Abstract
En CpG island methylator fenotype (CIMP) vises ved en distinkt undergruppe av kolorektal kreft med en høy frekvens av DNA hypermethylation i en bestemt gruppe av CpG øyer. Nyere studier har vist at en aktiverende mutasjon av
BRAF plakater (BRAF
V600E) er tett forbundet med CIMP, å reise spørsmålet om hvorvidt BRAF
V600E spiller en kausal rolle i utviklingen av CIMP eller om CIMP gir et gunstig miljø for kjøp av BRAF
V600E. Vi ansatt Illumina Golden DNA metylering teknologi, som interrogates 1,505 CpG steder i 807 forskjellige gener, for å studere denne foreningen. Vi først undersøkt om uttrykk for BRAF
V600E forårsaker DNA hypermethylation av stabilt uttrykker BRAF
V600E i CIMP-negative,
BRAF
villtype COLO 320DM tykktarmskreft cellelinje. Vi er fast bestemt 100 CIMP-forbundet CpG nettsider og undersøkt endringer i DNA metylering i åtte stabilt transfekterte kloner over flere passasjer. Vi fant ut at BRAF
V600E er ikke tilstrekkelig til å indusere CIMP i vårt system. Dernest vurderer alternativ mulighet, identifiserte vi gener som DNA hypermethylation ble nært knyttet til BRAF
V600E og CIMP i 235 primære kolorektal tumorer. Interessant, gener som viste mest signifikant sammenheng omfatter de som megle ulike signalveier involvert i kolorektal tumorigenesis, for eksempel
BMP3 Hotell og
BMP6 plakater (BMP signalering),
EPHA3
KIT
, og
FLT1 plakater (reseptor tyrosin kinaser) og
SMO plakater (Hedgehog signalering). Videre identifiserte vi CIMP-avhengig DNA hypermethylation av
IGFBP7
, som har vist seg å mekle BRAF
V600E-indusert mobilnettet senescence og apoptose. Arrangøren DNA hypermethylation av
IGFBP7
var assosiert med stanse av genet. CIMP spesifikke inaktivering av BRAF
V600E-indusert senescence og apoptose trasé med
IGFBP7
DNA hypermethylation kan skape en gunstig kontekst for kjøp av BRAF
V600E i CIMP + tykktarmskreft. Våre data vil være nyttig for fremtidige undersøkelser mot å forstå CIMP i tykktarmskreft og få innsikt i rollen som avvikende DNA hypermethylation i kolorektal tumorigenesis
Citation. Hinoue T, Weisenberger DJ, Pan F, Campan M, Kim M Young J et al. (2009) Analyse av foreningen mellom CIMP og BRAF
V600E i tykktarmskreft ved DNA Metylering Profiling. PLoS ONE 4 (12): e8357. doi: 10,1371 /journal.pone.0008357
Redaktør: Chun Ming Wong, University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 06.09.2009; Godkjent: 20 november 2009; Publisert: 21.12.2009
Copyright: © 2009 Hinoue et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. National Institutes of Health (NIH) tilskudd R01 CA118699-02 (PW Laird), R01 CA075090-09 (PW Laird). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Peter Laird er konsulent for Epigenomics AG og for Celgene Corporation. De andre forfatterne avslørt ingen potensiell konkurrerende interesse. Dette arbeidet ble ikke støttet av enten Epigenomics AG eller Celgene Corporation. Disse selskapene hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
Innledning
Aberrant DNA metylering ved CpG øyer har blitt mye observert i kreft. Promoter CpG øy hypermethylation forbundet med inaktivering av utvalgte tumorsuppressorgener ser ut til å være kritisk i tumorer fra starten frem til vedlikehold av tumoren fenotype [1]. Distinkte undergrupper av flere typer humane cancere har vært foreslått å ha en CpG øy methylator fenotypen (CIMP), hvor en usedvanlig høy frekvens av cancer-spesifikk DNA hypermethylation er funnet [2], [3]. Selv om dette konseptet har vært kontroversielt [4], har vi bekreftet eksistensen av CIMP i tykktarmskreft i en storstilt omfattende studie [5].
