Abstract
p21-aktivert kinase 3 (PAK3) og serum og glukokortikoid-indusert kinase 2 (SGK2) har tidligere blitt foreslått som viktige kinaser for humant papillomavirus positive (HPV +) livmorhalskreft celle overlevelse. Dette ble etablert ved hjelp av en shRNA knockdown tilnærming. For å validere PAK3 og SGK2 som potensielle mål for HPV + livmorhalskreftterapi, ble forholdet mellom shRNA-induserte fenotyper i HPV + livmorhalskreftceller og PAK3 eller SGK2 knockdown nøye undersøkt. Vi observerte at fenotyper av HPV + livmorhalskreftceller indusert av ulike PAK3 og SGK2 shRNAs ikke kunne bli reddet av komplement uttrykk for respektive cDNA-konstruksjoner. En knockdown-mangel PAK3 shRNA med en enkelt mistilpasning var tilstrekkelig til å hemme HeLa cellevekst i en lignende grad som vill-type PAK3 shRNA. HPV + livmorhalskreftceller ble også utsatt for flere ikke-menneskelige mål shRNAs. Avviket mellom PAK3 og SGK2 shRNA-indusert apoptose og genekspresjon knockdown, samt celledød stimulering, antydet at disse shRNAs drept HeLa cellene gjennom ulike veier som kanskje ikke er mål-spesifikke. Disse dataene viste at HPV + livmorhalskreft celledød ikke var assosiert med RNAi-indusert PAK3 og SGK2 knockdown, men sannsynligvis gjennom off-target effekter
Citation. Zhou N, Ding B, Agler M, Cockett M, McPhee F (2015) Overskrift av PAK3 og SGK2 shRNAs til humant papillomavirus Positive livmorhalskreftceller er uavhengig av PAK3 og SGK2 knockdown. PLoS ONE 10 (1): e0117357. doi: 10,1371 /journal.pone.0117357
Academic Redaktør: Xuefeng Liu, Georgetown University, USA
mottatt: 23 oktober 2014; Godkjent: 22 desember 2014; Publisert: 23 januar 2015
Copyright: © 2015 Zhou et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Finansiering av denne studien var fra Bristol-Myers Squibb. BMS gitt støtte i form av lønn for forfattere [NZ, BD, MA, MC og FM], men hadde ikke noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. De spesifikke roller disse forfatterne er formulert i § «forfatter bidrag». Siden Michele Agler ble en ansatt i Boehringer Ingleheim, har de gitt støtte i form av lønn for henne, men ikke har noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
Konkurrerende interesser: forfatterne har følgende interesser: Alle forfatterne av dette manuskriptet er eller var ansatt i Bristol-Myers Squibb Company (BMS) på det tidspunktet den beskrevne arbeidet ble utført, og en forfatter (Michele Agler) er nå en Boehringer Ingleheim (BI) ansatt. Finansiering av denne studien var fra Bristol-Myers Squibb. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Menneske papillomavirus (HPV) er små DNA tumor virus som infiserer hud eller slimhinne epitelceller [1 ]. Hittil har 170 HPV-typer klarlagt og ca 40 typer infisere kjønnsorgan [2]. Genital HPV-typer er seksuelt overførbare, og kan videre deles inn i lav-risiko og høyrisikogrupper i henhold til tilbøyelighet til sine induserte lesjoner å gå videre til malignitet. Vedvarende høy risiko humant papillomavirus (HPV) infeksjon er den viktigste årsaken til livmorhalskreft. Når integreres i vertsgenomet, høyrisiko HPV-typer oppviser deres onkogene virkninger primært gjennom den kontinuerlige ekspresjon av oncoproteiner E6 og E7 [3]. Mange aktiviteter er blitt beskrevet for begge disse oncoproteiner, hvorav de følgende er best karakteriserte og kritiske for transformasjon: E6 bindes til E6-assosiert protein (E6-AP) som resulterer i ubiquitinering og degradering av p53 tumor suppressor protein; E7 binder seg til lommen proteinfamiliemedlemmer, særlig retinoblastom protein (Rb) forårsaker inaktivering og degradering av Rb [4]. Interaksjoner mellom høyrisiko HPV-oncoproteiner og endogene cellulære proteiner er blitt vist å utløse cellesyklus deregulering og apoptose, og en etterfølgende økning i replikasjonen av transformerte celler, utvikler seg til kreft [5].
