Abstract
EGFR
mutasjoner korrelerer med forbedret klinisk utfall mens
KRAS
mutasjoner er forbundet med mangel på respons på tyrosinkinasehemmere hos pasienter med ikke-småcellet lungekreft lungekreft (NSCLC). Endobronchial ultralyd (eBUS) -transbronchial nål aspirasjon (TBNA) blir stadig mer brukt i behandling av NSCLC. Ko-amplifisering ved lavere denatureringstemperaturen (KOLS) -polymerase-kjedereaksjon (PCR) (COLD-PCR) er en sensitiv analyse for påvisning av genetiske mutasjoner i faste tumorer. Denne studien vurderte muligheten for å bruke COLD-PCR for å screene for
EGFR Hotell og
KRAS
mutasjoner i cytologiprøvene innhentet av eBUS-TBNA i rutinemessig klinisk praksis. Eksempler hentet fra NSCLC pasienter som gjennomgår eBUS-TBNA ble evaluert i henhold til våre standard kliniske protokoller. DNA ekstrahert fra disse prøvene ble utsatt for kulde-PCR for å forsterke eksoner 18-21 av
EGFR Hotell og eksoner to og tre av
KRAS
fulgt av direkte sekvensering. Mutasjon analyse ble utført i 131 av 132 (99,3%) NSCLC pasienter (70F /62m) med bekreftede lymfeknutemetastaser (94/132 (71,2%) adenokarsinom, 17/132 (12,8%) plateepitelkarsinom, 2/132 (0,15% ) stor celle nevroendokrin, 1/132 (0,07%) store cellekreft, 18/132 (13,6%) NSCL-ikke annet er spesifisert (NOS)). Molekylær analyse av alt
EGFR Hotell og
KRAS
målsekvenser ble oppnådd i 126 av 132 (95,5%) og 130 av 132 (98,4%) av tilfellene hhv.
EGFR
mutasjoner ble identifisert i 13 (10,5%) av fullt evaluert tilfeller (11 i adenokarsinom og to hos NSCLC-NOS), inkludert to nye mutasjoner.
KRAS
mutasjoner ble identifisert i 23 (17,5%) av fullt analyserte pasientprøver (18 adenokarsinom og fem NSCLC-NOS). Vi konkluderer med at eBUS-TBNA av lymfeknuter infiltrert av NSCLC kan gi tilstrekkelig tumormateriale for
EGFR Hotell og
KRAS
mutasjon analyse hos de fleste pasientene, og at COLD-PCR og sekvensering er en robust screening analyse for
EGFR Hotell og
KRAS
mutasjon analyse i denne kliniske sammenhengen
Citation. Santis G, Angell R, Nickless G, Quinn A, Herbert A, Cane P, et al. (2011) Screening for
EGFR Hotell og
KRAS
Mutasjoner i Endobronchial Ultralyd Avledet Transbronchial Needle aspirerer i ikke-småcellet lungekreft Bruke COLD-PCR. PLoS ONE 6 (9): e25191. doi: 10,1371 /journal.pone.0025191
Redaktør: Melanie Königshoff, Omfattende Lunge Center, Tyskland
mottatt: 19 april 2011; Godkjent: 29 august 2011; Publisert: 19.09.2011
Copyright: © 2011 Santis et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert med tilskudd fra Bioteknologi og Biological Sciences Research Council (BBSRC; BB /G006911 /1 til GS), fra Department of Health via National Institutes of Health Research omfattende Biomedical Research Centre award til Guy og St. Thomas «National Health service Foundation Trust i samarbeid med Kings College London (til GS JS), og fra den eksperimentelle kreftmedisin Centre Network. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) er et medlem av ErbB-reseptor-familien, en nøkkel regulator av epitelcelleproliferasjon [1]. EGFR består av et ekstracellulært domene, et transmembranregion og en katalytisk cytoplasmatiske region som inneholder tyrosinkinasedomene [1]. Overdreven EGFR-signalering forstyrrer balansen mellom cellevekst og apoptose bidrar til tumorgenesen i et bredt spekter av faste tumorer inkludert ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) [2]. Dette kan oppstå fra overekspresjon av EGFR, dets signaleringspartnere, eller to av sine ligander, EGF og TGF-α [3], [4]. Konstitutiv aktivering av EGFR-tyrosinkinase-aktivitet kan oppnås ved somatiske mutasjoner i tyrosin kinase domene av EGFR [5], [6], [7]. Retrospektive og prospektive studier i asiatiske og europeiske pasienter med NSCLC har vist at tilstedeværelsen av
