Abstract
Studiedesign
For å undersøke de spesifikke mekanismene som Golgi phosphoprotein 3 (GOLPH3) påvirker utviklingen av magekreft og å utforske dens klinisk betydning.
metoder
Immunhistokjemisk analyse ble brukt for å evaluere sammenhenger mellom GOLPH3, fosforylert mTOR (p-mTOR), fosforylert Akt (p-Akt), fosforylert p70S6 (p-p70S6), fosforylert 4E-BP1 (p-4E -BP1) og clinicopathological funksjonene til magekreft. De mRNA uttrykk nivåer av GOLPH3, mTOR, Akt, p70S6 og 4E-BP1 i magekreft, kreft-tilknytning og paret normalt vev ble analysert ved hjelp av RT-PCR. Western blotting ble brukt for å bestemme protein ekspresjon av GOLPH3, p-mTOR, p-Akt, p-p70S6 og p-4E-BP1 i vev.
Resultater
Høy ekspresjon proteinnivåer GOLPH3, p-AKT, p-mTOR, p70S6, p-4E-BP1 ble positivt assosiert med histologisk grad (
p
0,05), dybde av invasjon (
p
0,05 ), fjernmetastaser (
p
0,05) og spredning til lymfeknuter (
p
0,05). Sammenlignet med karsinom-tilstøtende og sammenkoblede normalt vev, de mRNA uttrykk nivåer av GOLPH3, AKT, mTOR, p70S6 og 4EBP1 i mage kreft vev var betydelig høyere. De protein uttrykk nivåer av GOLPH3, p-AKT, p-mTOR, p-p70S6 og p-4E-BP1 i mage kreft vev var også betydelig høyere enn i carcinoma-tilknytning og sammenkoblede normalt vev. Det ble observert en sterk positiv korrelasjon mellom GOLPH3, p-mTOR, p-p70S6 og p-4EBP1 uttrykk (
r
= 0,410, 0,303 og 0,276, henholdsvis
p
0,05), men ingen signifikant sammenheng mellom uttrykk for GOLPH3 og p-Akt ble observert.
Konklusjoner
GOPLH3 uttrykket nivået er høyt korrelert med Akt /mTOR signal i menneskelige mage kreftprøver. GOLPH3 kombinert med Akt /mTOR signaliserer aktivering kan spille en viktig rolle i utvikling, differensiering, invasjon og metastasering av magekreft
Citation. Peng J, Fang Y, Tao Y, Li K, Su T, Nong Y, et al. (2014) Mekanismer av GOLPH3 Associated med progresjon av magekreft: en forstudie. PLoS ONE 9 (10): e107362. doi: 10,1371 /journal.pone.0107362
Redaktør: Yuan-Soon Ho, Taipei Medical University, Taiwan
mottatt: 13 juni 2014; Godkjent: 07.08.2014; Publisert: 06.10.2014
Copyright: © 2014 Peng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle data er tilgjengelige fra manuskriptet og tall
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Stiftelsen Forsknings av Guangxi Helse riktig teknologi og utviklingsprosjekt (Grant Nummer: S201415-01). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Selv om global statistikk viser at magekreft (GC) er den fjerde vanligste kreftformen hos menn og den femte vanligste kreftformen hos kvinner, dødeligheten fra magekreft rangerer andre bare for lungekreft [1]. Den globale forekomsten av magekreft har vært fallende siden andre verdenskrig [2]. Men i utviklingsland, inkludert Kina, sykelighet og dødelighet av magekreft har holdt seg høy. Magekreft behandling har økt de siste årene, men de fleste pasienter er fortsatt diagnostisert med avansert magekreft, ofte inkludert invasjon og fjernmetastaser, som fører til en utilfredsstillende behandlingseffekt rate. Fordi magekreft presenterer en betydelig trussel mot menneskers liv og helse, er det avgjørende å forstå patogenesen av magekreft i ferd med tumorigenesis, invasjon og metastase å veilede tidlig diagnose og behandling.