RNA interferens (RNAi ) har blitt et mye brukt verktøy for funksjonell genomstudier i virveldyr og virvelløse dyr [6]. RNAi virker ved å stanse et gen gjennom homolog korte forstyrrende dobbel tråd RNA (siRNAs), som utløser ødeleggelsen av tilsvarende budbringer-RNA (mRNA) av RNA-induced Slå kompleks (RISC) [7]. Den enkle, hastighet og kostnadseffektivitet har gjort det metoden for valg for tap-av-genet funksjon studier. Nylig ble high-throughput RNAi skjermer brukes til å utforske forskjellene i kinase krav til spredning og overlevelse mellom ulike kreftceller [8-10]. Et felles sett av kinaser ble observert som er nødvendig for spredning /overlevelse av tre livmorhalskreft cellelinjer (CaSki, HeLa og Siha), men unnværlig for primære humane forhud keratinocytter (HFKs). Det ble foreslått at p21-aktivert kinase 3 (PAK3) og serum og glukokortikoid-indusert kinase 2 (SGK2) var avgjørende for HPV positive (HPV +) livmorhalskreft celle overlevelse. Dødelighet forårsaket av SGK2 eller PAK3 uttømming i HPV E6 uttrykke celler var en konsekvens av p53 inaktivering [10].
PAK proteiner er serin /treonin kinaser og delt inn i to grupper. Gruppe I Paks inkluderer PAK1 gjennom tre; Disse kinaser binde seg til og blir katalytisk aktivert ved Rac og cdc42 GTPases [11, 12]. PAK3 er rikelig uttrykt i sentralnervesystemet (CNS), og er spesielt involvert i neuronal plastisitet og spinogenesis [13]. PAK3 regulerer også cellecyklusprogresjonen, neuronal migrasjon og apoptose [13-16]. Tap av funksjon av PAK3 er ansvarlig for X-bundet non-syndromic mental retardasjon [17, 18]. Den SGK familien av kinaser inkluderer SGK1 gjennom tre; SGK2 er den mest dårlig studert medlem av denne familien. I motsetning til SGK1 er SGK2 mRNA ikke indusert ved stimulering med serum eller glukokortikoid, og er til stede bare ved betydelige nivåer i lever, nyre og bukspyttkjertel og i lavere nivåer i hjernen [19]. Imidlertid, i likhet med SGK1 og 3, SGK2 aktiverer også visse kalium- og natriumkanaler, noe som tyder på en engasjement i reguleringen av prosesser som celleoverlevelse, neuronal eksitabilitet, og renal ekskresjon natrium [20, 21].
Spesifikk utslettelse av livmorhalskreftceller vil være av vesentlig interesse for den anti-kreft forskningsmiljø. For å bekrefte at blokkering funksjon SGK2 eller PAK3 av en p53-avhengig veien er assosiert med HPV + celle uttømming, hensiktsmessige kontroller er viktig når du bruker en RNAi tilnærming. Target spesifisitet har vært en kilde til bekymring siden den første anvendelsen av RNAi for funksjonell genomforskning. Ikke-spesifikke effekter har blitt rapportert at, i tillegg til de målrettede gener førte til endringer i ekspresjon av andre gener både på mRNA og proteinnivåene [22-24]. I tillegg har induksjon av gener som er involvert i den interferon reaksjon maskiner blitt observert [25-28], ytterligere utfordrende påliteligheten av RNAi i tap-av-funksjon studier. I denne studien, viser vi at fenotyper av HPV + livmorhalskreftceller indusert av PAK3 eller SGK2 shRNAs ikke kunne bli reddet av komplement uttrykk for respektive cDNA-konstruksjoner. HPV + cervikale kreftceller er også utsatt for flere ikke-humane target shRNAs. Disse dataene viser at tapet av levedyktig HPV + livmorhalskreftceller ikke korrelerer med RNAi-indusert PAK3 og SGK2 knockdown, som tidligere rapportert [10].
Materialer og metoder
Cells
HeLa (ATCC CCL-2) og CaSki (ATCC CRL-1550) celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) supplementert med 1% penicillin-streptomycin og 10% foster bovint serum.
plasmider
glyserol aksjer av bakterier eller plasmider husing PAK3, SGK2 og kontroll ble kjøpt fra Sigma (St. Louis (Luciferase, EGFP, Turbo-GFP og Non-target) Mission shRNA lentivirus vektorer (tabell 1), MO). De PAK3and SGK2shRNA uttrykk kassetter i et lentivirus ryggrad ble preget og validert tidligere av RNAi Consortium (TRC, Broad Institute, Cambridge, MA). Plasmider ble renset ved hjelp av Endo-free Maxi plasmid kit (Qiagene, Valencia, CA) i henhold til produsentens protokoll. Den doksycyklin (DOX) -inducible pLKO-Tet-On plasmid var en gave fra Dr. Susan Wee [29]. ShRNA sekvenser fra Mission shRNA lentivirus vektorer (Tabell 1) ble satt inn mellom AgeI /EcoRI områder av pLKO-Tet-On hjelp av standard kloning teknologi.