CIMP i kolorektal kreft kan oppstå gjennom en tydelig sti opprinnelse i visse subtyper av taggete polypper [6] og er observert hos omtrent 15% av alle kolorektal kreft tilfeller [5], [7]. Funksjoner knyttet til CIMP i kolorektal kreft inkluderer kjønn (kvinne), proksimal beliggenhet og dårlig differensiert eller mucinous histologi [3], [5], [7], [8]. Vår studie ved hjelp av en nyutviklet CIMP markør panel i kolorektal kreft viste at sporadisk mikro ustabilitet (MSI +) oppstår som en konsekvens av CIMP-forbundet
MLH1
DNA hypermethylation [5]. Videre fant vi en sterk sammenslutning av CIMP med tilstedeværelse av en aktivert mutant form av
BRAF plakater (BRAF
V600E) [5]. Både CIMP og
BRAF
mutasjoner har blitt rapportert i de tidligste stadiene av kolorektal neoplasi: CIMP i tilsynelatende normal slimhinne av pasienter disponert for flere taggete polypper [9] og
BRAF
mutasjoner i avvikende krypten foci [10].
RAS-RAF-MEK-ERK signalveien er ofte hyperactivated i tykk- og endetarmskreft.
KRAS
mutasjoner forekommer hyppigst i 30-40% av alle kolorektal kreft [11] og
BRAF
mutasjoner er til stede ved en frekvens på 5-22%, hvor det konstitutivt aktiverte BRAF
V600E variant står for ~90% av alle
BRAF
mutasjoner [12]. Mutasjoner i
KRAS Hotell og
BRAF
er generelt gjensidig utelukkende, noe som tyder på tilsvarende nedstrøms effekter i tumorigenesis [13]. Imidlertid har nyere studier indikerte at mutasjoner av disse genene kan spille forskjellige roller i startfasen og /eller vedlikehold [10], [14].
Den ekstremt tett sammenheng mellom BRAF
V600E og CIMP øker spørsmålet om BRAF
V600E spiller en kausal rolle i utviklingen av CIMP eller om CIMP-assosiert promoter hypermethylation gir et gunstig miljø for kjøp av BRAF
V600E. I denne studien har vi søkte etter mulige molekylære forklaringer på sammenhengen mellom BRAF
V600E og CIMP hjelp av Illumina Golden DNA metylering plattform, som undersøker DNA metylering status for 1,505 CpG områder som ligger på 807 gener. Den Golden DNA metylering analysen har vært mye brukt i ulike studier, og er nå en standard metode for DNA metylering analyse [15] – [24]. Resultatene oppnådd fra de kommersielt tilgjengelige «Golden Metylering Cancer Panel I», i særdeleshet, har blitt validert ved hjelp av forskjellige andre teknikker [15] – [17], [22], [23], slik at det er en pålitelig kilde for DNA-metylering målinger på tvers 1,505 loci. Vi var ikke i stand til å demonstrere en årsaks bidrag BRAF
V600E å CIMP i våre cellekultur system. Men vi identifisert gener som DNA hypermethylation var signifikant forbundet med BRAF
V600E i grunnskolen kolorektal tumorer. Inaktivering av disse spesifikke gener i sammenheng med CIMP kan kjøre oppkjøpet av BRAF
V600E i CIMP + kolorektal tumorer.
Resultater
Karakterisering av 21 Menneskelig tykktarmskreft cellelinjer
Vi først forsøkt å finne ut om uttrykk for BRAF
V600E ville indusere DNA hypermethylation på CpG nettsteder knyttet CIMP i en
in vitro
cellekultur system. Siden primær colonic epitelceller ikke var lett tilgjengelig, vi screenet for kolorektal kreft cellelinjer som ikke har vesentlig DNA metylering ved CIMP-definer loci og bærer villtype former av både
BRAF Hotell og
KRAS
. Slike cellelinjer kan tjene som egnede systemer for innføring av BRAF
V600E. Vi valgte 21 kolorektal kreft cellelinjer, preget deres DNA metylering profiler, og bestemmes deres
BRAF Hotell og
KRAS
mutasjonsstatus (figur 1). Vi brukte MethyLight for å vurdere DNA-metylering status av fem CIMP-definerende markører som tidligere er identifisert i vårt laboratorium [5]. Ved hjelp av en PMR (prosent av denaturert referanse) av ≥10 som en terskel for positiv metylering, identifiserte vi seks cellelinjer som manglet DNA metylering for alle fem CIMP-spesifikke markører (figur 1). For å teste vår hypotese, vi først valgte
BRAF Hotell og
KRAS
villtype Caco-2 og COLO 320DM cellelinjer for deres enkle dyrking og transfeksjon. Imidlertid er studien beskrevet nedenfor begrenset til COLO 320DM celler, siden vi ikke var i stand til å isolere noen stabilt transfekterte Caco-2 kloner som viste påviselig nivå av BRAF
V600E uttrykk (data ikke vist).
