Abstract
Bakgrunn
Kreft i bukspyttkjertelen er en svært ondartet sykdom med en ekstremt dårlig prognose. Histondeacetylase hemmere (HDACIs) har vist lovende antitumor aktivitet mot prekliniske modeller for kreft i bukspyttkjertelen, enten alene eller i kombinasjon med kjemoterapi. I denne studien, søkte vi å identifisere klinisk relevante histone deacetylases (HDACs) for å lede utvalget av HDAC hemmere (HDACIs) tilpasset behandling av bukspyttkjertelkreft.
Metodikk
HDAC uttrykk i syv bukspyttkjertelkreft cellelinjer og normale menneskelige bukspyttkjertelen duktale epitelceller ble bestemt ved Western blotting. Antitumor interaksjoner mellom klasse I- og klasse II-selektive HDACIs ble bestemt ved MTT analyser og standard isobologram /CompuSyn Programvaren analyserer. Effektene av HDACIs på celledød, apoptose og cellesyklusprogresjon, og histon H4, alfa-tubulin, P21, og γH2AX nivåer ble bestemt ved kolonidannelsesanalyser, flow cytometri analyse, og Western blotting, respektivt.
resultater
de fleste klassene i og II HDACs ble oppdaget i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer, om enn i varierende nivåer. Behandlinger med MGCD0103 (klasse I-selektiv HDACI) resulterte i doseavhengig vekst arrest, celledød /apoptose, og cellesyklus arrest i G2 /M fase, ledsaget av induksjon av p21 og DNA dobbel-tråd pauser (DSB sin). I kontrast, MC1568 (en klasse IIa-selektiv HDACI) eller Tubastatin A (en HDAC6-selektiv hemmer) viste minimale effekter. Når kombinert samtidig, MC1568 betydelig forbedret MGCD0103-indusert vekst arrest, celledød /apoptose, og G2 /M cellesyklus arrest, mens Tubastatin En eneste synergistisk øket MGCD0103-indusert vekst arrest. Selv MC1568 eller Tubastatin A alene hadde ingen åpenbare effekter på DNA DSB sin og p21 uttrykk, sin kombinasjon med MGCD0103 resulterte i samarbeids induksjon av p21 i cellene.
Konklusjon
Våre resultater tyder på at klassene jeg og II HDACs er potensielle terapeutiske mål for behandling av kreft i bukspyttkjertelen. Følgelig behandle kreft i bukspyttkjertelen med pan-HDACIs kan være mer gunstig enn klasserom eller isoform-selektive hemmere
Citation. Wang G, Han J, Zhao J, Yun W, Xie C, Taub JW, et al . (2012) klasse I og klasse II Histone Deacetylases er potensielle terapeutiske mål for behandling av kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 7 (12): e52095. doi: 10,1371 /journal.pone.0052095
Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 12. april 2012; Godkjent: 09.11.2012; Publisert: 14.12.2012
Copyright: © 2012 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra Jilin universitet, Changchun, Kina, Natural Science Foundation National of China (No. 31071105), og delvis av en start-up Fondet fra Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Wayne State University School of Medicine, Detroit , MI. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er en svært ondartet sykdom med en stadig økende forekomst. Til tross for at den fjerde største dødsårsaken av kreft i USA, har liten forbedring i prognosen blitt gjort i løpet av de siste 20 årene [1] – [3]. På grunn av forsinkelser i klinisk diagnose, er kreft i bukspyttkjertelen ofte oppdages på et avansert stadium og prognosen er svært dårlig, med en overlevelse på 4 til 6 måneder [2]. Gemcitabin (2 «, 2»-difluorodeoxycytidine, dFdC) er standard førstelinje legemiddel for behandling av pasienter med avansert kreft i bukspyttkjertelen [4]. Men med median overlevelse på 5,7 måneder og 1-års overlevelse på 18%, fortsatt lav dens effekt [5], [6]. Derfor kreft i bukspyttkjertelen er fortsatt et høyt kjemoresistent malignitet og presserende behov for nye terapeutiske tilnærminger.
