Abstract
microRNAs, ikke-kodende 20-22 nucleotide enkelt-strandet RNA, resultere i translasjonell undertrykkelse eller degradering og genet Slå av sine mål gener, og bidra vesentlig til regulering av genuttrykk. I denne studien rapporterer vi at Mir-182 uttrykk var signifikant oppregulert i prostata kreft vev og fire cellelinjer, sammenlignet med benign prostatahyperplasi vev og normal prostata epitel (RWPE-1) celler. Ektopisk overekspresjon av MIR-182 fremmer betydelig spredning, øker invasjonen, fremmer G1 /S cellesyklus overgang og reduserer tidlig apotosis av PC-3 celler, mens undertrykkelse av MIR-182 sank spredning og invasjon, hemmer G1 /S cellesyklus overgang og økning tidlig apotosis av PC-3 celler. I tillegg viste vi at MIR-182 kan nedregulere uttrykk for NDRG1 ved direkte rettet mot den NDRG1 3′-utranslaterte område. Som konklusjon, våre resultater tyder på at MIR-182 spiller en viktig rolle i spredning av humane prostatacancerceller ved direkte å undertrykke tumor lyddemper genet NDRG1. Vi avdekket en ny epigenetisk regulering av NDRG1
Citation. Liu R, Li J, Teng Z, Zhang Z, Xu Y (2013) overexpressed mikroRNA-182 Fremmer spredning og invasjon i prostatakreft PC-3 celler ved down-Regulering N-myc Nedstrøms regulert Gene 1 (NDRG1). PLoS ONE 8 (7): e68982. doi: 10,1371 /journal.pone.0068982
Redaktør: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, USA
mottatt: 07.04.2013; Akseptert: 8. juni 2013, Publisert: 16.07.2013
Copyright: © 2013 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (No: 30800226), Tianjin Science and Technology Commission (No: 12ZCDZSY17200) og andre sykehus i Tianjin Medical University (No: Y1003). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) fortsetter å være en av de største helseproblemer for den aldrende mann, med anslagsvis 238,590 nye tilfeller og 29,720 kreftrelaterte dødsfall som forventes i 2013 i USA alene [1]. Selv om kinesiske menn tilhører lav risikogruppen for å ha PCA har forekomsten og dødeligheten økt betydelig på grunn av aldringen av befolkningen, endringer i livsstil og andre årsaker. PCA har blitt en av de vanligste kreftformen hos menn over hele verden, med sterkt varierende priser av tumorprogresjon og respons på behandling. Dersom svulsten er begrenset til prostata, kan pasienten behandles ved kirurgisk fjerning av tumoren eller ved bestråling, med høy effektivitet. I motsetning terapi for ubegrensede tumorer utgjør fremdeles et stort problem. Standard behandling for disse pasientene er antiandrogener for å oppnå total androgen blokade [2]. Dessverre, at svulster fremgang og dermed omgå behandling er en svært hyppig hendelse, og det er ingen effektive behandlinger for kastrering resistente PCa (CRPC) pasienter, men urolog prøver å bruke kjemoterapeutika. Selv om både genetiske og miljømessige faktorer er vurdert å være viktige faktorer, de molekylære mekanismene for PCa utvikling og progresjon fortsatt i stor grad unknown.Therefore, bedre forståelse av patogenesen av PCa og utforske nye intervensjons mål for PCa er sterkt krevende oppgaver.