MethyLight ble brukt til å vurdere DNA metylering status for fem CIMP-definerende markører. En PMR av ≥10 ble anvendt som en positiv terskel for metylering. Svarte bokser indikerer PMR ≥10, og hvite bokser indikerer PMR 10. De DNA-metylering frekvensene av de fem CIMP markører øker fra topp til bunn. Mikro ustabilitet status for hver cellelinje er oppført som mikro stabil (MSS) eller husing ustabilitet (MSI). Mutasjonen status for
BRAF
ekson 15 og
KRAS
exon 2 er listet opp.
Stall Transfeksjon av BRAF
V600E i COLO 320DM Cells
Vi transfektert COLO 320DM celler med et HA-merket BRAF
V600E cDNA og isolerte G418-resistente kloner. Ekspresjonsnivået av BRAF
V600E ble bestemt ved Western-blotting ved anvendelse av et antistoff mot HA-epitop (figur 2A). Aktiviteten av BRAF
V600E ble bekreftet ved undersøkelse av aktivering av ERK1 /2 ved bruk av et antistoff mot fosforylert ERK1 /2 (figur 2A). Åtte stabilt transfekterte kloner som oppviser høy ekspresjon av BRAF
V600E, samt sterk aktivering av ERK1 /2, ble individuelt dyrket i kultur, og genomisk DNA ble isolert ved forskjellige passasjer (mellom 2 og 27) fra disse klonene. Fire tom-vektor transfekterte kloner (EVCs) ble dyrket i de samme betingelser og brukt som kontroller.
(A) Uttrykk for BRAF
V600E og ERK1 /2 fosforylering i stabilt transfekterte COLO 320DM celler. Blotter ble undersøkt med anti-HA antistoffer for HA-BRAF
V600E, anti-fosfor-ERK1 /2, og anti-ERK1. Stjernene viser de åtte BRAF
V600E transfekterte kloner som ble utsatt for DNA metylering analyse på ulike celle passasjer. (B) DNA metylering profiler av utransfekterte COLO 320DM celler, tom vektor og BRAF
V600E transfektert COLO 320DM kloner, som bestemmes av Illumina Golden DNA metylering analyse. DNA-metylering data ble scoret som betaverdier som tidligere definert [16]. Hver rad tilsvarer en individuell CpG locus og dataene ble sortert etter gjennomsnittlig β-verdi på tvers av alle prøver. Hver klon er bestilt fra venstre til høyre i økende antall passasjer. EVC: tom-vektor transfekterte kloner
DNA Metylering Analyse av BRAF
V600E transfekterte COLO 320DM Clones
neste fastsatte DNA metylering status for 1,505 CpG områder som ligger ved. 807 forskjellige gener i hver av de åtte BRAF
V600E kloner og fire EVCs hjelp av Illumina Golden Metylering Cancer Panel en plattform (figur 2B). Vi fant at DNA metylering betaverdiene på tvers av alle 1505 CpG nettsteder i BRAF
V600E transfekterte kloner (uavhengig av deres BRAF
V600E uttrykk nivå) var veldig lik de tom-vektorkontroll kloner og relativt stabil over tid. Dette tyder på at det ikke var noen generell økning i DNA hypermethylation i BRAF
V600E transfektert kloner i CpG mål analysert (figur 2B).