Histone deacetylases (HDACs) spiller avgjørende roller i epigenetisk regulering av genekspresjon ved kata fjerning av acetyl grupper, stimulerende kromatin kondens og fremme transkripsjonen undertrykkelse [7], [8]. HDACs utgjør en stor gruppe av proteiner delt i fire klasser basert på deres homologier til gjær HDACs, deres subcellulære lokalisering og deres enzymatiske aktiviteter [8] – [10]. Klasse I omfatter HDAC1, 2, 3 og 8, som alle er homologer av gjæren rpd3 protein. De er allestedsnærværende uttrykt og som befinner seg hovedsakelig i kjernen [8] – [10]. Klasse II enzymer innbefatter HDAC4, 5, 6, 7, 9 og 10, som er homologer av gjæren hda1 protein. Disse enzymene vanligvis oppviser vevsspesifikk ekspresjon og transport mellom cytoplasma og cellekjernen som reaksjon på cellulære signaler [8], [11]. Siden HDACs 6 og 10 inneholder to katalytiske seter, er disse enzymene ofte ytterligere betegnet som en separat underklasse (klasse IIb) fra HDACs 4, 5, 7, og 9 (klasse IIa) [8], [12]. Klasse III omfatter de syv sirtuins, SIRT1-7, homologer av gjæren SIR2 proteinet [8], [13]. HDAC11 inneholder konserverte rester som deles av både klasse I og klasse II enzymer og representerer en egen klasse av HDAC (klasse IV) [8], [10], [14].
Avvikende epigenetiske endringene er et kjennetegn av kreft hos mennesker [15]. Høy HDAC1 uttrykk er blitt funnet å korrelere med avansert stadium lunge og bukspyttkjertel [16] – [18]. Således kan HDACs representere lovende mål for farmakologisk intervensjon av kreft. Mange små molekyl HDACIs har blitt utviklet i løpet av de siste ti årene [19], [20], som har vist lovende antitumor-aktivitet mot prekliniske modeller for kreft i bukspyttkjertelen, enten alene eller i kombinasjon med kjemoterapeutiske eller målrettede midler [16], [21] – [24]. Men klinisk relevante HDAC isoformer i kreft i bukspyttkjertelen er ikke helt bestemt. Knockout og siRNA knockdown forsøk har antydet at klassen jeg HDACs er avgjørende for kreftcelle spredning og overlevelse i motsetning til klasse II HDACs 4 og 7 [25], [26]. Imidlertid inhibering av klassen IIb HDAC6 fører til acetylering og forstyrrelser i anstand funksjon av varmesjokk-90 (HSP90) i leukemiceller [27]. Selv om noen HDACIs anses å være pan-HDACIs (f.eks LBH-589, PXD-101, og Saha), en fersk studie viste at klasse IIa enzymer ikke er målrettet av de fleste HDACIs (f.eks FK-228, LBH-589 , MGCD0103, MS-275, PXD-101, og Saha) ved farmakologisk relevante konsentrasjoner [28]. Således, selv om det er stadig tydeligere at klasse I HDAC-enzymer er klinisk relevante for kreft [25], [26], er dette mindre etablert for den klasse II-enzymer, spesielt i sammenheng med klasse I HDACs.
i denne studien undersøkte vi uttrykket av klassene i og II HDACs i sju bukspyttkjertelkreft cellelinjer og menneskelige bukspyttkjertelen duktale epitelceller og bestemmes deres terapeutiske roller i kreft i bukspyttkjertelen celler ved hjelp av klasserommet, subclass-, og isoform-selektiv HDACIs. Våre resultater viser, for første gang,
in vitro
synergisantitumor interaksjoner mellom klasse I og klasse II HDACIs i kreft i bukspyttkjertelen celler, men ikke i normale menneskelige bukspyttkjertelen duktale epitelceller. Selv om det er behov for oppfølgingsstudier i
in vivo
modeller, våre resultater tyder på at både klasse I og klasse II HDACs er potensielle terapeutiske mål for behandling av kreft i bukspyttkjertelen.
Materialer og Metoder
HDACIs
ny klasse i-selektiv HDACI MGCD0103 (Mocetinostat) [29], og klassen IIa-selektive HDACI MC1568 [30] – [32] ble kjøpt fra Selleck Chemicals LLC ( Houston, TX). Romanen HDAC6-selektiv hemmer Tubastatin A [33] ble kjøpt fra BioVision Inc. (Mountain View, California). Alle HDACIs ble oppløst i DMSO og lagret ved -80 ° C, som anbefalt av leverandørene.