For å konstruere en knockdown-mangelfull kontroll PAK3 shRNA en rekke shRNA 3245 mutanter med ulike umake nukleotider til målet mRNA ble utformet og klonet til pLKO-Tet-On vektor. Etter kvantifisere nedgang på PAK3 mRNA kopier antall av disse mismatching shRNAs, ble en knockdown-mangel PAK3 shRNA (shRNA 3245 m15) med en enkelt mismatch i posisjon 15 (CCAAACTTCCAACAgAACA) identifisert.
Ultimate ORF menneskelige kloner for PAK3 (NCBI Reference Sequence: NM_002578.3), og SGK2 varianter 1 og 2 (NM_170693.1 og NM_016276.3) ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, California). ORF sekvenser av PAK3 og SGK2 ble innført i ekspresjonsvektoren pcDNA3.2-Mål med Gateway teknologi (Invitrogen). For redningsforsøk, ble PAK3 og SGK2 mutant-uttrykke plasmider konstruert huse 4 til 5 tause mutasjoner i shRNA komplementære sekvenser. Mutasjoner ble innført i pcDNA-PAK3 bruke QuikChange seterettet mutagenese kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) og følgende primerpar: pPAK-3244mut 5′-GATAGCTACTTGGTGGGTGACGAGTTGTGGGTAGTCATGGA ATACTT-3 «og 5′-AAGTATTCCATGACTACCCACAACTCGTCACCCACCAAGT AGCTATC-3; pPAK3-3245mut 5»-GGCACGATTACTCCA AACCAGCAATATAACA AAATTGGAACAG-3 «og 5′-CTGTTCCAATTTTGTTAT ATTGCTGGTTTGGAGT AATCGTGCC-3; pPAK3-5142mut 5»-GTTGATATCTGGTCTCTTGGCATCATGGCC ATCGAAATGGTGGAAGGTGAACC-3 «og 5′-GGTTCACCTTCCACCATTTCGAT GGCCATGATGCCAAGAGACCAGATATCAAC-3». Mutasjoner ble innført i pcDNA-SGK2 ved hjelp av følgende primerpar: pSGK2-2111mut 5′-GTAGAGCCTGA AGACACCACCAGCACCTTCTGTGGTACCCCTGA GT-3 «og 5′-ACTCAGGGGTA CCACAGAAGGTGCTGGTGGTGTCTTCAGGCTCT AC-3′; pSGK2-2112mut 5»-CA TTGGCTACCTGCACT CCTTGAATATTATTTACAG GGATCTGAAACC-3 «og 5′-GGTTTCAGATCCCTGTAAATAATGTTAAGTGAGTGCAGGTAGCCAATGGCG-3». Disse plasmider ble bekreftet å være motstandsdyktige overfor PAK3 eller SGK2 shRNA knockdown ved hjelp av qPCR for mRNA kvantifisering og Western immunoblot for protein kvantifisering.
Lentivirus produksjon
Rekombinante lentiviruses ble produsert av kotransfektering Lenti-X 293T celler (Clontech, Mountain View, California) med shRNA lentivirus vektor, emballasje plasmid og VSV-G uttrykker plasmid. I korthet, 3 x 10
6 Lenti-X-celler ble sådd i en 10 cm rett før transfeksjon. For hver 10 cm tallerken, 3 mikrogram shRNA-lentivirus plasmidet, 2,7 mikrogram pCMVΔ8.9 (pakking plasmid) og 0,3 mikrogram pVSV-G ble blandet med transitt-293 reagent (Mirus Bio, Madison, WI) i Opti-MEM og inkuberes ved romtemperatur i 20 minutter. Transfeksjon Blandingen ble tilsatt til cellene og inkubert over natten. Mediet ble aspirert og friskt medium tilsatt for å understøtte virusvekst. Kulturmediet inneholdt infeksiøs lentivirus ble samlet 48 timer etter transfeksjon, sentrifugert for å fjerne celleavfall, og filtrert gjennom et 0,45 mikrometer filtreringsenhet. Virus ble titrert med en p24 analysesett (Perkin Elmer, Waltham, MA) og puromycin utvalg metode anbefalt av Sigma (www.sigmaaldrich.com). Virale titere av ~ 3 x 10
7 cfu /ml ble oppnådd ved anvendelse av denne metoden; Viruset Utbyttet var like, uavhengig av inngangs shRNA ekspresjonsvektorene.