Det er allment akseptert at svulstdannelse involverer misregulation av mange onkogener, tumorsuppressorgener og metastase-relaterte gener Golgi fosfoprotein 3 (GOLPH3), som også er kjent som GPP34, GMx33, eller MIDAS, er en 34 kD membran-protein som opprinnelig ble identifisert i mus Golgi-apparatet ved proteomikk analyse [3]. GOLPH3 hører til Golgi matrise proteinfamilie, som er sterkt konservert fra gjær til mennesker [4]. Etter at GOLPH3 er blitt translasjonelt modifisert, blir den dynamisk forbundet med den negative Golgi matrisen, hurtig transportert gjennom trans-Golgi-nettet (TGN) til cytoplasma, og fordeles i plasmamembranvesiklene og endokrine celler [4]. Flere studier har vist at GOLPH3 er involvert i antero og retrograd Golgi trafikk, reseptor-resirkulering, og glykosylering fra Golgi-apparatet til plasmamembranen; GOLPH3 spiller også en rolle i cytoskeletal interaksjoner og vedlikehold av Golgi-struktur [4] – [7]. Scott et al. først identifisert onkogene rolle GOLPH3 ved å avsløre dens viktig rolle i tumorcelledifferensiering og proliferasjon, og dets nærvær i mange faste cancere [8]. Interessant nok har noen studier antydet at GOLPH3 regulerer kreftceller ved å styrke mammalian target of rapamycin (mTOR) aktivitet. mTOR er en serin /treonin proteinkinase og en nøkkel integrator av fosfatidyl-inositol-3-kinase (PI3K) RTK-reaksjonsveier kjent for å regulere cellevekst, proliferasjon og overlevelse i humane kreftceller [9] – [10]. Mange studier undersøker forholdet mellom GOLPH3 og flere solide kreft Men det er ikke tilstrekkelig bevis for å støtte hypotesen om at GOLPH3 uttrykk er knyttet til menneskelig magekreft progresjon og prognose, og det mekanistiske grunnlaget der GOLPH3 påvirker tumorigenesis, invasjon og metastasering av magekreft er fortsatt uklart. I denne studien undersøkte vi kliniske betydninger av GOLPH3 og AKT /mTOR signal i magekreft. Samtidig oppdaget vi forholdet mellom GOPLPH3 og Akt /mTOR signalisering i magekreft for å avdekke potensielle rolle GOLPH3 i å regulere mTOR-mediert magekreft tumorigenesis, invasjon og metastasering.
Materialer og metoder
Etisk uttalelse
Alle studie prosedyrer ble gjennomgått og godkjent av Institutional Etikk Review Board of First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University og gjennomført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen. Informert samtykke ble fritatt av styret på grunn av de nye prøvene ble behandlet og anonymisert i henhold til etiske og juridiske standarder.
Vevsprøver og kliniske data utvalg
De friske vevsprøver ble samlet inn fra åtti pasienter med magekreft som gjennomgikk kirurgisk behandling ved First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University i perioden fra januar 2012 til januar 2013. kreft~~POS=TRUNC og karsinom-tilstøtende vev (3 cm avstand fra kreft) og sammenkoblede normalt vev ble oppnådd fra hver pasient , og pasienten ble diagnostisert uavhengig av to erfarne patologer i henhold til den amerikanske Joint Committee on Cancer kriterier [11]. Komplett opprinnelige kliniske data var tilgjengelige for pasienter diagnostisert med magekreft. Gruppen inkluderte 36 kvinner og 44 menn, med en gjennomsnittsalder på 55,4 ± 13,1 år (27-75 år). Andre pasientkarakteristika er vist i Tabell 1, Tabell 2 og Tabell 3. Pasienter som får kjemoterapi eller strålebehandling før operasjon eller som hadde en historie med andre svulster ble ekskludert. I de følgende undersøkelser, en del av prøven tatt under operasjon ble umiddelbart hurtigfrosset i flytende nitrogen og deretter lagret ved -80 ° C, og en porsjon ble satt til 10% bufret formalin i 24 timer og innstøpt i parafin.