Cell Culture
VVS, MIAPaCa-2, BxPC-3, PANC-1 ( avledet fra primærtumor [34]), ASPC-1, CFPAC-1, og CAPAN-1 (avledet fra metastase [34]) humane bukspyttkjertel cancer-cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Normale menneskelige bukspyttkjertelen ductal epitel (HPDE) celler ble hentet fra M. D. Anderson Cancer Center. Cellelinjene ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) eller RPMI1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS, Hyclon Labs, Logan, UT) pluss 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin i en 37 ° C fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2/95% luft.
in vitro
cytotoksisitetsassayer
in vitro
HDACI Cytotoksisiteten for bukspyttkjertelcancercellelinjer og de HPDE celler ble målt ved hjelp av MTT (3- [4,5-dimetyl-tiazol-2-yl] -2,5-difenyltetrazolium-bromid, Sigma-Aldrich, St Louis , MO) reagens, slik som tidligere beskrevet [35], [36]. I korthet ASPC-1, BxPC-3, PANC-1 (mye brukt cellelinje modeller for kreft i bukspyttkjertelen forskning), eller HPDE-celler ble dyrket i 100 pl DMEM /10% FBS i 96-brønners plater. Celler ble inkubert ved 37 ° C i nærvær av 5 variable konsentrasjoner av MGCD0103 (0-4 uM), MC1568 (0-10 uM), eller Tubastatin A (0-8 uM). Etter 96 timer ble MTT tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 1 mM. Etter 4,5 timer ble formazankrystaller ble oppløst ved tilsetning av 100 ul 10% SDS i 10 mM HCl. Optiske densiteter ble målt med et synlig mikroplateleser ved 590 nm. IC
50-verdier ble beregnet som konsentrasjon av legemidlet som kreves for å hemme 50% vekst sammenlignet med ubehandlede kontrollceller. Dataene for de cellelinjer er presentert som gjennomsnitt ± standardfeil fra minst 3 uavhengige eksperimenter. Omfanget og retningen av MGCD0103 og MC1568 eller Tubastatin Et antitumor-interaksjoner ble evaluert ved standard isobologram analyse som tidligere beskrevet [35], [37], [38], og ved hjelp av CompuSyn programvare (ComboSyn, Inc., Paramus, NJ) . Kort sagt ble interaksjoner kvantifisert ved å bestemme kombinasjonsindeksen (CI), hvor CI 1, CI = 1, og CI 1 indikerer synergis, additiv og antagonistisk effekt, henholdsvis. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± standardfeil fra minst 3 uavhengige eksperimenter.
kolonidannelse Assays
Én dag før HDACI behandlinger, 300 PANC-1 eller 500 BxPC-3-celler ble sådd inn i 100 mm skåler i komplett DMEM eller RPMI160. Cellene ble deretter behandlet med varierende konsentrasjoner av MGCD0103 (0-1,0 mm), MC1568 (0-10 uM), Tubastatin A (0-4 uM), MGCD0103 pluss MC1568 (0,5 uM 5 uM), eller MGCD0103 pluss Tubastatin A (0,5 pM 2 pM) i 96 timer. Cellene ble deretter vasket to ganger med stoff-fri DMEM, eller RPMI1640 og dyrket i fullstendig DMEM, eller RPMI1640 i opptil 3 uker. Kolonier ble visualisert ved Coomassie blå farging og telles. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± standardfeil prosentandeler i forhold til ubehandlede kontrollceller fra tre uavhengige eksperimenter. Omfang og retning av antitumor interaksjoner mellom MGCD0103 og MC1568 eller Tubastatin A ble bestemt ved hjelp av CompuSyn programvare (ComboSyn, Inc.).
shRNA knockdown av HDACs i Panc-1 celler
HDAC4 og HDAC6 shRNA lentivirus kloner ble kjøpt fra RNAi Consortium (Sigma-Aldrich) og brukes til å infisere PANC-1 celler. Etter valget med puromycin, ble en pool av infiserte celler utvidet og testet for HDAC4 eller HDAC6 uttrykk ved Western blotting (nevnt HDAC4- eller HDAC6-shRNA celler). En pool av celler fra den negative kontrollen transduksjon ble anvendt som den negative kontroll (betegnet NTC-shRNA-celler).