microRNAs (mirnas) er en gruppe av små (ca. 20-22 nukleotider) endogene ikke-kodende RNA. Moden mirnas negativt regulere deres målgener ved ufullkommen komplementær sekvens sammenkobling til 3′-utranslatert region (UTR) av målgener som resulterer i enten mRNA degradering eller translasjonell undertrykkelse. Tallrike studier har vist at avvikende ekspresjon av mirnas er nært forbundet med spredning, invasjon, metastase og prognose av forskjellige krefttyper, inkludert PCa, brystkreft, gliomer og lungekreft [3] – [6]. PCa progresjon er assosiert med endret ekspresjon av flere onkogener og tumorundertrykkere, og mirnas kan potensielt regulerer disse genene; har imidlertid forholdet mellom mirnas og PCa bare begynte å bli belyst i de senere år [7]. Mer enn 50 mirnas rapporteres å være involvert i PCa; imidlertid har de fleste av de nåværende data tyder på at kun et lite antall av disse er knyttet til patogenesen av PCa [8]. . Flere mirnas bør velges og studert for å bedre forstå utviklingen av PCa
Til dags dato, mange artikler undersøkt miRNA uttrykket i PCA prøver, men resultatene var svært inkonsekvent [9] – [15]. Ingen miRNA microarray gjenkjenning resultater ble rapportert fra kinesiske PCA prøvene så langt. I denne studien, må vi først vist de mirnas knyttet til PCa av miRNA mikromatriser, og ifølge de foreløpige resultatene, fant vi at mikroRNA-182 (MIR-182) ble overuttrykt i PCA vev. Undersøkelser viste at MIR-182 kan fremme melanom metastase ved å undertrykke FOXO3 og mikroftalmi assosierte transkripsjonsfaktor [16], i mellomtiden, MIR-183-96-182 klyngen ble overuttrykt i prostatavevet og kan regulere Sink homeostase i prostataceller [17]. MiR-182 ble antatt å være en viktig oncomiR. Imidlertid kan MIR-182 suppresse lunge tumorigenesis gjennom nedregulering av RGS17 uttrykk in vitro [18]. Videre, en ny studie viste at MIR-182 og mikroRNA-200a kunne kontrollere G-protein subenhet alpha-13 (GNA13) uttrykk og celle invasjon synergi i PCA celler [19]. Disse inkonsekvente resultater indikerer at funksjonen til mir-182 er kompleks og videre studier er nødvendig. I denne studien viste vi at MIR-182 forfremmet PCa PC-3 celler spredning og invasjon av direkte rettet mot 3′-UTR av N-myc nedstrøms regulert gen 1 (NDRG1, NM_006096.3) mRNA. Våre resultater tyder på at Mir-182 kan spille en viktig rolle i utvikling og progresjon av PCa.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Studiet ble godkjent av den etiske styret i Second Hospital of Tianjin Medical University. Alle prøver ble innhentet fra pasienter som registrerte informert samtykke godkjenne bruk av sine vev for forskningsformål etter operasjonen.
Prostata vevsprøver
Fem PCA vev ble samlet etter radikal prostatektomi ved Institutt for Urologi av sykehuset mellom januar 2010 og desember 2012. Ingen av pasientene hadde fått neoadjuvant hormonbehandling før operasjonen. Tre godartet prostatahyperplasi (BPH) vev ble samlet etter suprapubisk enucleation av prostata. Friske prostata vev ble prøvetatt direkte etter kirurgisk fjerning av gland.These prøvene ble umiddelbart frosset i flytende nitrogen og anvendt for miRNA microarray eksperimenter. En diagnostisk H . E-delen var forberedt på å verifisere svulst innhold og kun saker med mer enn 90% svulstvev ble vurdert for videre analyse
miRNA microarray analyse
Mirna isolasjon kits (Ambion) var brukes til å isolere total RNA med beriket mirnas fra prostata vevsprøver. Microarray analyse ble utført med en tjenesteleverandør (LC Sciences, Houston, TX, https://www.lcsciences.com) som beskrevet tidligere [20]. De med foldendring 2 eller -2 og P-verdier og 0,05 (t-test) ble ansett som forskjellig uttrykt miRNAs.
Cell Kultur
Menneskelig PCA cellelinjer LNCaP, PC-3, DU145, 22Rv1 og normal prostata epitel cellelinje Real-time RT-PCR ble brukt for bekreftelse av noen forskjellig uttrykt miRNAs. RWPE-1 ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) og holdt i vårt laboratorium. Celler ble dyrket i RPMI-1640 (Gibco) supplementert med 10% føtalt kalveserum og penicillin (100 U /ml). Kulturer ble holdt under en atmosfære som inneholder 5% CO
2.