Celleviabilitet /proliferasjonsanalyse
Cellene ble sådd ut i 96-brønners plater ved 2000 celler /brønn i 100 ul medium før virusinfeksjon. Den smittsomme shRNA lentivirus ble fortynnet i medium inneholdende 10 ug /ml polybrene. Mediet ble fjernet fra cellene, og serielle fortynninger av 100 ul av lentivirus ble tilsatt til hver brønn. Etter 24 timer ble virus fjernet og erstattet med 100 ul friskt medium. For eksperimenter med den induserbare shRNAs, friskt medium inneholdende 20 ng /ml doksycyklin ble tilsatt. Cellelevedyktigheten ble målt 5 dager etter infeksjon ved hjelp av CellTiter-Blue-reagens (Promega, Madison, WI). Den CellTiter-Blue-reagens ble fortynnet i et forhold på 1: 4 i medium, og 20 ul av den fortynnede reagens ble tilsatt til hver brønn og inkubert ved 37 ° C i 2 timer før opptak av fluorescens (531
Ex /595
Em) på en Envision 2104 multilabel leser (Perkin Elmer, Waltham, MA). Levende celler ble talt ved hjelp av en Guava ViaCount analyse som beskrevet i produsentens protokoll (EMD Millipore, Billerica, MA).
Cell apoptose analysen
Seeding og infeksjon av celler ble utført som beskrevet for celleproliferasjonsanalyse, bortsett fra at 80 ul av medium /brønn ble tilsatt etter at viruset ble kastet. En apoptose Analysen ble utført 72 timer etter infeksjon ved hjelp av en caspase 3/7 glo assay kit (Promega, Madison, WI). I korthet, ble substratet av caspase 3/7 fortynnet i lyseringsbuffer og 20 ul av den fortynnede substrat ble tilsatt til hver brønn. Platen ble inkubert ved romtemperatur i 1 time og luminescens signal som kan leses på en Envision multi-etikett leser.
Cell autofagi analysen
HeLa-celler ble infisert med seriefortynnet lentiviral SGK2 shRNA samt som med en styre ikke-target (NT) shRNA (tabell 1). Virus ble fjernet etter 24 timers infeksjon og cellene ble dyrket i ytterligere 48 timer. Rapamycin (1 uM, EMD Chemicals, Gibbstown, NJ) ble inkludert som en kontroll på hver plate, og det tilsatt 24 timer før platene ble behandlet for avbildning. Celleplatene ble fiksert ved tilsetning av 20 ul av fikseringsbuffer [(4% volum /volum formaldehyd i Dulbeccos fosfatbuffret saltoppløsning (DPBS)] direkte til analysemedium og inkubert i 15 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av 2 vaskinger med DPBS. cellene ble immunfarget for induksjon av autophagy ved permeabiliseringen i 10 minutter med 0,1% Triton X-100 i en 1% bovint serumalbumin (BSA) /DPBS-buffer. en blokkering buffer på 5% føtalt bovint serum (FBS) i DPBS ble brukt under antistoff-inkubasjoner som besto av en LC3B primært antistoff (cellesignalisering Technologies, Danvers, MA), etterfulgt med en Alexa 488-konjugert sekundært antistoff (Invitrogen, Carlsbad, CA). kjernen ble farget med Hoescht fargestoff (Invitrogen, Carlsbad , CA) og aktin ble farget med Alexa 647-phalloidin (Invitrogen, Carlsbad, California) for å identifisere cellen.
Bilder ble ervervet på konfokal Opera høyt innhold Imager (Perkin Elmer, Watham, MA). A 20x nedsenking i vann objektiv (20x water_Lucplfln NA = 0,7), ble anvendt med en 488 diodelaser (eksitasjon filter: λ = 520 nm, 75 nm båndpass), en ikke-konfokal UV-lyskilde (eksitasjon filter λ = 450 nm, 50 nm Båndpass) og en 640 diodelaser (eksitasjon filter: λ = 690, 50 nm båndpass). For hver eksperimentell betingelse, 12 felt /brønn (~ 1200 celler) ble anskaffet og analysert ved hjelp av en modifisert Acapella (Perkin Elmer) algoritme måle intensiteten av LC3B flekker i cytoplasma området normalisert på en per celle basis.
fenotype redning
celler ble sådd ut ved 2 x 10
5-celler /brønn på 6-brønners plater på dagen før transfeksjon. Disse cellene ble transfektert med seriefortynnet PAK3 eller SGK2 mutant eller villtype-uttrykkende plasmider ved hjelp Fugene 6 (Roche, Indianapolis, IN) som en transfeksjon reagens. Etter 6 timer ble mediet fjernet transfeksjon. Celler ble infisert med shRNA-uttrykker lentivirus (1 ml) som hadde blitt fortynnet 1:10 eller 1:15 i medium inneholdende 10 ug /ml polybren, og deretter inkubert ved 37 ° C over natten. Cellene ble trypsinert og telt, og sådd ut ved 2000 celler /brønn i 96-brønners plater. For analyser overvåking apoptose og cellelevedyktigheten ble cellene høstet ved 72 timer og 5 dager etter infeksjon, henholdsvis, ved hjelp av de tidligere nevnte fremgangsmåter.
