (S) -Rg3, men ikke 20 (R) -Rg3, er i stand til å reversere hypoksi-indusert EMT forandringer i cellemorfologi, cellemarkører, og cellemobilitet, og understreker dens potensial funksjon som en inhibitor av hypoksi-indusert EMT og EMT-mediert kreft metastasering.
20 (S) -Rg3 reduserer HIF-1α uttrykk gjennom å fremme HIF-1α protein nedbrytning i et PHD1 /VHL /proteasome avhengig måte
For å bedre forstå molekylære mekanismer som 20 (S) -Rg3 blokker hypoksi-indusert EMT i eggstokkreft celler, analyserte vi uttrykket av HIF-1α, en viktig regulator av EMT, både på transkripsjons og translasjonsforskning nivåer. Når dyrket i nærvær av 1% O
2 i 24 timer HIF-1α proteinnivå ble forhøyet i SKOV3 og 3AO celler, mens HIF-1α mRNA-nivået ble neppe påvirket. Behandling av cellene med 20 (S) -Rg3 i ellers identiske hypoksiske innstillinger markert undertrykket HIF-1α ekspresjon på proteinnivået med mRNA nivået uforandret, hvilket indikerer at HIF-1α ble post-transkripsjonelt regulert av 20 (S) -Rg3 ( fig. 3A og B).
(A) Total RNA fra celler eksponert for normoxia, hypoksi eller hypoksi + 20 (S) -Rg3, henholdsvis for 24 timer ble ekstrahert. Real-time RT-PCR-analyser ble utført for å analysere effekten av 20 (S) -Rg3 på HIF-1α mRNA nivå, og ble oppdaget ingen endringer. (B) celler dyrket i 24 timer under normoxia, hypoksi eller hypoksi + 20 (S) -Rg3, respektivt, ble undersøkt ved western blot for deres ekspresjon av HIF-1α. 20 (S) -Rg3 forstyrret hypoksi-indusert HIF-1α styrking. (C) MG132 blokkert inhibering virkningen av 20 (S) -Rg3 på HIF-1α proteinnivå. HIF-1α proteinnivåer ble sammenlignet blant hypoksiske celler, hypoksiske celler ko-behandlet med 20 (S) -Rg3, og cellene forbehandlet med 20 uM MG132 i 30 minutter etterfulgt av eksponering overfor hypoksi og 20 (S) -Rg3 i 24 timer. (D) Celler eksponert for normoxia, hypoksi og hypoksi i nærvær av 20 (S) -Rg3, respektivt, ble vurdert ved sanntids-PCR for transkripsjon av PHD1, PHD2, PHD3 og VHL. Etter 20 (S) -Rg3 behandling, transkripsjon av PHD1 og VHL gener, som ble nedsatt etter hypoksi, ble økt i begge SKOV3 og 3AO celler. (E) Protein ekstrakter fra behandlede celler ble undersøkt ved western blot for uttrykk for PHD1 og VHL, med protein fra normoxically dyrkede celler som kontroll og β-actin som lasting kontroll. PHD1 og VHL falt i hypoksiske celler. 20 (S) -Rg3 gjenvunnet sin til uttrykk under hypoksi tilstand. Alle behandlinger i denne figur ble utført i tre eksemplarer, og resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD. *
P
0,05, **
P
. 0,01,
t
-test
Siden HIF-1α protein reduksjon var nært beslektet med protein degradering via ubiquitin-proteasome vei, ble 26S proteasomet spesifikke proteasehemmer MG132 brukes til å undersøke om 20 (S) -Rg3 fremmet proteasomal nedbrytning av HIF-1α. Som vist på fig. 3C, forbehandling av 20 uM av MG132 i 30 minutter under hypoksiske betingelser gjenopprettes HIF-1α protein i SKOV3 og 3AO celler behandlet med 20 (S) -Rg3, som viser at 20 (S) -Rg3 nedregulert HIF-1α i proteasomet -avhengig måte. Som medlemmer av PHD familien og VHL proteinet er kjente faktorer som medierer ubiquitin /proteasome avhengig HIF-1α degradering, effekten av 20 (S) -Rg3 på mRNA-nivåer av PHD1, PHD2, PHD3 og VHL ble ytterligere undersøkt. Real-time PCR data viste at hypoksi konsekvent nedregulert PHD1, PHD3 og VHL (Fig. 3D). Denne effekten av hypoksi, særlig på PHD1 og VHL, men er reversert med 20 (S) -Rg3 i begge SKOV3 og 3AO celler. Som forventet, ble PHD1 og VHL proteinnivåer i stor grad gjenopprettet, slik tilfellet var for mRNA, etter behandling av SKOV3 og 3AO celler med 20 (S) -Rg3 for å motvirke hypoksi-formidlet nedregulering av PHD1 og VHL proteiner (fig. 3E).