Total RNA Utvinning og Real-time RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp Trizol Reagens (Invitrogen, CA, USA ). cDNA ble syntetisert ved hjelp av M-MLV mikroRNA Reverse Transcription Kit (Promega, USA). Real-time RT-PCR ble utført med SYBR® Premiks Ex Taq ™ (Takara, Biotech Co., Ltd, Dalian, Kina). RT primer for MIR-182 var 5’GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACAGTGTGA -3 «, PCR-primer for MIR-182 var 5′-TGCGGTTTGGCAATGGTAGAAC-3′ (fremover), 5»-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3 «(bakover). Ekspresjonsnivået var normalisert til U6. RT primer for U6 var 5’GTCGTATCCA GTGCAGGGTCCGAGG TGCACTGGATACGACAAAAT ATGG -3 «, PCR-primer for U6 var 5’TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC -3» (fremover), 5’CCAGTGCAGGGTCCGAGGT -3 «(bakover). PCR ble utført under de følgende betingelser: 94 ° C i 4 minutter, etterfulgt av 40 sykluser ved 94 ° C i 30 s, 50 ° C i 30 s og 72 ° C i 40 sek. Hver prøve ble kjørt i tre eksemplarer.
Western blotting
Western blotting ble utført for å bestemme NDRG-1 protein uttrykk. Alle proteiner ble løst på en 8% SDS-denaturert polyakrylamidgel og ble deretter overført på en nitrocellulosemembran. Membraner ble inkubert med blokkeringsbuffer i 90 min ved romtemperatur og deretter inkubert med et antistoff mot NDRG-1 eller beta-tubulin med Blotto over natten ved 4 ° C. Membranene ble vasket og inkubert med en pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundært antistoff. Proteinekspresjon ble bestemt ved forsterket kjemiluminescens og eksponering for kjemiluminescens film. Den LabWorks bilde oppkjøpet og analyse programvare (UVP, LLC) ble brukt til å kvantifisere bandet intensiteter. Alle antistoffer ble kjøpt fra Saier Bioteknologi (Tianjin, Kina).
Cell Transfeksjon
transfections ble utført ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. Kort fortalt ble PC-3 celler belagt i seks brønners plater og dyrkes uten antibiotika til 60-80% samløpet. Hver godt mottatt 10 mL av lipofektamin reagens og 50 pmol av syntetiske Mir-182 etterligner (GenePharma Co., Ltd, Shanghai, Kina), syntetiske negative kontroll mirnas (MIR-182 etterligner-NC), syntetisk Mir-182-inhibitor sekvens eller syntetisk MIR-182-hemmer negativ kontroll (MIR-182 inhibitor-NC). Sekvenser av MIR-182 etterligner, ble Mir-182 etterligner-NC, MIR-182-hemmer og MIR-182 inhibitor-NC vist i tabell 1. Alle ligner og hemmere ble merket med FAM (carboxyfluorescein). Seks timer etter transfeksjon, PC-3 celler ble observert ved bruk av fluorescens mikroskop og serumfritt medium ble endret for å fullføre medium.
MTT analysen
PC-3 celler transfektert med enten speil 182 etterligner eller MIR-182 etterligner-NC eller MIR-182-inhibitor og MIR-182-inhibitor-NC ble sådd ut på 96-brønners plater med 1 x 10
4 celler /brønn. Levedyktige celler ble målt 1, 2, 3, 4 og 5 dager etter plettering. Etter inkubasjon med 3- (4, 5- dimethylthiazolyl-2) -2, 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) ble cellene lysert i 150 ml 100% dimetylsulfoksyd (DMSO) og UV-synlige absorbansen ble avlest ved 490 nm under anvendelse av 96-brønners plateleser. Hver prøve ble kjørt i tre eksemplarer.