EGFR
mutasjoner i eksoner 18-21 korrelerer med overlegen klinisk utfall til EGFR tyrosinkinasehemmere gefitanib og erlotinib [8], [9] , [10]. Mest NSCLC-spesifikk
EGFR
mutasjoner er enten en enkel aminosyresubstitusjon i kodon 858 (leucin til Argine, L858R), eller delesjons- mutasjoner i exon 19 som påvirker den konserverte LREA motivet [11]. Disse mutasjonene er funnet i et mindretall av kaukasiske pasienter med NSCLC, men så mange som 60% av Østasiater med adenokarsinom [8], [12], [13], [14]. En egen gruppe
EGFR
mutasjoner er assosiert med primær samt ervervet resistens overfor erlotinib og gefitinib, og disse klyngen i ekson 20 av
EGFR
genet [15], [16].
Noen NSCLC også havn mutasjoner i Kirsten rotte sarkom viral onkogen homolog
(KRAS)
koder for en GTPase nedstrøms EGFR [17], [18], [19]. Disse mutasjonene klynge i ekson to av
KRAS
, forekommer hos 15-30% av uselektert NSCLC [20], og ser ut til å være gjensidig utelukkende til
EGFR
mutasjoner i NSCLC [21]. Det har vært antydet at mutasjoner i
KRAS
er forbundet med
de novo
motstand mot gefitinib og erlotinib [21]. I motsetning til
EGFR
mutasjoner, som er en positiv prognostisk faktor,
KRAS
mutasjoner i resected NSCLC var assosiert med kortere total overlevelse enn de med
EGFR
mutasjoner [17], [ ,,,0],18], [19]. Til sammen nåværende bevis tyder på at
EGFR Kjøpe og
KRAS
mutasjoner definere forskjellige undergrupper av NSCLC pasienter med ulike svar på EGFR målrettet terapi.
De fleste pasienter med NSCLC stede på et avansert stadium og patologisk diagnose er ofte laget av liten størrelse bronkoskopi, transtorakal kjerne biopsier eller cytologiske prøver. De fleste genetiske mutasjon analyser er avhengige av polymerase kjedereaksjon (PCR) for amplifisering av målsekvenser. I motsetning til standard PCR, co-forsterkning ved lavere denaturering temperatur-PCR (KOLS-PCR) fortrinnsvis forsterker mutante sekvenser og derfor øker følsomheten til å detektere genetiske mutasjoner [22]. Dette er spesielt viktig i å analysere nærværet av genetiske mutasjoner i solide kreftvev, hvor tumorceller kan bli blandet med stromal og andre ikke-malignt vev. Siden det først ble beskrevet, har COLD-PCR er vist å være overlegen i forhold til konvensjonelle PCR i et antall programmer utviklet for å påvise mutasjoner i blandingsprøver [22], [23], [24], [25].
Endobronchial ultralyd (eBUS) -transbronchial nål aspirasjon (TBNA) er en nylig utviklet teknikk som gjør at ultralydveiledet aspirasjon av mediastinum og hilar lymfeknuter og massene. Økende data støtter dets anvendelse i lungekreft diagnose og staging som et alternativ til Mediastinoscopy [26], [27], [28], [29], [30], men det er bekymring for at disse små cytologiske prøver kan gi utilstrekkelig tumormaterialet for molekylær diagnostikk, et område med økende betydning i NSCLC ledelse. Dette gjenspeiles i en nylig publisert konsensus uttalelse på
EGFR
mutasjonstesting som anbefaler at vevet biopsiprøver bør brukes fremfor cytologiske prøver når det er mulig, inntil videre forskning fastslår påliteligheten av mutasjons data fra cytologiske prøver [ ,,,0],31]. Her tar vi dette spørsmålet ved screening for
EGFR Hotell og
KRAS
mutasjoner i 193 eBUS-TBNA avledet cytologiprøvene fra metastatiske lymfeknuter i 132 pasienter med NSCLC i rutinemessig klinisk praksis ved hjelp av en enkelt analyse basert på prinsippene om COLD-PCR og direkte sekvensering.