Vi neste fastslått om den stabile uttrykk for BRAF
V600E spesielt økt DNA metylering av bare CIMP-assosiert markører i 1,505 forhørt CpG nettsteder. Disse nettstedene ble bestemt ved screening 58 primære kolorektale tumorprøver ved hjelp av Illumina Golden DNA metylering plattform (Dataset S1). Mutasjonen status for
BRAF Hotell og
KRAS
i disse prøvene hadde blitt bestemt tidligere [5] (tabell S1). Unsupervised todimensjonal cluster analyse av DNA metylering betaverdier avdekket en tydelig klynge av 11 tumorprøver, de fleste som inneholdt BRAF
V600E og viste hyppig DNA metylering av kjente CIMP-assosiert markører, inkludert
CDKN2A, IGF2
, og
MLH1
(data ikke vist). Vi definerte denne undergruppen som CIMP-positive tumorer (figur 3). Vi identifiserte totalt 100 CpG områder som har betydelig høyere nivåer av DNA-metylering i CIMP-positive (CIMP +) versus CIMP-negative (CIMP-) svulster (
P
0,001 etter korreksjon for multiple sammenligninger, se Materialer og metoder) (tabell S2). Det bør bemerkes at reaksjoner for tre av de MethyLight-baserte CIMP markører (
CACNA1G
,
NEUROG1
, og
SOCS1
) tidligere identifisert i vårt laboratorium er ikke inkludert i Illumina Golden Metylering Cancer Panel en plattform.
RUNX3
Illumina Golden reaksjoner viste ikke CIMP spesifikk atferd. En mulig forklaring på dette avviket kan være at disse reaksjonene er designet rundt transkripsjon start stedet for
RUNX3
isoform 1, mens vår CIMP spesifikke
RUNX3
MethyLight reaksjon er utformet på arrangøren CpG island av
RUNX3
isoform 2 [5]. Vi så ingen åpenbar forskjell i DNA metylering mellom BRAF
V600E transfekterte kloner og EVCs på disse CIMP-forbundet CpG områder (figur 3). Interessant, observerte vi at det midlere DNA-metylering β-verdi på 100 CIMP-spesifikke loci øket som en funksjon av celle passasje (figur 4A og 4B). Men denne økningen ikke korrelerer med nivåene av BRAF
V600E uttrykk og ble også observert i celler transfektert med kontroll vektor (figur 4B). Denne generelle økning i gjennomsnittlig β-verdi er spesifikk for CIMP-assosiert loci, ettersom den midlere β-verdi fra flere sett med 100 tilfeldig valgte CpG områder ikke viste en lignende trend (figur 4C og 4D). Derfor konkluderte vi med at, selv om CIMP-forbundet CpG øyer kan være utsatt for skaffe DNA metylering i visse kulturforhold, BRAF
V600E ikke spesifikt induserer CIMP i COLO 320DM celler.
CIMP + svulster og CIMP -associated loci i 58 primærtumorprøver ble definert som beskrevet i Materialer og metoder. Hver rad tilsvarer en individuell geometriske sted for 100 locus panel, og dataene ble sortert etter den midlere β-verdien for hvert locus enn alle 58 primærtumorprøver. Hver BRAF
V600E transfektert klone og EVC er bestilt fra venstre til høyre i økende antall passasjer. Svulster med
BRAF Hotell og
KRAS
mutasjoner er angitt med en sirkel og en trekant, henholdsvis. X: mutasjonsstatus er ikke tilgjengelig. Hver BRAF
V600E transfektert klone og EVC er bestilt fra venstre til høyre i økende antall passasjer. «P» indikerer DNA metylering profiler av foreldre utransfekterte COLO 320DM celler.
Svarte linjer viser BRAF
V600E uttrykke kloner og grå linjer representerer tom-vektor transfektert kontroll kloner. Hvert plottepunkt representerer bety betaverdier over angitt CpG nettsteder fra Illumina Golden DNA metylering analyse på ulike passasjer for hver klone. (A) Alle 1505 CpG loci fra Illumina Golden analysen. (B) Kun 100 CIMP-forbundet loci er profilert. (C) Ett hundre tilfeldig valgt CpG loci. (D) Ett hundre ikke-CIMP loci, som viser at beta verdier tilsvarende 100 CIMP-forbundet loci.