Immunohistochemistry
parafininnstøpte prøvene ble delt inn i 3-mikrometer tykke seksjoner fra kreft, karsinom-tilknytning, og paret normale vevsprøver og montert på glass lysbilder. Snittene ble først oppvarmet ved 65 ° C i 2 timer. Deretter ble seksjonene deparaffinized i 100% xylen og rehydrert i en avtagende etanolserie (100%, 90%, 80% og 70% etanol) og destillert vann i henhold til standard protokoller. Deretter ble seksjonene fuktet i citrat-buffer antigene gjenfinning, oppvarmet i en autoklav, og fikk avkjøles til romtemperatur. Etter at delene ble vasket i PBS tre ganger i fem minutter ble 3% hydrogenperoksid tilsatt for å blokkere endogen peroksidase-aktivitet og ikke-spesifikk antigenbinding ved romtemperatur i 20 min. Etter vasking igjen med PBS, ble seksjonene inkubert med et spesifikt antistoff i et fuktig kammer over natten ved 4 ° C. De følgende primære antistoffer ble brukt: GOLPH3 antistoff ved 1:100, p-mTOR-antistoff ved 1:200, p-Akt antistoff ved 1:200, p-p70S6 antistoff ved 1:100, og p-4E-BP1 antistoff ved en :200. For den negative kontrollen, ble det primære antistoff erstattet med PBS, og de gjenværende trinn ble utført som tidligere beskrevet. Prøvene ble deretter vasket med PBS, og en polymer-forsterkende middel ble tilsatt til seksjonene ved romtemperatur i 20 min. Etter vasking ble vevssnittene ble behandlet med HRP-merket geit anti-kanin IgG, biotinylert anti-kanin-immunoglobulin, og streptavidin-peroksydase kompleks reagens i 30 minutter. Seksjonene ble deretter visualisert i frisk 3-3 «diaminobenzidin løsning, hematoxylin counterstain, og 0,1% saltsyre (for å hjelpe til fargeseparasjon). Til slutt ble lysbilder montert i nøytral tannkjøtt og analysert med en lys-feltet mikroskop.
Graden av farging av hver vev seksjon ble vurdert uavhengig av to erfarne patologer som var blind for pasientenes kliniske data. Protein ekspresjonsnivåer ble evaluert ved anvendelse av en semi-kvantitativ poengsystem basert på den totale prosentandel av positivt fargede tumorceller og fargeintensitet. Prosentandelen av positivt fargede celler ble bedømt i henhold til de følgende kriterier: 0 (≤5% positive tumorceller farget), 1 (6-25% positive tumorceller farget), 2 (26-50% positive tumorceller farget), 3 (≥51% positive tumorceller farget). Den fargeintensitet ble en score på en skala fra 0 til 3 som følger: 0 (ingen farging), 1 (svak farging = lys gul), 2 (moderat farving = gul-brun), 3 (sterk farging = brun). For analyse, samlede score 4 ble definert som lav uttrykk, og scorer ≥4 ble definert som høy uttrykk
Omvendt transkripsjon polymerase chain reaction
Total RNA ble ekstrahert fra friske vev bruker. TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. RT-PCR primere som brukes i studien ble utformet og syntetisert av Shanghai Sangon Biological Engineering Technology Services Co Ltd β-aktin ble benyttet som intern referanse. Informasjon angående primersekvensene som benyttes i undersøkelsen er vist i tabell 4. RT-PCR ble utført ved anvendelse av en to-trinns metode. One mikrogram av total RNA ble revers-transkribert til cDNA ved 37 ° C i 60 min og 85 ° C i 5 sek. PCR ble deretter utført i henhold til følgende betingelser: oppvarming til 95 ° C i 5 min; 40 sykluser med denaturering i 30 sekunder ved 95 ° C, hybridisering ved 60 ° C i 30 s, og forlengelse i 30 s ved 72 ° C; og endelig forlengelse ved 72 ° C i 7 minutter før reaksjonen ble lagret ved 4 ° C. Syv mikrogram av det endelige PCR-produkt ble anbrakt på en 2% agarosegel elektroforese for avbildning og analyse under ultrafiolett lys. Nummer én program (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ble brukt til å måle bånd og β-aktin grå verdi av PCR produktene.