Kvantifisering av PAK3 og SGK2 mRNAer
Celler ble sådd ut ved 2 x 10
5-celler /brønn på 6-brønners plater dagen før infeksjon med shRNA-uttrykker lentivirus. Den infeksjon eller transfeksjon /infeksjon ble utført som tidligere beskrevet. Total RNA ble ekstrahert fra cellene 72 timer etter infeksjon ved bruk av RNeasy Mini Kit pluss pluss-DNase I-fordøyelse (Qiagen, Valencia, CA) ifølge produsentens protokoll. Ekstrahert total RNA (2-5 ug) ble reverstranskribert i et totalt volum på 20 ul ved hjelp av Superscript III First-Strand Synthesis System (Invitrogen, Carlsbad, CA). Resulterende cDNA ble lagret ved -20 ° C inntil bruk. PAK3 (Applied Biosystems Taqman Gene Expression analyse ID: Hs00176828_m1) og SGK2 (ID: Hs00367636_m1) ble utført for å kvantifisere mRNA ved hjelp av en 9700HT Real-time PCR system (Applied Biosystems, Carlsbad, California). GAPDH mRNA ble også målt i samme brønn for å standardisere prøven lasting.
Kvantifisering av PAK3 og SGK2 proteiner
Protein nivåer ble bestemt ut fra de samme transfeksjon og smitteforsøk som brukes for å kvantifisere mRNA knockdown. Cellene ble høstet 72 timer etter infeksjon, ble vasket en gang med fosfat-bufret saltvann (PBS), og lysert i lyseringsbuffer (25 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1% Igegel CA-630, 0,25% natriumdeoksycholat, 10% glyserol, 25 mM NaF, 10 mM MgCl
2, 1 mM EDTA, 1 mM natriumvanadat, en tablett /50 ml proteaseinhibitor) på is i 30 minutter. Lysater ble klaret ved sentrifugering (15.000 rpm) ved 4 ° C i 10 minutter. Totalt protein, 80 ug, ble blandet med en lastebuffer og kokt ved 100 ° C i 10 minutter. Prøvene ble underkastet en 4-15% natrium-dodecyl-sulfat-polyakrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE) og deretter elektroforetisk overført til PVDF-membraner. Etter at ikke-spesifikke bindingsseter ble blokkert med 5% fettfri melk, ble membranen inkubert med primære antistoffer (1: 1000 fortynning, anti-humant PAK3 monoklonalt antistoff N-19 og anti-humant SGK2 monoklonalt antistoff 3Q-2, Santa Cruz Biotechnology , Santa Cruz, CA) ved 4 ° C over natten. Membranen ble vasket tre ganger og inkubert med de respektive sekundære antistoff i 1 time ved romtemperatur. De immunreaktive bånd ble visualisert med den forbedrede chemiluminescence (ECL) reagens i henhold til produsentens instruksjoner. Protein lasting ble standardisert ved å inkludere GAPDH protein som kontroll.
Resultater
RNAi reduserer PAK3 og SGK2 uttrykk
For å validere effekten av PAK3 shRNA på PAK3 uttrykk, fire uavhengige PAK3 shRNAs ble brukt for å målrette ulike regioner av PAK3 mRNA. HeLa-celler ble infisert med lentiviruses skjuler de respektive PAK3 shRNAs. Som et konkret kontroll, ble lentivirus huse en NT shRNA ansatt. Effektiviteten av lentivirus infeksjon ble optimalisert ved hjelp av en Turbo-GFP uttrykk lentivirus vektor; en infeksjon rate på 90% ble oppnådd. En betydelig knockdown av PAK3 mRNA ble observert i HeLa-celler etter infeksjon med hver av de fire testet shRNAs (Fig. 1A). Lignende resultater ble også observert ved bruk av induserbar lentivirus uttrykke PAK3 shRNAs i CaSki celler (data ikke vist). Siden PAK3 proteinet er uttrykt ved svært lave nivåer i HeLa og CaSki-celler, og vandrer med Pak2, som også kan detekteres av N-19 PAK3 antistoff (se Materialer og Metoder), ble PAK3 protein knockdown undersøkt i et PAK3 høy ekspresjon liten carcinoma-celle-celle lunge, DMS-79. Alle av de testede PAK3 shRNAs betydelig redusert både PAK3 mRNA og proteinnivåene i DMS-79-celler (Fig. 1 B og C).