Cell Cycle Analysis
PC-3 celler transfektert med enten Mir-182 etterligner eller Mir-182 etterligner-NC, eller MIR-182-hemmer og speil 182 inhibitor-NC ble høstet 72 timer etter transfeksjon, ble vasket med kald fosfatbufret saltløsning (PBS), og fiksert i 1 ml 70% etanol. Etter inkubering over natten ved 4 ° C i etanol, ble cellene vasket i PBS og suspendert i 500 ml propidine jodid (PI) 30 min før flowcytometri. Populasjoner i G0-G1, S og G2-M fasen ble målt ved flowcytometri (BD Biosciences, USA) og dataene ble analysert ved hjelp av Multicycle-DNA Cell Cycle Analyserte SOFTWARE.THE måling ble utført i tre eksemplarer.
Påvisning av Cell Tidlige apoptose
PC-3 celler transfektert med enten Mir-182 etterligner eller Mir-182 etterligner-NC, eller MIR-182-inhibitor og MIR-182 inhibitor-NC ble samlet og festes med 70% etanol for påvisning av tidlig apoptose. Farging av celler ble utført i henhold til instruksjonene fra Annexin V-R-PE celle apoptose deteksjon kit (SouthernBiotech, USA). Strømningscytometri (BD Biosciences, USA) ble anvendt for å detektere hvor stor prosentandel av tidlig apoptose. Målingen ble utført i tre eksemplarer.
Transwell Cell Invasion analysen
PC-3 celler transfektert med enten Mir-182 etterligner eller Mir-182 etterligner-NC, eller MIR-182-hemmer og MIR -182 inhibitor-NC ble oppsamlet. 5 x 10
4 PC-3-celler ble plassert på det øvre kammer av hvert innsatsen belagt med 50 ul av 2 mg /ml Matrigel (vekstfaktor redusert BD MatrigelTM matrise), og 600μl av RPMI 1640 med 20% FBS ble tilsatt til den nedre del av kammeret. Etter inkubering i 24 timer ble kamrene demontert, og membranene ble farget med 2% krystallfiolett oppløsning i 15 minutter og plassert på et objektglass. Deretter, ble celler som hadde migrert over membranen telles i fem tilfeldige visuelle felt ved hjelp av et lysmikroskop. Alle analyser ble utført tre uavhengige ganger i tre eksemplarer.
miRNA Targets Tippe
De antatte miRNA målene ble spådd å bruke TargetScan (https://www.targetscan.org/vert_50/), miRBase (https://www.mirbase.org/index.shtml), og PicTar (http: //pictar.mdc – berlin.de/). algoritmer
Plasmid Construction
PmirGLO- dual-luciferase reporter-vektor (7350 bp, Promega, Madison, WI, USA) ble anvendt for å bekrefte funksjonen av det antatte MIR-182 bindingssete i den NDRG1 3′-UTR. Ifølge den potensielle Mir-182 bindende sekvens av NDRG1 3′-UTR, en dobbel – var strandet sekvens oppnådd ved å gløde med to single-tråder NDRG1-Top, (NheI) 5′-CTAGCTAGCGGCCGCTAGT CCTC AGAGAC ACCAAACTGCCAAAAG- 3 «; NDRG1-Bot (Sall) 5»-TCGACTTTTGGCA GTTTGGTGTC TCTGAGG ACTAGCGGCCGCTAG- 3 «, og deretter klonet i NheI /Sall områder av pmirGLO-Dual-luciferase reporter vektor. Gløding ble utført som: 95 ° C i 5 minutter og ved romtemperatur i 2 timer. Den rekonstruerte plasmid ble bekreftet av restriksjonsendonucleaseoppløsning og sekvensering, og ble kåret pmirGLO /NDRG1-UTR.