Western Blot analyse
løselige proteiner ble ekstrahert fra HPAC, MIAPaCa-2, BxPC -3, PANC-1, ASPC-1, CFPAC-1, CAPAN-1, eller HPDE celler, ubehandlet eller behandlet med HDACIs i 96 timer, og underkastet SDS-polyakrylamid gelelektroforese. Separerte proteiner ble overført elektro til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner (Thermo Fisher Inc., Rockford, IL) og immunoblottet med anti-HDAC1 (# 2062), -HDAC2 (# 2540), -HDAC3 (# 2632), -HDAC4 ( # 2072), -HDAC5 (# 2082), -HDAC7 (# 2882), -p21 (# 2947S), -γH2AX (# 2577S), (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), -HDAC6 (sc-11420, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), -HDAC8 (H6412), -HDAC10 (H3412), acetyl (ac) -tubulin (T7451) (Sigma, St. Louis, MO), -HDAC9 (SH030228P, ABGENT, San Diego, CA), -ac-histon H4, H4 -histone, eller -beta-aktin-antistoff (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY), som beskrevet tidligere [39], [40]. Immunreaktive proteiner ble påvist med Lumi-Light Western blotting substrat (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), som beskrevet av produsenten.
Vurdering av Baseline og HDACI apoptose
BxPC-3 eller PANC-1-cellene ble behandlet med MGCD0103 (0,5 uM), MC1568 (5 uM), Tubastatin A (2 uM), MGCD0103 pluss MC1568 (0,5 uM 5 uM), eller MGCD0103 pluss Tubastatin A (0,5 pM 2 pM) for 96 timer. Cellene ble deretter høstet og kraftig pipettert, og prøver ble tatt for å bestemme grunnlinjen og HDACI-indusert apoptose ved hjelp av apoptose Annexin V-FITC /propidium jodid (PI) kit (Beckman Coulter, Brea, CA) og en FACS Calibur flowcytometer ( Becton Dickinson, San Jose, CA), som beskrevet tidligere [35], [36], [41]. Apoptotiske hendelser ble registrert som en kombinasjon av Annexin V
+ /PI
– (tidlig apoptotisk) og Annexin V
+ /PI
+ (sent apoptotiske /døde) arrangementer. Forsøket ble gjentatt tre ganger, og resultatene er presentert som gjennomsnitt prosenter ± standardfeil av Annexin V
+ celler av tre paralleller fra en representant eksperiment.
Effekter av HDACIs på cellecyklusprogresjonen i kreft i bukspyttkjertelen celler
BxPC-3 eller Panc-1 celler behandlet med MGCD0103 (0,5 mm), MC1568 (5 mm), Tubastatin A (2 mm), MGCD0103 pluss MC1568 (0,5 mikrometer 5 mm), eller MGCD0103 pluss Tubastatin A (0,5 pM 2 pM) i 96 timer ble høstet og fiksert med iskald 70% (v /v) etanol i 24 timer. Etter sentrifugering ved 200 x g i 5 minutter, ble cellepelletene ble vasket med PBS (pH 7,4) og resuspendert i PBS som inneholdt PI (50 ug /ml), Triton X-100 (0,1%, v /v), og DNase- fri RNase (1 pg /ml). DNA-innholdet ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri (FACS Calibur). Cellesyklus analyse ble utført med ModFit
LT
TM3.0 DNA analyse programvare (Becton Dickinson).
Statistical Analysis
Forskjeller i MGCD0103 IC
50s mellom MC1568 eller Tubastatin A behandlede og ubehandlede BxPC-3 eller PANC-1 celler og forskjeller i celledød /apoptose mellom MGCD0103 og MC1568 eller Tubastatin A behandlet (enkeltvis eller kombinert) og ubehandlede celler ble sammenliknet med paret t-test. Statistiske analyser ble utført med GraphPad Prism 4.0.