Resultater
eBUS-TBNA
132 pasienter diagnostisert med NSCLC hjelp eBUS-TBNA mellom mai 2009 og februar 2011 (125 kaukasiske, fire asiatiske og tre britiske svart) ble inkludert i denne studien. Alle pasienter (n = 65) med NSCLC uansett histologisk undertype mellom mai 2009 og februar 2010 ble inkludert i denne studien. De resterende 67 pasienter (mars 2010-februar 2011) representerer fortløpende pasienter med NSCLC, ikke-plateepitel sub-type. Pasient kliniske karakteristika og sykdomstrinn er vist i tabell 1. Ingen av pasientene hadde mottatt behandling før prosedyren. Aspirater ble oppnådd fra 193 lymfeknuter fra stasjoner to til 11 (korte aksen diameter var 1,2 +/- 0,5 cm) i 132 pasienter (tabell 1). Median antall passeringer per lymfeknute stasjon var 4,6 (spredning: 1-10); Dette ligner på median antall passeringer per lymfeknute stasjon (3,8) oppnådd i 972 pasienter undersøkt ved vårt senter av eBUS-TBNA mellom februar 2008 og februar 2011 (upubliserte observasjoner).
morfologisk diagnose og immunoprofile
Immunohistochemistry ble vellykket utført i 131 av 132 pasienter. Utilstrekkelig materiale var tilgjengelig fra en pasient. Histologisk typen ble bestemt av en kombinasjon av morfologi (cytologiske sklier og forskjellige avdelings seksjoner) og immunhistokjemisk profil. I tilfellet med adenokarsinom ble diagnose støttet av ekspresjon av TTF-1, CK7 eller BerEP4 og negativitet for CK5 og p63. Cytomorphology og uttrykk for CK5 og p63 favoriserte plateepitelkarsinom diagnosen, mens uttrykk for neuroendocine markører (CD56, kromogranin og synaptophysin) og hensiktsmessig morfologi etablert diagnose av stor celle nevroendokrin kreft. Udifferensiert NSCLC ved morfologi som også manglet ekspresjon av differensieringsmarkører CK5, CK7, CD56, TTF-1, p63, BerEP4 resulterte i diagnostisering av NSCLC ikke ellers spesifisert (NSCLC-NOS). Basert på disse kriteriene, ble 94 av de 132 pasientene (71,2%) diagnostisert med adenokarsinom, 17 (12,8%) med plateepitelkarsinom, to med stor nevroendokrine cellekreft (0,15%), ett med stor celle karsinom (0,07%), og 18 (13,6%) med NSCLC-NOS (tabell 1).
Mutasjon analyse
COLD-PCR og sekvensering protokollen ble optimalisert for å forsterke og sekvens eksoner 18 til 21 av
EGFR Hotell og kodon 12, 13 og 61 av
KRAS
for å oppdage
EGFR Kjøpe og
KRAS
mutasjon med følsomhet på 5-10% (mutasjon frekvenser av 10% ble påvist i alt COLD-PCR går, mens mutasjon frekvenser på 5% ble påvist i to av tre runs) sammenlignet med mutasjon sensitivitet på 30% for våre standard-PCR-protokoll.
en av de 132 prøver ikke klarte å forsterke target DNA og derfor
EGFR Hotell og
KRAS
mutasjonsanalyse ble utført i 131 av 132 prøver (99,3%). Pasientprøven som mislyktes DNA forsterkning inneholdt bare 100 celler /seksjon [32]. Den COLD-PCR protokoll vellykket forsterket eksoner 18-21 i 126 av 131 pasienter (95,5%) i hvem DNA var tilgjengelig. Forsterkning av ekson 21 mislyktes i tre pasientprøver (to adenokarsinomer og en plateepitelkarsinom); en av disse prøvene også mislyktes forsterkning av ekson 20. Ytterligere to pasientprøver mislyktes forsterkning av ekson 18. Sekvense var vellykket for alle forsterkede sekvenser; derfor komplett molekylær analyse av alle fire
EGFR
målet eksoner var tilgjengelig i 126 av de 132 pasientene (95,4%) og delvis molekylær analyse i 131 av 132 pasienter inkludert i denne studien (99%).