mRNA-nivåer ble bestemt ved kvantitativ revers transkripsjon PCR-analyse ved 72 timer etter infeksjon med den respektive shRNA vektorer; kontroll betegner infeksjon med en vektor som koder for ikke-target-shRNA. Hver bar på bar grafen representerer gjennomsnittet ± standardavvik av 4 replikater fra en av tre uavhengige eksperimenter med lignende resultater. mRNA nivåer ble normalisert med GAPDH uttrykk; PAK3 og SGK2 protein uttrykk ble bestemt 72 timer etter infeksjon ved hjelp av en vestlig immunoblot. GAPDH protein fungerte som et protein lastekontroll for hver prøve. (A) PAK3 shRNA redusert PAK3 mRNA nivåer i HeLa celler; (B) PAK3 shRNAs redusert PAK3 mRNA uttrykk i DMS-79 celler; (C) PAK3 shRNAs redusert PAK3 protein uttrykk i DMS-79 celler. DMS-79 cellelysater ble analysert med PAK3 monoklonalt antistoff N-19; (D) SGK2 shRNAs redusert SGK2 mRNA nivåer i HeLa celler; (E) SGK2 shRNAs redusert SGK2 mRNA nivåer i GTL16 celler; (F) SGK2 shRNAs redusert SGK2 proteinnivået i GTL16 celler. GTL16 cellelysater ble analysert med SGK2 monoklonalt antistoff 3Q-2.
Lignende eksperimenter ble utført for å validere SGK2 shRNAs. SGK2 mRNA-ekspresjon i HeLa-celler ble dramatisk redusert med fire SGK2 shRNAs (Fig. 1D) som var SGK2 mRNA-ekspresjon i CaSki-celler ved induserbar SGK2 shRNAs (data ikke vist). Som med PAK3, er SGK2 protein uttrykk for lavt til å bli påvist i HeLa og CaSki-celler. Knockdown av SGK2 protein ble derfor evaluert i GTL16, en SGK2 høy ekspresjon gastrisk karsinom-cellelinje. SGK2 shRNAs betydelig redusert SGK2 mRNA og protein ekspresjon i GTL16 celler (Fig. 1E og 1F). Dermed ble knockdown av PAK3 og SGK2 av deres korresponderende shRNAs bekreftet.
fenotyper indusert av PAK3 og SGK2 lentiviral shRNAs
HeLa-celler ble infisert med PAK3 og SGK2 shRNA-uttrykk lentiviruses å bestemme shRNA-indusert fenotyper. CaSki celler ble infisert med induserbar PAK3 og SGK2 shRNA uttrykker lentiviruses. NT shRNA og en lentivirus vektor som ikke inneholder noe shRNA ekspresjonskassett ble anvendt som kontroller. For fenotypen studien ble lentivirusinfeksjon med og uten sentrifugering sammenlignet. Selv bedre infeksjon effektivitet kan oppnås ved spin-inokulering med den samme mengde av virus, toksisiteten forbundet med NT shRNA og selv ikke shRNA viruskontroll økte proporsjonalt (data ikke vist). Derfor ble cellene infisert uten sentrifugering. Cellene ble delt i forskjellige platene 24 timer etter infeksjon for caspase 3/7 og celleproliferasjon /levedyktighet analyser. En tidsforløpet av caspase 3/7 ekspresjon indusert ved forskjellige PAK3 shRNAs angitt peak ekspresjon 72 timer etter infeksjon (figur 2A;. Tidsforløpet data ikke vist). Både PAK3 og SGK2 shRNAs redusert HeLa og CaSki celleviabilitet (Fig. 2B og 2D, data ikke vist for CaSki-celler) som tidligere rapportert [10]. De fire PAK3 shRNAs variert i deres evne til å indusere HeLa celle apoptose (Fig. 2A). Den shRNA, 3244, var den mest potente ved å utløse apoptose, mens shRNA 3245 viste marginal induksjon av apoptose, til tross for sin evne til å undertrykke sterkt PAK3 mRNA i HeLa-celler (Fig. 1A). I tillegg shRNA 3245 inhiberte celleproliferasjon /levedyktighet på lignende måte som den sterkeste apoptose indus, shRNA 3244 (fig. 2A og 2B), som indikerer at de forskjellige PAK3 shRNAs indusert forskjellige veier som fører til celledød. Avviket mellom apoptose-induksjon og genekspresjon knockdown, samt celledød stimulering, ble også observert med SGK2 shRNA 2112 (fig. 2C og 2D).