Dual luciferasereportergenet analysen
PC-3 celler ble delt inn i fem grupper etter ulike transfeksjon innholdet: a: (blank) pmirGLO /NDRG1-UTR; b: pmirGLO /NDRG1-UTR + MIR-182 inhibitor-NC; c: pmirGLO /NDRG1-UTR + MIR-182-inhibitor; d: pmirGLO /NDRG1-UTR + Mir-182 etterligner-NC; e: pmirGLO /NDRG1-UTR + Mir-182 etterligner. PC-3 celler ble sådd i tre eksemplarer i 96-brønners plater, lov til å bosette seg i 24 timer og deretter co-transfektert med ulikt innhold ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA, USA). Luciferase og Renilla aktivitet ble målt 48 timer etter transfeksjon med Dual LuciferaseReporter Assay Kit (Promega) i henhold til produsentens instruksjoner. Tre uavhengige eksperimenter ble utført, og dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD. Luciferase aktivitet verdiene normalisert til Renilla aktivitet som relativ lysenhet (RLU)
Statistical Analysis
Den tosidige t-test ble brukt for å vurdere betydningen av forskjellene mellom to grupper.;
P
verdier. 0,05 ble vurdert som signifikante
Resultater
MiR-182 ble oppregulert i PCA Vev
Etter primær miRNA microarray analyse, i PCA vev fem mirnas (MIR-345, MIR-145, MIR-221, MIR-27b og MIR-378) ble nedregulert og tjueto mirnas var oppregulert (figur 1). MiR-182 var oppregulert med ganger endring av 6,14 og ytterligere bekreftet ved real-time RT-PCR med ganger endring av 5,70. Som den mest betydnings forskjellig uttrykt miRNA mellom PCA og BPH vev, ble MIR-182 valgt for videre studier. Alle forskjellig uttrykt mirnas ble sett i tabell S1.
I PCA vev, fem mirnas ble nedregulert og tjueto mirnas ble oppregulert. miRNA-182 ble oppregulert med ganger endring av 3,07 og ytterligere bekreftet ved real-time RT-PCR med ganger endring på 2,85.
MiR-182 ble oppregulert i PCA cellelinjer
Sanntids tids~~POS=HEADCOMP RT-PCR-analyse viste at MIR-182-ekspresjon ble betydelig økt i fire vanlige PCA-cellelinjene som ble testet (PC-3, DU145, 22Rv1 og LnCap), sammenlignet med normal prostata epitelial RWPE-1-celle, noe som indikerer at MIR -182 blir oppregulert i PCA cellelinjer og PC-3 har den høyeste ekspresjonsnivået (figur 2). Da PC-3 celler ble valgt for videre studier.
Real-time RT-PCR viser at den relative uttrykket nivået av PC-3 celler er den høyeste i fire prostata kreft cellelinjer og RWPE-1 har den laveste uttrykk nivå. Verdier representerer betyr fra tre separate forsøk og feilfelt representerer SD.
MiR-182 Expression nivå er vesentlig endret etter Transfeksjon med Mimic eller hemmere
MiR-182 uttrykk nivået ble oppdaget ved real-time RT-PCR etter transfeksjon med etterligner eller hemmere i PC-3 celler. Resultatene viste at etterligner eller hemmere ble effektivt transfektert (figur 3) og uttrykket nivået er høyest i MIR-182 ligner gruppe og lavest i MIR-182 hemmer gruppe (figur 4). Disse resultatene indikerer at disse etterligner eller inhibitorer kan etterligne eller inhibere MIR-182 effektivt.
Resultatene viser at transfeksjon frekvensen er mer enn 80%. Representative bilder og tilfeldig utvalgte felt er vist.
Blanke gaver blank kontroll. Resultatene viser at ekspresjonsnivået er høyest i MIR-182 etterligner gruppe og lavest i MIR-182 hemmer gruppe. Verdier representerer betyr fra tre separate forsøk og feilfelt representerer SD.
Overuttrykte MIR-182 Fremmer spredning i PC-3 celler
For å undersøke funksjonen av speil 182 i PCA transfektert vi Mir-182 etterligner eller inhibitros i PC-3 PCA celler og målte celleproliferasjon. Ved hjelp av MTT-analyser, observerte vi at veksten av MIR-182 overekspresjon celler ble dramatisk økt, sammenlignet med MIR-182 ligner -NC-transfekterte celler (
P
0,05). Tvert imot, etter nedregulering av MIR-182 med en inhiobitor, veksten i PC-3 celler ble dramatisk redusert sammenlignet med MIR-182 inhibitor -NC-transfekterte celler (
P
0,05) (figur 5). Resultatene viste at oppregulering av MIR-182 fremmer spredning av PC-3 celler.