Ved hjelp av COLD-PCR vi var i stand til å oppdage
EGFR
mutasjoner i 13 av 126 pasienter (10,3%) i hvem fullt molekylær analyse var tilgjengelig (tabell 2). En pasient prøven inneholdt to exon 21 mutasjoner (Tabell 3). Gjenta COLD-PCR og sekvensering protokollen fra en annen avdeling som inne uavhengig bekreftet alle mutasjoner. Mutasjoner ble nesten utelukkende funnet i adenokarsinom sub-type (11 av 13, 85%, p 0,001). Ett stort i-frame sletting i ekson 19 og L858R mutasjon ble påvist hos to pasienter med NSCLC-NOS. Nei
EGFR
mutasjoner ble oppdaget i 17 plateepitelkarsinom mellom mai 2009 og februar 2010. mutasjonsanalyse ble deretter utført kun hos pasienter diagnostisert med NSCLC ikke-plateepitel histologi.
EGFR
mutasjoner ble identifisert i 11 av 89 (12,3%) adenokarsinomer og 13 av 110 (12%) ikke-skvamøs histologi. Den L858R mutasjonen sto for fire av 13 (31%). Vi identifiserte bare en i-ramme delesjon i exon 19 (Δ2481-2495) (tabell 3). Vi identifiserte også to nye
EGFR
mutasjoner; begge var enkle aminosyresubstitusjoner, en i exon 19 (V760M) og en annen i exon 20 (H805L). Det var en kompleks mutasjon (L833V + L858R). Muligheten finnes at nye mutasjoner påvist i denne studien er gjenstander; Dette har vært knyttet til PCR av formalin-innleiret vev [33], [34]. Videre COLD-PCR, så vel som en standard-PCR-protokollen er utsatt for polymerase-induserte feil. I vår studie ble AmpliTaq Gold anvendt for å amplifisere målsekvenser, i motsetning til high fidelity Taq polymerase brukt av Li
et al.
[22], [23], [24] Ved hjelp av high fidelity Taq-polymerase kunne unngå muligheten for PCR anriking av PCR-feil. Imidlertid er det lite sannsynlig at de nye mutasjoner som detekteres i vårt studium er på grunn av kulde-PCR-feil, som alle mutasjoner ble bekreftet i separate reaksjoner og ingen mutasjoner ble detektert i villtype-DNA som ble brukt som negativ kontroll i alle reaksjoner. Dette tyder ville også at AmpliTaq Gold ikke berike amplikonene med kunstige mutasjoner.
Vi identifiserte også den mindre vanlige
EGFR
mutasjoner G719A, P733S, L747P og L861Q. En annen uvanlig mutasjon (L833V) ble funnet sammen med L858R mutasjon. MassArray (Sequenom Inc) og Scorpion forsterket ildfast mutasjon system (SARMS) (DSX
EGFR
PCR mutasjon analyse kit; QIAGEN). Teknologiene ville ikke ha oppdaget mutasjoner P733S, L747P, V760M, H805L og L833V
KRAS
mutasjoner analysen var vellykket i 130 av 132 svulster (98,4%). En prøve som ga uninformative sekvens også mislyktes
EGFR
mutasjon analyse på grunn av mangelen på tumormateriale. Enkelt aminosyresubstitusjoner involverer kodon 12, 13 og 61 av
KRAS
ble identifisert i 23 av 130 NSCLC (17,7%) samlet (18 av 93 adenokarsinomer (19%) og fem av 18 NSCLC-NOS (27,7% )) (tabell 3). Ingen ble funnet hos pasienter med plateepitelkarsinom svulster eller hos pasienter som
EGFR
mutasjoner.