(A) HeLa-celler ble infisert med PAK3 shRNA ved en 01:10 fortynning. Cell apoptose ble bestemt ved hjelp av en caspase 3/7 glo luciferase assay 72 timer etter smitte. Søylediagrammet viser fold endringer av caspase 3/7 aktivitet (luminescens) indusert av ulike shRNAs sammenlignet med en ikke-shRNA kontroll. Data representerer gjennomsnittet ± standardavvik av fire replikater fra en av to separate forsøk med lignende resultater; (B) Hemming av spredning /levedyktighet av HeLa celler ved PAK3 shRNAs ble vurdert ved hjelp av en CellTiter blå assay 5 dager etter smitte. Søylediagrammet presenterer prosent levedyktighet (fluorescens) av lentiviral shRNA-infiserte celler sammenlignet med en kontrollgruppe lentivirus uten shRNA uttrykk. Data representerer gjennomsnittet ± standardavvik for tre uavhengige eksperimenter; (C) SGK2 lentivirale shRNAs induserte HeLa celle apoptose. Data representerer 4 replikater fra en av to separate forsøk med lignende resultater; (D) SGK2 shRNAs hemmet spredning /levedyktighet av HeLa-celler. Data representerer gjennomsnittet ± standardavvik for to uavhengige eksperimenter; (E) SGK2 lentiviral shRNAs indusert autofagi av HeLa-celler. Celler ble infisert med SGK2 lentiviral shRNAs på 1:16 og 1:32 fortynning, henholdsvis. 1fiM Rapamycin ble inkludert som en autofagi kontroll på hver plate. Celle plater ble fikset 72 time etter infeksjon og immunostained for induksjon av autofagi med et LC3B primært antistoff, etterfulgt med en Alexa 488-konjugert sekundært antistoff. Bilder ble tatt ved hjelp av konfokal Opera høyt innhold Imager. Bilder av SGK2 lentiviral shRNA-infiserte HeLa-celler (~ 1200 celler /brønn) ble tatt til fange og celle tall telles. Den gjennomsnittlige intensiteten på fargingen LC3B per celle ble målt og beregnet ved hjelp av en modifisert Capella (Perkin Eimer) algoritme. Den søylediagram som viser den gjennomsnittlige ± standardavvik for LC3B fargeintensitet avledet fra to brønner.
Autophagy er en av hovedmekanismene for å opprettholde cellulær homeostase og er ikke direkte forbundet med celledød, i stedet for en selv -cannibalisation pathway [30]; Patel et al., 2012). Alle shRNAs testet i våre eksperimenter, inkludert fire SGK2 shRNAs og kontroll shRNA (NT shRNA), indusert autophagic markør LC3B konvertering når sammenlignet med ingen infeksjonskontroll (Fig. 2E). De tre SGK2 shRNAs hvert viste en sterkere evne til å indusere autofagi i HeLa celler enn NT shRNA mens én (shRNA2112) oppførte seg på samme måte som NT shRNA. SGK2 shRNA-indusert autofagi markør (uttrykk for LC3B) ikke korrelerer med reduksjon i celletallet (sammenlign fig. 2E med 2D), også tyder på at de ulike SGK2 shRNAs mediert forskjellige veier som fører til celledød.
PAK3 knockdown-mangel shRNA hemming av HeLa cellevekst
for ytterligere å avklare om PAK3 shRNA-indusert HPV + celledød ble assosiert med PAK3 knockdown, en PAK3 knockdown-mangel shRNA med et enkelt mismatch til PAK3 mRNA ble testet for dens evne til å indusere celledød i HeLa og CaSki-celler. Tilsetning av doksycyklin til NT shRNA-infiserte HeLa-celler har ikke redusere PAK3 mRNA-ekspresjon eller påvirke cellevekst (fig. 3). En betydelig reduksjon i PAK3 mRNA-nivåer hos doksycyklin-indusert ekspresjon av shRNA 3245 ble observert, mens PAK3 mRNA ikke ble påvirket av doksycyklin-indusert ekspresjon av shRNA 3245 M15 (fig. 3A). Imidlertid, både villtype og mutant PAK3 shRNAs kraftig hemmet HeLa-celleformering /levedyktighet på samme måte (fig. 3B), hvilket antyder at HeLa celledød indusert ved PAK3 shRNA ikke er assosiert med PAK3 knockdown. Et lignende resultat ble også observert med den CaSki-cellelinjen (data ikke vist).