Blanke gaver blank kontroll. UV-synlige absorbansen ble målt ved 490 nm. Den relative absorbans var signifikant forskjellig 3 dager etter transfeksjon (
P
0,05). Verdier representerer betyr fra tre separate forsøk.
Overuttrykte MIR-182 Fremmer G1 /S Cell Cycle Overgang i PC-3 celler
Vi undersøkte effekten av MIR-182 videre på spredning ved hjelp av flowcytometri. MiR-182-overekspresjon PC-3-celler hadde en signifikant lavere prosentdel av celler i G0 /G1 fase og økte prosentandelen av celler i S-fasen, sammenlignet med MIR-182 etterligner-NC-transfekterte celler. Tvert imot, etter at nedregulering av MIR-182 ved en inhiobitor, PC-3-celler hadde en signifikant høyere prosentandel av celler i G0 /G1 fase og reduserte prosentandelen av celler i S-fasen, sammenlignet med MIR-182-inhibitor-NC- transfekterte celler (figur 6). Denne informasjonen antydet at overekspresjon av MIR-182 kan fremme G1 /S cellesyklus overgang, og kan derfor øke spredning av PC-3 celler.
Blanke gaver blank kontroll. Verdier representerer midler fra tre separate forsøk og feilfelt representerer SD. (*
P
0,05).
Overuttrykte MIR-182 Reduserer Tidlig Apotosis av PC-3 celler
For å undersøke mulige regulerende involvering av MIR -182, tidlig apoptose av PC-3 celler ble oppdaget etter transfeksjon. Resultatene viste at den tidlige apoptose frekvensen av MIR-182 overekspresjon celler ble dramatisk redusert, sammenlignet med MIR-182 etterligner-NC-transfekterte celler. Tvert imot, etter at nedregulering av MIR-182 ved en inhiobitor, den tidlige apoptose frekvensen av PC-3-celler ble dramatisk økt i forhold til MIR-182-inhibitor-NC-transfekterte celler (figur 7). Resultatene viste at oppregulering av MIR-182 reduserer tidlig apoptose av PC-3 celler.
Blanke gaver blank kontroll. Resultatene viser at tidlig apoptose hastigheten er lavest i MIR-182 etterligner gruppe og høyest i MIR-182 hemmer gruppe (*
P
0,05, **
P
0,01) . Representative bilder ble vist og tidlig apoptose celler ble indikert ved Q4 (LR) område.
Overuttrykte MIR-182 Øker Invasion i PC-3 celler
Overuttrykte MIR-182 signifikant økt invasiv potensialet av PC-3-celler når transfektert med MIR-182 etterligner sammenlignet med kontrollceller i Transwell-analyse med Matrigel, og celler transfektert med MIR-182-inhibitor som resulterte i en betydelig decresed invasiv potensial (figur 8). Disse data tyder på at Mir-182 øker invasjonen i PC-3 celler
in vitro
.
Invasion ble utført med PC-3 celler transfektert med Mir-182 etterligner eller hemmere. Blank presenterer blank kontroll. Representative bilder og tilfeldig utvalgte felt er vist (*
P
0,05, **
P
0,01).
Identifikasjon av MIR-182 Binding nettsteder i NDRG1 3′-UTR omegn
Etter prediksjon med online miRNA Targets verktøy, mange mulige gener ble spådd. Gener relatert med celleproliferasjon, apoptose, invasjon og metastasering ble valgt, blant annet NDRG1. Videre har vi funnet at NDRG1 var en metastase lyddemper gen [21] – [25] eller tumorsuppressorgen [26], og NDRG1 var nødvendig for p53-avhengig apoptose [27]. Vår studie viste også at NDRG1 ble nedregulert i PCA vev og PC-3 celler sammenlignet med BPH vev og RWPE-1 celler (data ikke vist). Endelig NDRG1 ble valgt for videre studier. Deretter fant vi at NDRG1 3′-UTR regionen har bare en svært konservert MIR-182 bindingssteder (figur 9).