Resultater
HDAC Expression og HDACI sensitiviteter i bukspyttkjertelkreft cellelinjer og HPDE Cells
klasse III HDACs (SIRTs 1- 7) ikke er målrettet mot tradisjonelle HDACIs [20] og ble ikke tatt med i denne studien. Ekspresjon av klasser I og II HDACs ble bestemt ved Western blotting i HPAC, MIAPaCa-2, BxPC-3, PANC-1, ASPC-1, CFPAC-1, CAPAN-1, og den normale HPDE-cellelinjen. Klassen I HDACs (1, 2, 3 og 8) ble påvist i alle cellelinjer selv om nivåene var variabel. Generelt ble nivåene av klasse I HDACs i HPDE cellene relativt lavere sammenlignet med de fleste av bukspyttkjertelkreft cellelinjer. Interessant, ble de fleste klasse IIa HDACs (unntatt HDAC5) påvist i nesten alle bukspyttkjertelkreft cellelinjer, men ikke i HPDE celler. I motsetning til dette ble HDACs 6 og 10 detektert i alle cellelinjer og deres nivåer i HPDE cellene var sammenlignbare (hvis ikke høyere) med de i kreftcellelinjer (figur 1). For å bestemme rollene til disse HDACs i bukspyttkjertelkreft cellevekst og overlevelse, brukte vi tre forskjellige HDACIs, MGCD0103 (Mocetinostat, en klasse I-selektiv HDACI) [29], MC1568 (en klasse IIa-selektiv HDACI) [30] – [ ,,,0],32], og Tubastatin A (en ny HDAC6-spesifikk hemmer) [33]. Behandlinger av PANC-1 celler med varierende konsentrasjoner av MGCD0103 (0-1,0 mm) resulterte i en doseavhengig hyperacetylation av histon H4, samtidig som de har ingen effekt på a-tubulin (en HDAC6 substrat) acetylering eller total H4 nivåer (figur 2A) . Behandlinger med MC1568 også resultert i acetylering av histon H4 (innlysende ved 5 og 10 uM), men i mye mindre grad i forhold til MGCD0103, og nivåene av acetylert histon H4 flatet ut ved 5 og 10 uM. Videre disse behandlingene hadde ingen innvirkning på alpha-tubulin acetylering (figur 2B). I motsetning til de to andre HDACIs, Tubastatin A-behandlinger (0-4 um) viste en doseavhengig hyperacetylation av alfa-tubulin, som plateaued ved 2 og 4 uM. Men disse behandlingene hadde ingen effekt på den acetylering av histon H4 (figur 2C). Disse resultatene validert HDACI egenskapene til disse agentene og delvis støttet deres substratspesifisiteter.
Protein utdrag fra loggen fase ASPC-en, BxPC-3, PANC-en, VVS, MIAPaCa-2, CFPAC-en, CAPAN -1, og HPDE cellene ble underkastet Western blots probet med anti-HDAC eller -β-aktin-antistoff, som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Klassen I HDACs (1, 2, 3 og 8) ble påvist i alle cellelinjer selv om nivåene var variabel. Generelt ble nivåene av klasse I HDACs i HPDE cellene relativt lavere sammenlignet med de fleste av bukspyttkjertelkreft cellelinjer. Interessant, ble de fleste klasse IIa HDACs (unntatt HDAC5) påvist i nesten alle bukspyttkjertelkreft cellelinjer, men ikke i HPDE celler. I motsetning til dette ble HDACs 6 og 10 detektert i alle cellelinjer og deres nivåer i HPDE cellene var sammenlignbare (hvis ikke høyere) med de i kreftcellelinjer
Paneler A-C.: PANC-1-celler ble høstet og lysert etter inkubasjon med en rekke konsentrasjoner av MGCD0103 (0-1,0 mm), MC1568 (0-10 uM), eller Tubastatin A (0-4 uM) i 96 timer. Løselige proteiner ble analysert på Western blot probet med anti-acetylert (ac) -H4, -H4, -AC-tubulin, eller -β-aktin antistoff. Panel D: ASPC-1, BxPC-3, PANC-1, eller de HPDE celler ble dyrket ved 37 ° C i 96 timer i komplett medium i 96-brønners plater, med en rekke konsentrasjoner av MGCD0103, MC1568, eller Tubastatin A , og celle viabilities ble bestemt ved hjelp av MTT reagent og en synlig lys mikroplateleser. IC
50-verdier ble beregnet som de konsentrasjoner av medikament nødvendig for å hemme 50% vekst sammenlignet med kontroll-celler dyrket i fravær av medikament. Dataene er presentert som middelverdier ± standardfeil fra minst 3 uavhengige eksperimenter. MG, MGCD0103; MC, MC1568; TA, Tubastatin A. De samme forkortelser ble brukt gjennom hele studien med mindre annet er oppgitt.