PAK3 mRNA-nivåer ble bestemt ved kvantitativ revers transkripsjon PCR-analyse ved 72 timer etter infeksjon med de respektive shRNA virus. Levende celletall ble tellet 5 dager etter tilsetning av 20 ng /ml doksycyklin. Den søylediagram som representerer gjennomsnittet ± standardavvik for 3 replikater fra en av to uavhengige forsøk med lignende resultater. PAK3 mRNA nivåer ble normalisert med GAPDH uttrykk; (A) Virkning av villtype (3245) og mutant PAK3 shRNA 3245 (3245 M15) på PAK3 mRNA-nivåer i HeLa-celler; (B) Effekt av villtype (3245) og mutant PAK3 shRNA 3245 (3245 m15) på HeLa cellevekst.
shRNAs som ikke målrette menneskelige gener også hemme spredning /levedyktighet av HPV + livmorhalskreft celler
for å avgjøre om HPV + livmorhalskreftceller er spesielt sårbare for PAK3 og SGK2 shRNAs, vi undersøkt fire kontroll lentivirus shRNA vektorer som ikke målrettes menneskelige gener (Luc, EGFP, T-GFP og NT shRNAs, se tabell 1) for deres effekt på spredning /levedyktighet av HeLa og CaSki celler. Ingen knockdown av PAK3 og SGK2 mRNA-ekspresjon ved hjelp av styre shRNAs ble observert (data ikke vist). Hver virus ble titrert for å kvantifisere dets evne til å indusere inhibering av HeLa og CaSki-celleproliferasjon /levedyktighet. PAK3 og SGK2 shRNAs ble også inkludert i studien for sammenligning. Tre av kontroll shRNAs, bortsett NT shRNA, undertrykkes HeLa cellevekst med potenser sammenlignbare med PAK3 og SGK2 shRNAs (Fig. 4A). To kontroll shRNAs (Luc og EGFP shRNAs) indusert vekst hemming av CaSki (Fig. 4B). Videre ble HeLa og CaSki celleviabilitet tap observert ved anvendelse av Luc og EGFP shRNAs i en DOX-induserbar shRNA ekspresjonsvektor (data ikke vist). Dermed ble HeLa og CaSki celler vist seg å være utsatt for shRNAs som ikke målrettes menneskelige gener, noe som tyder på at veksten hemming av disse cellene kan induseres av shRNAs gjennom ikke-spesifikke genet veier.
Celleviabilitet ble vurdert ved hjelp en CellTiter Blå assay 5 dager etter smitte. Hver av virus ble titrert for infeksjon for å bestemme dets potens til å indusere HeLa-celleformering /levedyktighet inhibering. Prosent cellelevedyktighet (fluorescens) i nærvær av lentiviral shRNAs ble beregnet ved å sammenligne med en kontroll uten lentivirus shRNA uttrykk. Data representerer gjennomsnittet ± standardavvik av fire replikater fra en av tre uavhengige eksperimenter med tilsvarende resultater; (A) Inhibering av HeLa celle proliferasjon /levedyktighet; (B) Hemming av spredning /levedyktighet CaSki celler.
fenotyper indusert av PAK3 og SGK2 shRNAs kunne ikke bli reddet med de tilsvarende transgene uttrykk
Det er iboende begrensninger på spesifisitet av RNAi, for eksempel dobbel tråd RNA-indusert interferon respons og off-target effekter som følge av mangelfull hybridisering når en shRNA fungerer som en miRNA. En ideell eksperiment bør vise at uttrykket av en mutert versjon av målrettede genet ikke anerkjent av shRNA går tilbake eller redder fenotype. Som et første skritt, ble PAK3 uttrykk preget i HeLa celler. Fire PAK3 spleisevarianter finnes hos pattedyr [31]. Alle variantene er uttrykt i hjernen mens det i noen vev, slik som nyre og lever, er bare PAK3 variant A uttrykt [31]. Ved hjelp av variant-spesifikke RT-PCR-metode som tidligere er beskrevet [31], vi bekreftet at bare variant A er uttrykt i HeLa-celler (Fig. 5A). CDNA-kodende område av PAK3 fra HeLa-celler er identisk med GenBank-sekvensen NM_002578. Med hensyn til SGK2, dets ekspresjon i HeLa-celler som var for lavt til å være kjennetegnet; Derfor ble ekspresjonsplasmider for de to rapporterte SGK2 varianter som brukes for rednings studien [19].