NDRG1 3′-UTR regionen har bare en svært konservert MIR-182 bindingssteder etter bioinformatiske analyse.
MiR-182 Direkte Målsettinger metastase lyddemper Gene NDRG1 i PC-3 celler
Western blotting resultatene viste at overekspresjon av MIR-182 i PC-3 celler betydelig redusert protein uttrykk nivåer av NDRG1 etter transfeksjon med Mir-182 etterligner, sammenlignet med MIR-182 ligner -NC-transfekterte celler. Tvert imot, etter at nedregulering av MIR-182 ved en inhiobitor, proteinkinase ekspresjonsnivåene av NDRG1was dramatisk økt i forhold til MIR-182-inhibitor-NC-transfekterte celler (figur 10), noe som indikerer at NDRG1 er en potensiell MIR-182 målgenet.
Blanke gaver blank kontroll. Overekspresjon av MIR-182 betydelig redusert de protein uttrykk nivåer av NDRG1 og nedregulering av MIR-182 dramatisk økt protein uttrykk nivåer av NDRG1 (*
P
0,05, **
P
0,05, **
P
0,01).
Diskusjoner
i løpet av de siste årene har flere hundre mirnas har vist seg å spille en viktig rolle i regulering av genekspresjon gjennom degradering av mRNA eller undertrykkelse av translasjon i en rekke modellsystemer [28] – [29]. Tyder på at mirnas kan fungere som en ny klasse av både tumorigene og tumor-gener [30]. I denne studien, vi først utarbeidet ti PCA prøver og ti BPH prøver, men bare fem PCA prøver og tre BPH prøver møtte screening standarden på microarray test. Etter miRNA microarray analyse og real-time RT-PCR bekreftelse, viste vi at MIR-182 er oppregulert i kinesiske PCA vev, sammenlignet med BPH vev. Oppregulering resultat av MIR-182 var i samsvar med den studie av Schaefer A et al [14]. Da vi viste at MIR-182-ekspresjon ble betydelig økt i fire vanlige PCA-cellelinjene som ble testet (PC-3, DU145, 22Rv1 og LnCap), sammenlignet med normal prostata epitelial RWPE-1-celle, noe som indikerer at MIR-182 er oppregulert i PCa celle linjer og PC-3 har det høyeste uttrykk nivå. Deretter PC-3 celler ble valgt for videre studier. Neste bevise vi at MIR-182 er rettet spesielt NDRG1 3′-UTR i PC-3 celler.
Tidligere studier viste at NDRG1 var en metastase lyddemper gen eller tumor suppressor gen av PCa [21], [24] [25]. Vår studie viste også at NDRG1 ble nedregulert i PCA vev og PC-3 celler sammenlignet med BPH vev og RWPE-1 celler (data ikke vist). Ytterligere funksjonell Forsøket viste at nedregulering av NDRG1 kunne øke proliferasjonen og invasjon av PC-3-celler, og oppregulering av NDRG1 kunne redusere spredning og invasjonen av PC-3-celler (data ikke vist). Undersøkelser viste at molekyl regulering av NDRG1 invovles PTEN [21], [26], P21 [22], Wnt-β-catenin [23], aktivere transkripsjonsfaktor 3 [24], ATF3-NF kappaB kompleks [25] og p53 [27]. Men det var ingen rapport om NDRG1 regulert av mikroRNA ved PCA å fremme spredning klart og direkte ennå. Det er den første for oss å avdekke det nye forholdet til regulering av NDRG1 og mikroRNA ved PCA. Vi observerte at MIR-182 ble betydelig overuttrykt i PCA-cellelinjer, sammenlignet med RWPE-1. Videre ektopisk overekspresjon av MIR-182 fremmer betydelig spredning, øker invasjonen, fremmer G1 /S cellesyklus overgang og reduserer tidlig apotosis av PC-3 celler, mens undertrykkelse av MIR-182 sank spredning og invasjon, hemmer G1 /S cellesyklus overgang og økning tidlig apotosis av PC-3 celler. For å undersøke mekanismen for MIR-182, identifiserte vi NDRG1 som en antatt MIR-182 mål-genet ved hjelp av bioinformatiske analyse, og bekreftet at NDRG1 er et direkte mål for MIR-182 ved dobbelt luciferasereportergenet assay. Resultatene viste at MIR-182 øker spredning og invasjonen av PCA PC-3 celler ved direkte rettet mot den NDRG1 3′-UTR å nedregulere NDRG1.