Western blotting
De kreft, karsinom-tilknytning og paret normale vevsprøver ble veid og malt til små biter i flytende nitrogen. På forhånd avkjølt PBS ble brukt til å vaske prøvene, som deretter ble sentrifugert ved 5000 rpm ved 4 ° C i 5 minutter. Etter vasking tre ganger med PBS, ble på forhånd avkjølt fosfatlyseringsbuffer og PMSF tilsatt. Prøven ble sonikert ved 180 W ved 4 ° C i 5 minutter og sentrifugert ved 1000 rpm ved 4 ° C i 5 minutter; supernatanten ble deretter umiddelbart fjernet, og proteinkonsentrasjonen ble kvantifisert ved hjelp av Bradford-assay ved å bruke et kommersielt kit kjøpt fra Bio-Rad Laboratories. Supernatantene ble blandet med ladningsbuffer og kokt ved 100 ° C i 5 minutter for å denaturere proteiner. Like mengder av hver prøve ble anbrakt i brønnene av en 4-12% natrium-dodecylsulfat-polyakrylamid gel, elektroforese og overført til en polyvinylidenfluorid membran. Membranen ble blokkert med 5% BSA-buffer i 1 time med risting, og deretter inkubert ved 4 ° C over natten med de individuelle primære antistoffer fortynnet i TBST. De følgende primære antistoffer ble anvendt: polyklonalt kanin-anti-human GOLPH3 (1:1000, Abcam plc, Cambridge, UK), polyklonalt kanin-anti-humant p-p70S6 (Thr389) (1:1000, Cell Signaling Technology, Inc. Beverly, MA, USA), polyklonalt kanin-anti-humant p-Akt (Ser473) (1:1000, Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA, USA), monoklonalt kanin-anti-human p-mTOR (Ser2448) (1:1000, Cell Signaling Technology, Inc. Beverly, MA, USA) og monoklonale kanin anti-human p-Akt (1:1000, Cell Signaling Technology, Inc. Beverly, MA, USA). Membranen ble deretter vasket med TBST fem ganger i fem minutter hver, og pepperrot peroksidase-konjugert geit-anti-kanin-IgG sekundært antistoff (Santa Cruz Biotechnology, SC-2004) ble tilsatt før inkubasjon ved romtemperatur i 1,5 timer med risting. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. Etter vask med TBST tre ganger i fem minutter, ble bandet av interesse påvises ved å bruke ECL prime Western blotting kit (Shanghai Pufei Biotechnology, Shanghai, Kina), og nummer én analyseprogramvare (Bio-Rad, CA, USA) ble brukt å evaluere densitometry data.
Statistiske analyser
Alle de statistiske analysene ble utført ved hjelp av statistikkprogrammet for samfunnsvitenskap, versjon 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). RT-PCR og Western blotting resultater er presentert som gjennomsnitt ± SE. En enveis ANOVA etterfulgt av LSD flere gående tester ble benyttet for å analysere forskjeller mellom gruppene. Forholdet mellom GOLPH3 og p-mTOR, p-Akt, p-4E-BP, og p-p70S6 ekspresjonsnivåer ble estimert ved hjelp av Pearsons korrelasjonskoeffisient. Assosiasjonene mellom protein uttrykk og clinicopathological variabler ble analysert ved hjelp av chi-squared test. P 0,05 (tosidig) ble brukt som nivået av statistisk signifikans
Resultater
Relasjoner mellom clinicopathological variabler og protein uttrykk nivåer av immunhistokjemi
Immunhistokjemisk påvisning. viste at GOLPH3, p-Akt, og p-4E-BP1 var mest vanlig i cytoplasmaet, og fosforylert m-TOR (p-mTOR) var også til stede i kjernen på et lavt nivå. Men p-p70S6 farging ble kun observert i cytoplasma. GOLPH3 og fosforylerte Akt /mTOR pathway proteinene ble mer høyt uttrykt i magekreft gruppen enn i para-karsinom vev og sammenkoblede normal slimhinne grupper (figur 1, tabell 5). Videre ble forholdet mellom den clinicopathological variabler og protein ekspresjon undersøkt og er oppsummert i tabell 1, Tabell 2 og Tabell 3. En statistisk analyse viste at den positive uttrykk hastighet GOLPH3 i magekreft gruppen sterkt korrelert med histologisk karakter (
p
= 0,011), dybde av invasjon (
p
= 0,007), fjernmetastaser (
p
= 0,002), og spredning til lymfeknuter (
p
0,004), mens det ikke signifikant korrelert med alder eller kjønn (
p
= 0,801 og 0,833, henholdsvis). Interessant, var de høye uttrykk nivåer av p-Akt, p-mTOR, p-4E-BP1 og p-p70S6 observert å være i samsvar med høy GOLPH3 uttrykk
A:. Den magekreft gruppe B: karsinom -adjacent vev gruppe C: Det parede normalt vev gruppe. Representative vevssnitt fra magekreft gruppen (n = 80), vevet gruppe karsinom-tilstøtende (n = 80) og den parede vev gruppen normal (n = 80). Immunhistokjemi Resultatene viste at den GOLPH3, p-Akt, p-mTOR og p-4E-BP1 ble mest uttrykt i kjernen, p-p70S6 ble mest uttrykt i cytoplasma. Den GOLPH3, fosforylert Akt-mTOR signalveien, p-4E-BP1 og p-p70S6 ble sterkt uttrykt i magekreft grupper.