Identifisering av gener som er betydelig denaturert i tykktarmssvulster huse BRAF
V600E
Vi har som et alternativ hypotese at arrangøren metylering av spesifikke genet mål gir et gunstig miljø for kjøp av
BRAF
mutasjon i CIMP + kolorektal kreft. Vi har tidligere identifisert CIMP status og
BRAF
mutasjonsstatus av 235 primære kolorektale tumorprøver [5]. Vi fant BRAF
V600E i 33 svulster (14,0%); 31 av disse ble klassifisert som CIMP + og bare to som CIMP-. Vi utførte Illumina Golden DNA metylering analyse på disse prøvene, og identifisert 60 gener, representert ved 89 CpG nettsteder, som er betydelig metylert (
P
0,001) i de 33 BRAF
V600E-positive svulster (tabell S3). Disse genene er kandidater for CIMP spesifikke inaktivering, som kan tett synergize med BRAF
V600E å fremme tumorigenesis.
For å validere data generert ved hjelp av Golden DNA metylering plattform, vi analyserte DNA metylering status for fire CIMP-spesifikke gener (
CALCA
,
EPHA3
,
KIT
, og
SLC5A8
) på en undergruppe av fire CIMP-positive og 16 CIMP -negative tumorer på Illumina infinium DNA metylering plattform. Disse fire gener ble valgt fordi både analytiske plattformer avhøre DNA metylering status for identiske CpG dinucleotide. Vi undersøkte samstemmighet av DNA metylering på hver av disse loci mellom de to plattformene, og fant en høy korrelasjonskoeffisient i alle tilfeller (
CALCA
: 0,94,
EPHA3
: 0,95,
KIT
: 0,95,
SLC5A8
. 0,86), utlån ytterligere støtte til vår første Goldenbaserte DNA metylering skjermen
Vi har bekreftet nylig observerte sammenhenger mellom DNA hypermethylation av
BMP3 Hotell og
MCC
med CIMP + og BRAF
V600E i tykk- og endetarmskreft [25], [26]. Vi fant også CIMP spesifikk DNA hypermethylation av
BMP6.
Samtidig epigenetisk inaktivering av
BMP3 Hotell og
BMP6
ble vist å være assosiert med aktivering av RAS-RAF -MEK-ERK signalveien i ikke-små-celle lungekreft [27]. Videre fant vi en sammenslutning av
SLC5A8 Hotell og
TIMP3
DNA metylering med BRAF
V600E i våre kolorektale tumorprøver, som hadde vært tidligere rapportert i papillær skjoldbrusk carcinoma [28]. Den funksjonelle konsekvens av DNA hypermethylation av slike tumorsuppressorgener knyttet CIMP + og BRAF
V600E er fortsatt spekulative [25] -. [28]
Videre fant vi at DNA metylering av
SMO
, en komponent av Hedgehog (Hh) signalering, var tett knyttet til kolorektal tumorer med BRAF
V600E (tabell S3). Forbløffende nok har det nylig blitt rapportert at økt uttrykk av
SMO
bidrar til tykktarms tumorigenesis [29]. Imidlertid Arimura et al. viste også at kolorektal kreft cellelinjer husing BRAF
V600E, inkludert COLO 205, HT-29 og RKO, synes ikke å vise uttrykk for
SMO product: [29]. Våre data indikerer at CIMP-promoter DNA hypermethylation kan være involvert i undertrykkelse av
SMO
i tykktarmssvulster bærer BRAF
V600E (tabell S3).
Arrangøren DNA Hypermethylation og Transkripsjonell lyddemping av
IGFBP7
i
BRAF
Mutant CIMP + tykktarmskreft
Vi identifiserte
IGFBP7
promoter CpG island som et mål for DNA metylering i tykktarmssvulster huse BRAF
V600E (
P
verdi = 3,1 × 10
-9, Odds ratio = 12). BRAF
V600E har vist seg å indusere cellulær senescens [30] – [32]. Onkogen-indusert senescence (OIS) har blitt anerkjent som en viktig tumor suppressor mekanisme [33]. Den underliggende molekylære mekanismen av BRAF
V600E-indusert alderdom og apoptose har blitt belyst i en fersk studie [34]. Det har blitt vist at ekspresjonen av
IGFBP7
er både nødvendig og tilstrekkelig til å indusere alderdom og apoptose mediert av BRAF
V600E. Forbløffende
IGFBP7
ble vist å være epigenetiske brakt til taushet av CpG island promoter hypermethylation spesielt i grunnskolen melanom prøver bærer BRAF
V600E, noe som indikerer at tap av
IGFBP7
uttrykk er avgjørende for utviklingen av BRAF
V600E-positive melanom [34].