Behandlinger av Panc-1 celler med variable konsentrasjoner av MGCD0103 (0-4 mm) resulterte i doseavhengig vekst arrest , som bestemt ved MTT-analyser (data ikke vist), med en IC
50 på 2,0 pM (figur 2D). I motsetning til behandling av cellene med MC1568 (0-10 uM) eller Tubastatin A (0-8 uM) resulterte i begrenset hemming av cellevekst (spesielt ved lavere doser, data ikke vist) med en
beregnet
IC
50 av 29,7 pM og 11,5 pM, henholdsvis (figur 2D). Lignende resultater ble oppnådd med ASPC-1 og BxPC-3-celler (figur 2D). Overraskende, HPDE cellene svart på MGCD0103 samt bukspyttkjertelkreft cellelinjer (figur 2D). Selv om behandlinger med Tubastatin A (0-4 uM) resulterte også i begrenset inhibering av cellevekst i HPDE-celler (med en beregnet IC
50 av 11,5 pM), behandling med MC1568 (0-10 um) viste ingen effekt på alle (data ikke vist og figur 2D).
Disse funnene tyder på at klasse i HDACs spiller avgjørende roller i bukspyttkjertelkreft cellevekst, mens klasse II HDACs av seg selv spille minimale roller på dette aspektet. Det er imidlertid mulig at samtidig målretting av klasse I og klasse II HDACs kan føre til synergistisk vekst arrestasjonen av kreft i bukspyttkjertelen celler.
Synergistic Antitumor Interaksjoner mellom klasse I- og klasse II-Selektive HDACIs i kreft i bukspyttkjertelen celler
for å teste denne muligheten, ble PANC-1 celler behandlet med variable konsentrasjoner av MGCD0103, MC1568, eller Tubastatin A, enten alene eller i kombinasjon for 96 timer. Inhibering av cellevekst av disse behandlingene ble målt ved MTT-analyser. Når administrert samtidig, MC1568 eller Tubastatin En betydelig forbedret MGCD0103-indusert vekst arrest (som gjenspeiles i redusert IC
50s) av cellene (figur 3A B). Den kombinerte effekten av MGCD0103 med MC1568 eller Tubastatin A på cellevekst arrest var tydelig synergistisk, som bestemmes av standard isobologram analyser (Tall 3C 1, som indikerer synergisme ble beregnet for hver av de medikamentkombinasjoner (data ikke vist). Nesten identiske resultater ble oppnådd med BxPC-3-celler (figurene 3A, B, E og F). For å tilveiebringe direkte bevis for at målretting klasse II HDACs kan øke antitumoraktivitet av MGCD0103 i kreft i bukspyttkjertelen celler, shRNA knockdown stabile kloner for HDAC4 (betegnet HDAC4-shRNA-celler), HDAC6 (betegnet HDAC6-shRNA-celler), og en negativ kontroll (betegnet NTC-shRNA-celler) ble samlet i PANC-1-celler (figur 3G). Interessant, HDAC4-shRNA og HDAC6-shRNA celler viste signifikant økt følsomhet for å MGCD0103 forhold til NTC-shRNA celler (MGCD0103 IC
50s var 2,60, 1,06 og 0,83 mikrometer for NTC-, HDAC4-, og HDAC6-shRNA celler, henholdsvis; p 0,005) (figur 3 H). I stor kontrast, kombinert behandling av HPDE celler med MC1568 og MGCD0103 resulterte i litt redusert MGCD0103 følsomhet (Figur 4A). Standard isobologram og CompuSyn analyse kunne ikke utføres på grunn av manglende respons fra de HPDE celler til MC1568. Selv cotreatment av HPDE celler med Tubastatin A og MGCD0103 også medført noe økt følsomhet for MGCD0103 (figur 4B), samspillet mellom de to agentene var på den beste tilsetningsstoff når bestemmes av standard isobologram analyse (Figur 4C).