mRNA uttrykk for GOLPH3 og mTOR signalveien relaterte gener ved RT-PCR
Vi hentet RNA fra magekreft, para-karsinom vev, og matchet prøvene normale vev fra åtti pasienter med magekreft. Uttrykket nivåer av GOLPH3 og mTOR signalveien-relaterte gener, inkludert Akt, mTOR, eukaryote translasjonsinitieringssete faktor 4E binding protein 1 (4E-BP1), og p70 ribosomalt protein S6-kinase (p70S6), ble undersøkt i tre grupper ved RT -PCR. Uttrykket nivåer av disse genene i gastrisk karsinom var høyere enn i carcinoma-tilstøtende vev og signifikant høyere enn i normale sammenkoblede gastrisk vev. Den midlere tetthet og ekspresjon fordeling av GOPLH3, mTOR, Akt, 4E-BP1 og p70S6 er vist i figur 2. En statistisk analyse viste at uttrykket nivåer av GOLPH3 og mTOR signalveien-relaterte gener som var signifikant forskjellig i forskjellige gastrisk vev (
p
0,05)
kreft. Den magekreft (n = 80); paracancerous: Den paracancerous gruppe vev (n = 80); normal: Den paret normal mageslimhinnen (n = 80). A, B, C, D og E: mRNA nivåene av GOPLH3, Akt, mTOR, 4E-BP1, p70S6 i forskjellige målt ved hjelp av RT-PCR, respektivt. F, G, H, I og J: Densitometrisk kvantifisering av GOLPH3, Akt, mTOR, 4E-BP1 og p70S6 mRNA uttrykk i ulike vev, henholdsvis. Den mRNA-ekspresjon var signifikant forskjellige med hverandre og nådde en topp på kreft. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SE. *
p
0,05 versus kreft,
#
p
. 0,05 versus paracancerous
Protein uttrykk for GOLPH3 og mTOR signalveien relaterte proteiner ved Western blotting
Western blotting-analyse viste at GOLPH3, p-mTOR, ble p-akt1, p-4EB-P1 og p-p70S6 også til uttrykk i magekreft, kreft-tilknytning, og paret normal mageslimhinnen grupper. Interessant nok var en progressiv økning observert i middelverdiene av de nevnte protein ekspresjonsnivåene fra den sammenkoblede normal gastrisk mucosa gruppe til magekreft gruppen (figur 3), og det var en signifikant forskjell mellom gruppene (
p
0,05)
A:. protein~~POS=TRUNC nivåer av GOPLH3, p-Akt, p-mTOR, p-4E-BP1 og p-p70S6 i forskjellige målt ved Western blotting. B, C, D, E og F: Den GOPLH3, p-Akt, p-mTOR, p-4E-BP1 og p-p70S6 proteinnivåer i de forskjellige vev, henholdsvis. kreft: Den magekreft (n = 80); paracancerous: Den paracancerous gruppe vev (n = 80); normal: Den paret normal mageslimhinnen (n = 80). Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SE. *
p
0,05 versus kreft,
#
p
. 0,05 versus paracancerous
Korrelasjon mellom uttrykket av GOLPH3 og signalering signale sti-relaterte proteiner
Pearsons korrelasjonsanalyse viste en sterk korrelasjon mellom GOLPH3 ekspresjon og den til signalveien (tabell 6). En statistisk analyse viste at Pearsons produktmoment korrelasjonskoeffisient var alle positive i magekreft-gruppen. Interessant, GOLPH3 uttrykk var sterkt assosiert med p-mTOR, p-4E-BP1 og p-p70S6 (
r
= 0,410, 0,203 og 0,128, henholdsvis
p
0,05) uttrykk og en positiv korrelasjon mellom GOLPH3 og p-Akt var nesten signifikant (
p
= 0,054). I mellomtiden ble det observert sterke korrelasjon mellom ekspresjonen av p-4E-BP1 og de ovennevnte proteiner med unntak av p-mTOR. Fosforylert mTOR uttrykk ble også positivt korrelert med p-Akt uttrykk (
r
= 0,521,
p
= 0,027). Fosforylert p70S6 uttrykk ble også korrelert med uttrykk for p-Akt (
r
= 0,274,
p
0,001) og p-mTOR (
r
= 0,451,
p
= 0,007).