Tidligere studier og våre egne valideringsforsøk har vist økt følsomhet av COLD-PCR i forhold til standard PCR-protokoller [22 ], [23], [24], [25], [35]. Her også utførte vi en begrenset sammenligning av evne til COLD-PCR for å påvise
EGFR Hotell og
KRAS
mutasjoner i 25 eBUS-avledet adenokarsinom cytologiske aspirates med at av standard-PCR. Disse prøvene ble også analysert i parallell med COLD-PCR og SARMS (DxS EGFR PCR kit, Qiagen) i henhold til produsentens instruksjoner. Vi fant standard-PCR og påfølgende sekvense oppdaget alt
EGFR
mutasjoner som hadde blitt oppdaget av KOLS-PCR (L858R, Δ2481-2495 og H805L). Mutasjonen peak var mer synlig følgende COLD-PCR forsterkning som vist for L858R mutasjon (figur 1A). Standard-PCR klarte ikke å registrere
KRAS
G12C mutasjon (figur 1B). Denne forskjellen i mutasjonen deteksjon mellom KALDT-PCR og standard PCR var ikke signifikant (p = 0,5). Ved hjelp SARMS, fant vi ingen flere
EGFR
mutasjoner blant disse eBUS-avledet adenokarsinom aspirates. SARMS også bekreftet L858R mutasjon som hadde blitt opprinnelig identifisert av COLD-PCR.
Sekvensering electrogramme av komparativ analyse av KOLS-PCR og standard-PCR forsterkning av
EGFR
ekson 19 og
KRAS
exon 2. A: øvre og nedre paneler er KALDT og standard PCR forsterkning av ekson 21 av
EGFR
fra eBUS-avledet aspirates fra lymfeknuter infiltrert av metastatisk lunge adenokarsinom hhv. En viser substitusjon av tymidin (T) av cytosin (C) i exon 21 av
EGFR
å generere L858R mutasjon som er tydelig i COLD-PCR-amplifikasjonsreaksjon (pil) i tillegg til standard PCR-reaksjonen. Mutasjonen peak er mer synlig i KALDT-PCR (øvre panel) sammenlignet med standard-PCR-reaksjon (nedre panel). B øvre og nedre paneler er KALDT og standard PCR forsterkning av
KRAS
exon 2. Den øvre panelet viser substitusjon av guanin (C) av tymidin (T) for å generere G12C mutasjon som ble oppdaget av COLD-PCR forsterkning ( pil). Mutasjonen var ikke tydelig i standard-PCR reaksjon (nedre panel).
Diskusjoner
Her er vi rapportere om muligheten for å bruke COLD-PCR for å screene for
EGFR Hotell og
KRAS
mutasjoner i 132 pasienter som hadde blitt samplet av eBUS-TBNA i henhold til våre standard kliniske protokoller. Dette representerer den største kohort av slike pasienter rapportert. Vi demonstrerer fullstendig evaluering av eksoner 18 til 21 i 95,5% av
EGFR Hotell og eksoner to og tre i 98,4% av
KRAS
blant eBUS-TBNA aspirates. Våre resultater måle seg med tre tidligere studier som skjermede eBUS-avledet aspirates for
EGFR
mutasjoner. Garcia-Olive
et al Hotell og Nakajima
et al
hell analysert eksoner 19 og 21 av
EGFR
i 72% (26/36) og 93% (43/46 ) av pasientprøver henholdsvis [36], [37]. Schuurbier
et al
hell analysert 77% av alle prøver av standard PCR og sekvensering av eksoner 18-21 av
EGFR product: [38]. Vi samplet bredt lignende størrelse lymfeknuter som de evaluert i de tre andre studier og utført en median på 4,5 passeringer per lymfeknute samplet; dette antallet passeringer er lik de tre til fire passeringer per node anbefales å etablere diagnosen kreft [28], [30]. Resultater fra denne og tidligere studier antyder derfor at eBUS-TBNA kan gi tilstrekkelig tumormateriale for
EGFR Hotell og
KRAS
mutasjon analyse i rutinemessig klinisk praksis og dermed unngår behovet for mer invasive kirurgiske prøvetaking i disse pasienter.