Panelene A og B: MGCD0103 IC
50-årene av BxPC-3 eller PANC-1-celler ble bestemt i fravær eller nærvær av MC1568 (panel A) eller Tubastatin A (panel B) ble behandlet på samme tid. * Indikerer p 0,05, mens ** indikerer p 0,005. Paneler C-F: Standard isobologram analyse av inhibering av PANC-1 (panelene C F) cellevekst ved MGCD0103 og MC1568 (panelene C den faste linje representerer den additive virkning, mens punktene representerer konsentrasjonen av hvert medikament som resulterer i 50% inhibering av vekst. Poeng faller under streken indikerer synergi mellom medikamentkombinasjoner mens de over linjen indikerer antagonisme. Paneler G og H: shRNA stabile kloner for en negativ kontroll (NTC), HDAC4, og HDAC6 ble samlet i PANC-1-celler. Expression nivåer av HDAC4, HDAC6, ac-H4 og ac-alpha-tubulin ble bestemt av vestlige blotter (Panel G). Følsomhet for MGCD0103 av disse shRNA stabile kloner ble bestemt ved MTT-analyser. ** Indikerer p 0,005
Paneler A og B:. MGCD0103 IC
50-årene av HPDE celler ble bestemt i fravær eller nærvær av MC1568 (panel A) eller Tubastatin A (panel B) behandlet samtidig. Panel C: Standard isobologram analyser av inhibering av HPDE cellevekst ved MGCD0103 og Tubastatin A. IC
50 verdiene for hvert medikament er plottet på aksene; den faste linje representerer den additive virkning, mens punktene representerer konsentrasjonen av hvert medikament som resulterer i 50% inhibering av vekst. Poeng faller under streken indikerer synergi mellom medikamentkombinasjoner mens de over linjen indikerer antagonisme.
Arbeidet ble deretter gjennomført for å finne ut om klasse I- og klasse II-selektive HDACIs synergize i forårsaker kreft i bukspyttkjertelen celledød av kolonidannelse analyser. Behandlinger av PANC-1 eller BxPC-3-celler med varierende konsentrasjoner av MGCD0103 i 96 timer resulterte i doseavhengig induksjon av celledød, noe som reflekteres ved redusert antall kolonier sammenlignet med ubehandlede kontrollceller (figurene 5A B). Dette var i stor kontrast til de behandlinger med MC1568 eller Tubastatin En som produserte svært begrensede virkninger på celledød, spesielt ved lavere konsentrasjoner (Tall 5A B). Interessant når de administreres samtidig, MC1568 eller Tubastatin En betydelig forbedret MGCD0103-indusert celledød, noe som reflekteres ved den ytterligere redusert antall kolonier sammenlignet med det fra MGCD0103 behandling alene (figurene 5C 0,05, mens ** indikerer p. 0,005
Til sammen våre resultater tyder på at klasse I HDACs spille sentrale roller i bukspyttkjertelkreft cellevekst og overlevelse. Selv klasse II HDACs av seg selv spille svært begrensede roller, de samarbeider med klasse I HDACs å forbedre klasse I HDACs-mediert bukspyttkjertelkreft cellevekst og overlevelse.
Effekter av klasse I- og klasse II-Selective HDACIs på apoptose og cellecyklusprogresjonen i kreft i bukspyttkjertelen celler
for å begynne å bestemme mekanismer som MGCD0103 og MC1568 eller Tubastatin En synergistisk i forårsaker kreft i bukspyttkjertelen cellevekst arrestasjon og død, vi neste undersøkte effekten av de tre HDACIs på apoptose og cellesyklusfordelingen i PANC-1 og BxPC-3-celler. Behandlinger av PANC-1 eller BxPC-3-celler med MGCD0103 (0,5 uM) resulterte i induksjon av apoptose og cellesyklusarrest i G2 /M-fasen. I motsetning til behandlinger med MC1568 (5 uM) eller Tubastatin A (2 mm) hadde ingen tydelig effekt på enten apoptose eller cellesyklusprogresjon i disse celler (figurene 6A-D). Når kombinert samtidig, MC1568 men ikke Tubastatin A, betydelig forbedret MGCD0103-indusert apoptose og G2 /M arrest i PANC-en eller BxPC-3 celler (6A-D).