Illumina Golden metylering Cancer Panel en plattform inneholder to
IGFBP7
prober (IGFBP7_P297_F og IGFBP7_P371_F) som avhøre DNA metylering status av to distinkte CpG dinukleotider i
IGFBP7
promoter CpG island (figur 5A). Vi fant ut at disse to CpG områdene i
IGFBP7
promoter er kreft-spesifikt metylert (figur 5B) og sterkt assosiert med både BRAF
V600E (Wilcoxon rank sum test,
P
verdi = 2,0 × 10
-10) og CIMP (
P
verdi = 3,6 × 10
-9) (figur 5C). Det har blitt rapportert at kolorektal tumorer med
KRAS
mutasjoner viser også DNA hypermethylation på CIMP-assosiert markører, om enn på en lav frekvens, og har høye nivåer av DNA metylering av gener som gjennomgår aldersassosiert DNA hypermethylation. Disse svulster er blitt beskrevet som CIMP-lav eller CIMP2 [35], [36]. Vi fant ikke en sammenheng mellom
IGFBP7
DNA hypermethylation og
KRAS
mutasjoner når vi ekskluderte tumorer med mutert
BRAF product: (
P
verdi = 0,85) . Etter avtale med disse observasjonene, fant vi at DNA hypermethylation av
IGFBP7
er stort sett til stede i kolorektal kreft cellelinjer som rommer BRAF
V600E og viser hyppig DNA metylering av de fem-genet CIMP-spesifikk markør panel tidligere beskrevet (figur 6). Real-time RT-PCR analyse av kolorektal kreft cellelinjer viste at
IGFBP7
mRNA uttrykk ble omvendt relatert til DNA hypermethylation, som cellelinjer med
IGFBP7
hypermethylation viste liten eller ingen
IGFBP7
genekspresjon (figur 6). Blant de CIMP- cellene vi undersøkte, bare COLO 320DM viste DNA hypermethylation av
IGFBP7
CpG island arrangøren med minimal grad av uttrykk. I ettertid kan dette unike karakteristisk for COLO 320DM celler sammenlignet med de andre CIMP- cellelinjer har aktivert disse cellene til å tolerere mutant
BRAF
overekspresjon, og kan forklare våre vanskeligheter med å skaffe BRAF
V600E uttrykke kloner i annet tykktarmskreft cellelinje som Caco-2.
(A) Genomisk kartet
IGFBP7
promoter-forbundet CpG island, transkripsjon start hotellet (TSS) og ekson 1 basert på UCSC genom nettleser (mars 2006 montasje). Plasseringen av CpG nettsider avhørt av Illumina Golden DNA metylering analysen er angitt med vertikale piler. (B) DNA metylering nivåer av de to CpG dinucelotides i
IGFBP7
arrangøren CpG island. P-verdier for hver CpG området i 10 svulster (fem CIMP- svulster med vill-type
BRAF Hotell og fem CIMP + tumorer med mutert
BRAF
, svarte striper) og tilstøtende ikke-tumorvev ( grå søyler) er oppført. (C)
IGFBP7
promoter DNA metylering boksplott av 235 menneskelige kolorektal tumorer stratifisert etter
BRAF
mutasjonsstatus (til venstre) og CIMP + status (til høyre) på
IGFBP7
P371 locus. I boksplottene, endene av boksen er den 25. og 75. kvartiler. Linjen innenfor boksen identifiserer median β-verdi. Værhårene over og under boksen utvide til på de fleste 1,5 ganger IQR. Den CIMP status for hver kolorektal tumorprøve bestemmes som beskrevet i Materialer og metoder.
kvantitativ real-time RT-PCR analyse av
IGFBP7
uttrykk.
IGFBP7
uttrykk nivåer presenteres i forhold til
PCNA
uttrykk. Feilstolpene indikerer standardavviket av tekniske triplikate målinger. Antallet metylert loci blant de fem CIMP markører og mutasjonsstatus av
BRAF Hotell og
KRAS
oppført i figur 1 er gitt.