Diskusjoner
Selv om forekomsten av magekreft har falt de siste årene [2], er det fortsatt en alvorlig trussel mot menneskers helse . De fleste mage kreftpasienter er diagnostisert i avansert stadium og har en tendens til å presentere med tumorinvasjon og metastasering. I løpet av det siste tiåret, har ingen store forbedringer er oppnådd om tidlig diagnostikk og behandling av magekreft. En forståelse av molekylærbiologi underliggende magekreft er fortsatt mangelfull. Siden 2009 har GOLPH3 fått stor oppmerksomhet som et onkogen. Dette proteinet lokaliserer til den cytoplasmatiske ansiktet av trans-Golgi og har vært nært knyttet til tumorigenicity [3], [8]. Store studier har funnet at GOLPH3 overekspresjon forekommer i flere humane kreftformer, inkludert epitelial ovarialcancer, nyrecellekarsinom, glioblastoma multiforme, esophageal plateepitelkarsinom, og muntlig tungen kreft [12] – [16]. Tyder på at GOLPH3 er involvert i tumordannelse og korrelerer med dårlig prognose. Videre en studie rapporterte at GOLPH3 overekspresjon er assosiert med dårlig klinisk utfall i mage kreft [17]. Men de nøyaktige mekanismene bak dette forholdet er uklart, og det nøyaktige molekylære mekanismen som GOLPH3 er involvert i magekreft tumorigenesis, invasjon og metastasering er dårlig forstått. For å undersøke potensialet molekylære mekanismen som GOLPH3 er involvert i magekreft, vi først brukt immunhistokjemi for å finne GOLPH3 uttrykk i ulike mage vev. Vi fant ut at GOLPH3 var først og fremst lokalisert til cytoplasma, og det ble uttrykt i magekreft, para-karsinom og sammenkoblede normale mage vev. Interessant, satsene for høy GOLPH3 uttrykk var 75,00% (60 av 80) i mage kreft vev, 43,75% (35 av 80) i carcinoma-tilstøtende vev og 12,50% (10 av 80) i normalt vev, henholdsvis ( tabell 5). Videre GOLPH3 over-uttrykk ble observert i magekreft vev og ble svært knyttet til magekreft invasjon og metastasering. Våre resultater antydet at høy GOLPH3 uttrykk var signifikant relatert til histologisk grad (
p
= 0,015), dybde av invasjon (
p
0,001), lymfeknutemetastase (
p
0,001), og fjernmetastaser (
p
= 0,006) i mage kreft vev (tabell 1). I tillegg ble Western blotting og RT-PCR utført for å evaluere GOLPH3 ekspresjon på protein og mRNA-nivåer. Interessant, resultatene var lik de som ble observert i immunhistokjemi analyse. Ovennevnte funn tyder på at økt GOLPH3 uttrykket er nært knyttet til forekomst av magekreft, og GOLPH3 kan være involvert i magekreft invasjon og metastasering.
Nylig, et økende antall signaloverføringsveier har blitt rapportert til være involvert i tumorinvasjon og metastasering. Pattedyr-target av rapamycin (mTOR), som er en serin /treonin kinase nedstrøms av fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) /Akt signalveien og omfatter mTORC1 (mTOR /RAPTOR) og mTORC2 (mTOR /RICTOR), regulerer proteinsyntese, celle proliferasjon, cellemetabolisme og differensiering [18], [19]. Aktivert mTORC1 sekvensielt aktiverer nedstrøms mål, deriblant p70S6 kinase (S6K) og eukaryote initiering faktor direkte 4E-bindende protein 1 (4E-BP1), og mTORC2 har vist seg å spille en avgjørende rolle i Akt fosforylering ved Ser473, noe som resulterer i full aktivering av Akt [20], [21]. Selv om Akt aktiverer mTOR /RAPTOR direkte, kan den også direkte eller indirekte aktiverer p70S6 kinase /4EBP1 vei denne veien ved fosforylering tumor suppressor TSC2 [22]. Den Akt /mTOR bane har vist seg å være hyppig aktiveres på forskjellige ondartede tumorer, inkludert brystkreft, urothelial carcinom, eggstokk-kreft, bukspyttkjertel nevroendokrine tumorer, human medulloblastom, melanom, livmorkreft og leverkreft; Derfor, representerer denne veien en mulig terapeutisk mål i mange kreftformer [23] – [30]. I vår studie, RT-PCR og Western blotting viste at mRNA og protein uttrykk nivåer av p-Akt, p-mTOR, p-4E-BP1 og p-p70S6 i magekreft gruppen var signifikant høyere enn i para-karsinom vev og normale sammenkoblede grupper gastrisk vev (figur 2, figur 3). For å avgjøre om uttrykket nivåer av p-Akt, p-mTOR, p-4E-BP1 og p-p70S6 var assosiert med kritiske clinicopathological egenskaper, utførte vi videre analyser. I denne studien, 81,25% av 80 pasienter med magekreft hadde høy p-mTOR uttrykk, 77,50% hadde høy p-4E-BP uttrykk, 76,25% hadde høy p-p70S6 uttrykk, og bare 75,00% hadde høy p-Akt uttrykk (tabell 5). Overraskende nok en immunohistokjemisk analyse viste at uttrykket nivåer av disse protein uttrykkene var signifikant assosiert med dybden av invasjon, lymfeknute og fjern metastase, og histologiske grad, men var ikke forbundet med kjønn eller alder (Tabell 1, Tabell 2 og tabell 3) . Disse resultater antyder at den Akt /mTOR-reaksjonsveien er aktivert i magekreft, og kan spille en viktig rolle i magekreft tumorgenese, invasjon og metastase.