Det er for tiden en rekke metoder som er utviklet for å screene for
EGFR
mutasjoner i NSCLC prøver der mutert DNA utgjør bare en brøkdel av den totale renset DNA [7]. Noen analyser som SARMS og MassArray skjerm for spesifikke mutasjoner med følsomheten til 1% og 10% henholdsvis. Andre strategier som er avhengige av teknikker som høy oppløsning, smelting og denaturerende høyytelsesvæskekromatografi gjenkjenne alle mutasjoner uten å spesifisere den nøyaktige aminosyre-substitusjon [7]. I noen studier ble mikrodisseksjon av tumor-DNA fra vevsprøver utført før DNA-amplifikasjon [39]. Det er i dag ingen generell enighet om hvilke av disse som representerer den beste metoden for mutasjonsanalyse i NSCLC [31]. Men strategier basert på DNA-amplifikasjon og direkte sekvensering er den mest omfattende som de kan skjermen ikke bare for kjente, men også nye mutasjoner. Det anbefales at minst 30% tumorceller må være tilstede sammen med mer enn 10% mutant DNA for effektiv mutasjon screening avhengig av standard PCR og sekvenseringsprotokoller [7].
COLD-PCR-test som benyttes i denne studie oppdaget
EGFR Hotell og
KRAS
mutasjoner stede i tumor-DNA som omfatter så lite som 5-10% av total prøve-DNA. Det er sannsynlig at, ved å anvende en enkelt COLD-PCR kritisk denatureringstemperaturen for noen av amplikonene testet er det en betydelig berikelse (som fig. 1 viser), mens for andre er det liten eller ingen anrikning. Følsomheten så definert av vår COLD-PCR assay kunne derfor blitt ytterligere forbedret for å detektere mutasjoner frekvenser på mindre enn 5% har vi utviklet et amplikon-spesifikk analyse ved hjelp av optimal heterodupleks gløding og denaturerende temperaturer for hvert fragment. Følsomhet kan bli ytterligere forbedret ved å utnytte mer følsomme amplikon-spesifikk COLD-PCR-analyser slik som den beskrevet av Galbiati
et al product: [40], eller forbedret, og Complete Enrichment-COLD-PCR (
is
-kaldt-PCR) plattform som kan påvise mutasjon frekvenser så lavt som 0,1%, [41]. Det er vår oppfatning imidlertid at bruk av amplikon-spesifikke analyser er neppe være mulig for rutinemessig diagnostisk bruk i deteksjon av multiple mutasjoner og kan best anvendes når tumorcelle-innhold er lavere enn 5-10% sensitivitetsterskelen til vår nåværende analysen. Interessant, vi nylig fant dette å være en uvanlig klinisk scenario [32]. For eksempel fant vi at median tumor celletall i eBUS-avledet lymfeknute aspirates var 2525 (range 65-39800) og median prosent svulsten var 70% (område 10-95%). Dette var sammenlignbare utbyttet fra bronkoskopiske biopsier og overlegen til utbyttet fra computertomografi-guidet nål biopsi av perifere primære lungesvulster. Faktisk er den prosentvise tumor innholdet i alle prøvetyper ble studert var 5% eller høyere [32]. Som eBUS-avledede kliniske prøver kan være sammensatt av mindre enn 30% tumorceller, kan standard-PCR ikke være tilstrekkelig følsom til å påvise tilstrekkelig følsom til å påvise mutasjoner i disse prøvene. Til støtte for dette, en begrenset sammenligning av KOLS-PCR
vs
standard-PCR viste at standard-PCR ikke klarte å oppdage en av fire mutasjoner identifisert av COLD-PCR, som også viste høyere mutasjons topper (Figur 1A 0,01) enn de 36% frekvenser av
EGFR
ekson 19 slettinger i NSCLC primære vevsprøver analysert ved KOLS-PCR og direkte sekvensering av eksoner 18-21 i vår institusjon (upubliserte). Denne observasjonen øker muligheten for at ekson 19 slettinger kan være underrepresentert i metastatiske lymfeknuter i forhold til primære svulster. Park
et al
rapportert disharmoni mellom primærtumor og lymfeknutemetastaser i NSCLC spesielt for mutasjoner i ekson 19 [46]. Videre Nakajima
et al
rapporteres bare en ekson 19 sletting blant 11 (9,9%)
EGFR
mutasjoner i 43 eBUS-TBNA metastatisk lunge adenokarsinomer i Øst-asiatiske pasienter [37], mens i primære lunge adenokarsinomer ekson 19 strykninger utgjøre så mye som 53% av mutasjoner i østasiatiske pasienter [47]. Tap av
EGFR
mutasjoner i metastatisk lungesykdom adenokarsinomer i forhold til primære svulster har også blitt rapportert [48]. Større prospektive studier som sams analyse av primær tumor og lymfeknutemetastaser er nødvendig for å vurdere om
EGFR
ekson 19 slettinger eller andre mutasjoner, er underrepresentert i metastatiske lymfeknuter enten ved diagnosetidspunktet eller i respons på behandling.