Diskusjoner
CIMP i kolorektal cancer gir en unik mulighet til å studere molekylære mekanismer som fører til epigenetiske endringer i kreft og bidragene fra disse endringene i utviklingen av sykdommen [3], [37]. De forskjellige funksjoner som finnes i CIMP er viktige ledetråder i å forstå dette fenotype [3], [5], [7], [8]. Spesielt påfallende er den ekstremt tett sammenheng mellom CIMP og BRAF
V600E [5]. Mekanismer som knytter epigenetisk (CIMP) og genetisk (
BRAF
mutasjon) hendelser og tidsmessige rekkefølgen disse to hendelsene finner sted har tiltrukket seg interesse [37].
I denne studien, ved hjelp av høy gjennomstrømming Illumina Golden DNA metylering plattform, undersøkte vi sammenhengen mellom CIMP og BRAF
V600E i tykk- og endetarmskreft. Vi testet først om uttrykk for BRAF
V600E forårsaker DNA hypermethylation av stabilt uttrykker BRAF
V600E i CIMP-negative,
BRAF
villtype COLO 320DM tykktarmskreft cellelinje. Vi har undersøkt DNA metylering endringer i 100 CIMP-forbundet CpG områder, og funnet ut at BRAF
V600E er ikke tilstrekkelig til å indusere DNA hypermethylation på disse stedene. En påminnelse av vårt system er at BRAF
V600E kan spille en rolle i å indusere DNA metylering bare tidlig i kolorektal tumorigenesis, som
BRAF
mutasjoner er blitt beskrevet i den tidligste fasen av svulst utvikling [10], [ ,,,0],38], [39]. Det er mulig at et unikt sett av genetiske og /eller epigenetiske endringene som skjedde i COLO 320DM celler kan ha skapt et ugunstig miljø for BRAF
V600E å indusere DNA hypermethylation. Forsøk som ligner de som er beskrevet ovenfor ved hjelp Caco-2 celler, som også viser CIMP- og bære
BRAF
-wild typen, var ikke vellykket. Vi var ikke i stand til å skaffe adgang stabilt transfekterte kloner som viste påvisbare nivåer av BRAF
V600E (data ikke vist). Vedvarende BRAF
V600E uttrykk kan være uforenlig med Caco-2 celleproliferasjon på grunn av mobilnettet senescence eller apoptose indusert av BRAF
V600E. Det er bemerkelsesverdig at vår RT-PCR-analyse viste robust uttrykk for
IGFBP7
, en formidler av BRAF
V600E-indusert senescence eller apoptose, i Caco-2 celler i motsetning til COLO 320DM celler.
Tidligere beskrev vi CIMP-forbundet metylering av
MLH1
som underliggende grunnlag for mismatch reparasjon mangel (MSI +) i sporadisk kolorektal kreft [5]. Minoo
et al.
Rapportert
MLH1
DNA metylering ved stabil transfeksjon av BRAF
V600E inn i NCM460 cellelinje [40]. I vårt system, kan vi ikke påvise en slik økning i
MLH1
DNA metylering (data ikke vist). Videre av 33 BRAF
V600E primære svulster undersøkte vi bare 42% (14/33) viste
MLH1
DNA hypermethylation. Derfor kan BRAF
V600E påvirke DNA hypermethylation av
MLH1
men bare under visse omstendigheter. Interessant, i den foreslåtte taggete vei til CIMP + svulster, både
BRAF
mutasjoner og CIMP + har blitt observert i tidlige forstadier, mens MSI + har ikke [6], [10], [41]. Således inaktivering av
MLH1
kan skje på et senere stadium av tumorutvikling. Minoo og kolleger observerte DNA hypermethylation av
CDKN2A Hotell og 15 andre CIMP-assosiert markører (
IGFBP7
ble ikke undersøkt) i foreldre NCM460 celler, noe som begrenset deres evne til å studere videre rolle BRAF
V600E indusere CIMP i sin eksperimentelle system [40].
Intriguingly, observerte vi at det samlede DNA-metylering nivået av CIMP spesifikke loci i våre stabilt transfekterte celler øker som en funksjon av cellepassasje. Det er interessant å merke seg at et utvalg medikament i dyrkede celler har blitt beskrevet til å resultere i endringer i den globale kromatinstruktur [42], og en tilsvarende prosess kan være forbundet med våre observasjoner her.