Nylig, Scott et al. avdekket at GOLPH3 kan fremme celle transformasjon og tumorvekst av konstitutivt aktivere mTOR signalveien i melanom celler og at GOLPH3 stimulerer mTOR signalveien via mTORC1 og mTORC2 komplekser, og dermed fremme tumorcellevekst og spredning [8]. Det er imidlertid uklart hvorvidt dette fenomen også forekommer i magekreft vev. Så vidt vi vet, er vår studie den første til å utforske patogenesen av GOLPH3 fremmet tumorigenesis, invasjon og metastasering av magekreft. Våre data viser en signifikant positiv sammenheng mellom ekspresjonen av GOLPH3 og p-mTOR, p-4E-BP1, og p-p70S6 (
r
= 0,410, 0,203 og 0,128, respektivt,
p
0,05). Men sammenhengen mellom uttrykk for GOLPH3 og p-Akt var ikke signifikant (
r
= 0,258,
p
0,05) (Tabell 6). Spesielt ble signifikant høyere GOLPH3 ekspresjon ledsaget av høy ekspresjon av p-mTOR, p-4E-BP1, og p-p70S6 i magekreft vev, og dette forholdet ble signifikant assosiert med dybden av invasjon, histologiske grad, og lymfeknute og fjernmetastaser. Våre resultater viste ulike sammenhenger mellom GOLPH3 og Akt /mTOR signaliserer proteiner, og den positive sammenhengen mellom GOLPH3 og p-Akt var nesten signifikant. De konkrete årsakene til dette forholdet mellom GOLPH3 og p-Akt er uklare og bør undersøkes nærmere. Vi spekulerer i at utvalgsstørrelsen kan ha vært for liten. I tillegg kan GOLPH3 primært aktivere Akt /mTOR-signalveien via den aktiverte mTORC1 kompleks snarere enn mTORC2 kompleks, noe som resulterer i p70S6 og 4E-BP1 fosforylering, og dermed påvirke magekreft. Disse resultatene indikerer at GOLPH3 kan være involvert i magekreft tumorgenese, invasjon og metastase via unormal aktivering av Akt /mTOR-signalveien.
Som konklusjon, denne studien har oppdaget at høye ekspresjonsnivåer av GOLPH3, p-Akt, p-mTOR, p-4E-BP1 og p-p70S6 i magekreft gruppen sterkt som korrelert med histologisk grad, dybden av invasjonen, fjernmetastaser, og spredning til lymfeknuter ved clinicopathological variabler analyse og immunhistokjemi. Videre er ekspresjon av GOPLH3 høyt korrelert med aktiveringen av Akt /mTOR-signalveien i humane magecancerprøver. Basert på disse resultatene, spekulerer vi at GOLPH3 kan bli påvirket progresjon og metastasering av magekreft gjennom aktivering av Akt /mTOR signalveien. Videre foreslår at inhibering av ekspresjonen av gener i GOLPH3 og mTOR-signalreaksjonsveien kan representere et nytt mål for magekreft terapi. Endelig invasjonen og migrasjon mekanismer for GOLPH3 i magekreft trenger ytterligere etterforskning.