for ytterligere å belyse rollene PHD1 og VHL i formidling aktiviteten til 20 (S) -Rg3 med hensyn til HIF-1α degradering, ble SKOV3 og 3AO celler transduced med siRNA-PHD1 (siPHD1) eller siRNA-VHL (siVHL). Stole på real-time PCR og Western blot, valgte vi to mest effektive siRNA for å kneble PHD1 (siPHD1-A og siPHD1-B) og VHL (siVHL-B og siVHL-C) henholdsvis (figur S2), etterfulgt av hypoksi stimulering og 20 (S) -Rg3 behandling. Som bestemt ved Western blot, knock-down av PHD1 eller VHL inhiberte pro-nedbrytningseffekt 20 (S) -Rg3 på HIF-1α (fig. 4A og B), med den virkning av siPHD1 mer betydelig enn det som siVHL på HIF -1α protein utvinning. Til sammen antyder disse resultatene at 20 (S) -Rg3 blokkert hypoksi-indusert EMT av eggstokkreft celler ved å aktivere PHD1- VHL- ubiquitin /proteasom-reaksjonsveien for å lette HIF-1α degradering.
Effekt av PHD1 ( A) og VHL (B) stillhet på 20 (S) -Rg3 undertrykt HIF-1α. SKOV3 og 3AO celler ble transient transfektert i 24 timer med siPHD1 eller siVHL, etterfulgt av inkubasjon i henhold hypoksiske betingelser i ytterligere 24 timer. Proteininnholdet av PHD1, VHL og HIF-1α ble deretter oppdaget ved hjelp av western blot. Alle forsøkene ble gjentas minst tre ganger.
20 (S) -Rg3 opphever hypoksi-indusert transcriptional undertrykkelse av E-cadherin gjennom undertrykke Snail
I løpet av EMT prosess, E-cadherin er ofte undertrykkes ved dens transkripsjonelle repressorer inkludert snegle som selv er transkripsjonelt aktiveres av HIF-1. For bedre å forstå hvordan 20 (S) -Rg3 hindret hypoksi-indusert nedregulering av E-cadherin undersøkte vi effekten av 20 (S) -Rg3 på sneglen. Foreta omvendt transkripsjon PCR resultater viste at hypoksi fremkalte en drastisk økning av Snail mRNA, som tilsynelatende ble hemmet av 20 (S) -Rg3 (Fig. 5A). Følgelig oppregulering av sneglen protein stimulert ved hypoksi ble alvorlig svekket av 20 (S) -Rg3 behandling (Fig. 5B).
(A) SKOV3-celler ble dyrket i normal tilstand i 24 timer, og deretter dyrket i 21% O
2 (normoxia) eller 1% O
2 (hypoksi) eller 1% O
2 og 80 mikrogram /ml 20 (S) -Rg3 (hypoksi + 20 (S) -Rg3) i ytterligere 24 timer. Snegl mRNA ble bestemt ved RT-PCR med β-aktin som en indre kontroll, og standardisert mot nivået til stede i normoxically dyrkede celler. Ekspresjon av sneglen ble øket på mRNA-nivå i SKOV3-celler etter stimulering hypoksi i 24 timer. 20 (S) -Rg3 behandling avskaffet Snail oppregulering forårsaket av hypoksi. (B) Celleekstrakter ble underkastet immunoblotanalyse å detektere sneglen proteinnivået, og β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Lavt nivå av Snail protein ble påvist i normoxically dyrkede celler, mens Snail protein ble økt i hypoksiske celler. 20 (S) -Rg3 redusert hypoksi-indusert Snail uttrykk. (C) Luciferase-analyse i SKOV3 og 3AO celler. E-cadherin promoter aktivitet ble betydelig redusert i hypoksiske celler. Reduksjoner i E-cadherin promoter aktivitet ble reversert av 20 (S) -Rg3 co-behandling. Aktivitet av E-cadherin promoter ildflue luciferase konstruksjoner ble normalisert til det av en kotransfektert
Renilla
luciferase konstruere. Alle behandlinger i denne figur ble utført i triplikat, og verdiene er presentert som gjennomsnitt ± SD for tre eksperimenter. *
P
0,05, **
P
0,01, for
t
-test
For ytterligere å undersøke om undertrykkelse. av Snail med 20 (S) -Rg3 var ansvarlig for utvinning av E-cadherin henhold hypoksiske forhold, ble en dual-luciferase reporter analysen utført. En E-cadherin promoter-luciferase reporter-konstruksjonen og en indre kontroll vektor er i stand til å uttrykke Renilla luciferase ble ko-transfektert inn i celler. Hypoksi ble funnet å gi omtrent 50% tap av luciferase signalintensiteten i begge SKOV3 og 3AO celler, mens 20 (S) -Rg3 trykkes hypoksiske effekter og forårsaket en betydelig økning i luciferase-intensitet (fig. 5C). Resultatene viste at 20 (S) -Rg3 blokkert hypoksisk hemming av E-cadherin promoter aktivitet.
20 (S) -Rg3 hemmer eggstokkreft vekst og EMT
in vivo
< Som vist på fig.