PANC-en (paneler A og B) eller BxPC-3 (panelene C og D) celler ble behandlet med MGCD0103, MC1568, eller Tubastatin A, alene eller kombinert i 96 timer. Cellene ble høstet og underkastet strømningscytometri-analyse for å måle både grunnlinjen og HDACI-indusert apoptose (panelene A og C) og cellesyklusfordeling (panelene B og D). Eksperimentene ble gjentatt tre ganger, og resultatene er presentert som gjennomsnitt ± standardfeil av triplikater fra en representant eksperiment. ** Indikerer p 0,005. Paneler E og F: Effekter av klasse I- og klasse II-selektive HDACIs på p21 uttrykk og DNA DSB sin i BxPC-3 og PANC-1 celler. PANC-1 (panel E), eller BxPC-3 (panel F) celler ble behandlet med MGCD0103, MC1568, eller Tubastatin A, alene eller kombinert i 96 timer. Cellene ble høstet og oppløselige proteiner ekstrahert og underkastet Western blotting for å måle p21 og γH2AX nivåer. β-aktin ble benyttet som lastkontrollen.
Disse resultater antyder at indusering av apoptose og cellesyklusarrest i G2 /M-fasen kan representere store mekanismer som er ansvarlige for celledød og vekststans indusert av MGCD0103, eller MGCD0103 pluss MC1568. Våre resultater tyder også på at klasse I HDACs spiller avgjørende roller i kreft i bukspyttkjertelen celle apoptose og G2 til M fase progresjon og disse effektene kan forsterkes av klasse IIa HDACs, men ikke av HDAC6.
Effekter av klasse I- og klasse II-Selektive HDACIs på DNA Dobbelt Strand Breaks og p21 Expression i kreft i bukspyttkjertelen celler
Nyere studier vist at hemming av HDACs i kreftceller induserer DNA-skader, som for eksempel DNA dobbel-tråd pauser (DSB sin), som kan føre til aktivering av cellesykluskontrollpunkter og påfølgende apoptose dersom den er skadet DNA ikke kan repareres [42] – [45]. Videre HDACI-indusert spredning arrest er tett knyttet til induksjon av p21 [45]. Således kan HDACs fremme bukspyttkjertelkreft cellevekst og overlevelse gjennom regulering av p21-ekspresjon og DNA DSB reparasjon. Interessant, behandlinger av PANC-1 eller BxPC-3-celler med MGCD0103 resulterte i betydelig induksjon av p21 og DNA DSB, gjenspeiles i induksjon av γH2AX, en biomarkør av DSB [46]. I kontrast, behandlinger med MC1568 eller Tubastatin A viste ingen effekt på DNA DSB sin eller induksjon av p21. Når kombinert samtidig, både MC1568 og Tubastatin A kooperativt (hvis ikke synergistisk) forbedret MGCD0103-indusert ekspresjon av p21 (Tall 6E F). Men disse kombinasjonene ikke viser ytterligere effekter på nivåene av γH2AX sammenlignet MGCD0103 behandling alene (Tall 6E F). Disse resultatene tyder på at klasse II HDACs er nødvendig for maksimal undertrykkelse av p21 uttrykk hovedsakelig mediert av klasse I HDACs, men de er unnværlig for klasse I HDACs-mediert reparasjon av DNA DSB sin.
Diskusjoner
HDACIs representerer en lovende ny klasse av anticancermidler [19], [20], [45], [47]. Foruten Vorinostat og Romidepsin som har blitt godkjent av US Food and Drug Administration for behandling av kutant T-cellelymfom, minst 11 andre HDACIs er for tiden under klinisk evaluering for behandling av både solide svulster og hematologisk kreftsykdom [19]. Selv HDACIs har vist lovende antitumor aktivitet i prekliniske modeller for kreft i bukspyttkjertelen [16], [21] – [24], er det fortsatt uklart hvilke HDACs er relevante terapeutiske mål. Svaret på dette viktige spørsmålet ville være en forutsetning for valg av optimal HDACI for behandling av denne ekstremt aggressive sykdommen.
Formålet med denne studien var å ta opp spørsmålet ovenfor. Vi først bestemmes uttrykket profiler av klassene I og II HDACs i sju bukspyttkjertelkreft cellelinjer og normale HPDE celler. SIRTs 1-7 (klasse III HDACs) ble ekskludert siden tradisjonelle HDACIs ikke hemme denne klassen av HDACs.