I de senere årene har NDRG1 blitt beskrevet som en potensiell tumor suppressor -genet i forskjellige humane kreftformer, og kan være assosiert med tumor aggressivitet og metastase [31] – [34]. Men taushet machanism av NDRG1 fortsatt ikke klart. En måte som kreftceller taushet tumor suppressor genuttrykk er epigenetiske forandringer, som inkluderer DNA hypermethylation av promoter CpG øyer og /eller endringer i tilknyttede posttranslasjonelle histonmodifikasjonene fører til transcriptional undertrykkelse [35]. Arrangøren av NDRG1 inneholder en stor CpG island, øke muligheten for at det kunne bli brakt til taushet av DNA hypermethylation i kreft. Derfor forskere begynne å studere epigenetisk regulering av NDRG1 nylig. Angst et al [36] studie viste at NDRG1 uttrykk kan være regulert av farmakologisk hemming av DNA metylering og histon deacetylering i kreft i bukspyttkjertelen celler. Det ble imidlertid ikke metylering av CpG island av NDRG1 arrangøren funnet i kreft i bukspyttkjertelen celler, noe som tyder på en indirekte mekanisme for NDRG1 de-undertrykkelse av disse behandlingene. Li og Chen [37] studie viste at ved å stanse all NDRG1 i tykktarm kreft cellelinjer SW620 og SW480 skyldtes histonmodifikasjonene, annet enn arrangøren hypermethylation. Imidlertid Chang et al [38] undersøkelse viste at den reduserte ekspresjon av NDRG1 mRNA og protein i magecancercellelinjer og vev var på grunn av metylering av NDRG1 genpromoter. Disse studiene tyder på at den epigenetisk regulering av NDRG1 er forskjellig i forskjellige typer av kreftceller. I denne studien viste vi at NDRG1 kan være direkte målrettet av MIR-182 og avdekket en ny epigenetisk regulering av NDRG1, noe som tyder på at oppregulering av MIR-182 kan gi en alternativ mekanisme for redusert uttrykk for NDRG1 tumor suppressor protein i PCA celler .
Videre forskning er fortsatt nødvendig å undersøke om andre mirnas eller signalveier kan regulere NDRG1 i PCA fordi vi ikke kunne utelukke at det kan være andre microRNAs, som ikke finnes ennå, å spille en viktig rolle i å regulere NDRG1 i PCA og om MIR-182 kan målrette andre medlemmer av NDRG1 familien. For eksempel vil det være av interesse å vite om andre veier er involvert i antiproliferative effekt av NDRG1 og undersøke hva andre komponenter av ondartede fenotype bestemmes av NDRG1 og mirnas i PCA celler, og disse problemene er under videre etterforskning i vår laboratorium.
Konklusjoner
i sammendraget, nøkkelen funn av denne studien er at MIR-182 kan øke spredning av PCA cellelinjer ved å målrette NDRG1. Disse dataene indikerer at MIR-182 spiller en viktig rolle i reguleringen av PCa celleproliferasjon og kunne fungere som en onko-miRNA. MiR-182 kan bryte som en roman terapeutisk mål for behandling av PCa.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
forskjellig uttrykt mirnas mellom PCA og BPH vev. Fet Mirs ble nedregulert Mirs i PCA vev
doi:. 10,1371 /journal.pone.0068982.s001 plakater (DOC)