I tillegg har vi funnet forholdsvis stor inter klonal (blant forskjellige kloner) variasjon i DNA-metylering nivået i våre eksperimenter transfeksjons (figurene 2B og 3), med en gjennomsnittlig R «sup> 2 korrelasjon beregnes på grunnlag av fire EVCs av 0,88 ± 0,01 (± sD). Vår gjennomsnittlige intra-klonal (innen kloner på ulike passasjer) R
2 korrelasjonen er 0,97 ± 0,01 og R
2 korrelasjon mellom tekniske replikater i Illumina Golden DNA metylering analyse er 0.98 ± 0.02 [16]. Derfor har vi funnet noen store forskjeller i DNA metylering ved flere loci selv blant kontroll kloner (figur 2B og 3). Dette understreker viktigheten av å bruke flere kloner for denne typen studier.
Alternativt sterk sammenheng mellom CIMP og BRAF
V600E kan oppstå hvis CIMP gir spesielt gunstig mobil kontekst for BRAF
V600E til fremme tumorigenesis. I det andre settet med eksperimenter, bestemt vi gener som DNA hypermethylation var tett knyttet til BRAF
V600E og CIMP + i tykk- og endetarmskreft. Forbløffende nok observerte vi CIMP-avhengig DNA hypermethylation og transcriptional inaktivering av
IGFBP7
, som har vist seg å mekle BRAF
V600E-indusert mobilnettet senescence og apoptose [34]. BRAF
V600E har vist seg å indusere cellulær senescens i dyrkede primære humane celler, og [30], [31], så vel som musemodell [32]. Onkogen-indusert senescence (OIS) har blitt anerkjent som en viktig tumor suppressor mekanisme [33]. For BRAF
V600E å markedsføre sine onkogene effekter, er flere samarbeidende hendelser som kreves for å omgå senescence [33]. Nylig, det molekylære grunnlaget for BRAF
V600E-indusert alderdom og apoptose har blitt studert i detalj. Wajapeyee et al. identifisert
IGFBP7
som en formidler av BRAF
V600E-indusert senescence i humane primære fibroblaster ved hjelp av et genom-wide shRNA skjermen. Deres påfølgende funn tyder på at
IGFBP7
uttrykk er både nødvendig og tilstrekkelig for å indusere alderdom og apoptose i humane primære melanocytter og melanom, henholdsvis. Videre observerte de tap av
IGFBP7
i grunnskolen BRAF
V600E-positive melanom prøver og konkluderte med at lyddemping av
IGFBP7
uttrykk er et viktig skritt i utviklingen av en melanom huse BRAF
V600E [34].
Arrangøren-forbundet CpG island DNA hypermethylation av
IGFBP7
har blitt rapportert i menneskelige kolorektal kreft cellelinjer også. DNA-metylering inhibitoren 5-aza-2′-deoksycytidin har vist seg å gjenopprette
IGFBP7
ekspresjon i tykktarmskreftcellelinjer, noe som indikerer at DNA hypermethylation spiller en viktig rolle i stanse av dette genet i kolorektal cancer [43 ]. Men sin tilknytning til
BRAF
mutasjon og CIMP + status på menneskelige kolorektal kreft har ikke blitt utforsket. I denne studien fant vi at
IGFBP7
DNA hypermethylation er tumor-spesifikke og tett forbundet med kolorektal tumorer bærer BRAF
V600E og stiller CIMP. Videre fant vi at
IGFBP7
DNA hypermethylation er forbundet med tap av uttrykk i CIMP + kolorektal kreft cellelinjer. CIMP spesifikke inaktivering av BRAF
V600E-indusert alderdom og apoptose sti av
IGFBP7
DNA hypermethylation kan skape en gunstig kontekst for kjøp av BRAF
V600E i CIMP + tykktarmskreft.
Viktigere,
IGFBP7
DNA hypermethylation ble ikke observert i alle de
BRAF
muterte kolorektal tumorer. Lin
et al
. undersøkte DNA-sekvensen av promoteren og exonic regioner i
IGFBP7
i ti kolorektal kreft-cellelinjer.