i denne studien har vi også vurdert eBUS-avledet nål aspirates for
KRAS
mutasjoner ved hjelp av COLD-PCR og fant disse i 19% av lungekreft adenokarsinomer og 27,7% av NSCLC-NOS. COLD-PCR ble tidligere vist seg å forbedre
KRAS
mutasjon følsomhet i forhold til vanlig PCR, i en rekke kliniske prøver [25]. Hyppigheten av
KRAS
mutasjoner i eBUS-TBNA prøver analysert i denne studien er i tråd med tidligere studier som rapporterte
KRAS
mutasjonsfrekvens på opptil 22%, hovedsakelig i adenokarsinomer [20] viktigere,
KRAS
mutasjoner er forbundet med mangel på respons på EGFR-hemmere i NSCLC [21]. Til sammen våre resultater viser at ved å kombinere
EGFR Hotell og
KRAS
mutasjon analyse hos NSCLC pasienter med ikke-plateepitel histologi, vedtak om hensiktsmessigheten av EGFR-TKI terapi kan gjøres i 27% av vår pasient kohort.
Vi konkluderer med at eBUS-TBNA av mediastinale lymfeknuter infiltrert av NSCLC kan gi tilstrekkelig tumormateriale for
EGFR Hotell og
KRAS
mutasjon analyse i de aller fleste av pasienter uten å måtte ty til mer invasive kirurgiske mediastinoskopi eller mediastinotomy. Vi konkluderer også at KOLS-PCR og sekvensering protokoller bør betraktes som en potensiell screening analyse for flere
EGFR Hotell og
KRAS
mutasjon analyse i denne kliniske sammenheng. Evnen til å oppdage ny
EGFR
mutasjoner, som vi viste i denne studien, kan også vise seg nyttig i screening for ervervet
EGFR
resistensmutasjonene, en sak av voksende klinisk betydning i NSCLC. Serie prøvetaking og vurdering av svulstvev fått møtereferat blir stadig mer anerkjent som viktig i klinisk bruk av EGFR-målrettet terapi. EBUS-TBNA er en trygg og minimal invasiv teknikk som sannsynligvis vil være meget aktuelt i denne sammenheng.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Dette var en observasjonsstudie utført i henhold til våre standard kliniske protokoller. Alle pasienter ga sitt skriftlige samtykke til å gjennomgå eBUS-TBNA og for samplet materialet som skal analyseres i henhold til godkjente kliniske protokoller. EBUS-TBNA ble godkjent som en ny eksperimentell prosedyre ved Guy St Thomas «Hospital Clinical Governance Committee og er en del av standardbehandlingen av pasienter med NSCLC. COLD-PCR er godkjent metode for
EGFR Hotell og
KRAS
mutasjon analyse på vår institusjon.
EGFR Hotell og
KRAS
mutasjon analyse er en del av standardbehandlingen av pasienter med NSCLC på vår institusjon.
eBUS-TBNA
eBUS-TBNA ble utført av to konsulenter i Respiratory Medicine ved hjelp av en bronchoscope med integrert lineær ultralyd probe (Olympus 260F) og C200 ultralyd prosessor i 128 pasienter og alfa fem-ultralyd prosessor i fire. Prosedyren ble utført ved anvendelse av sedasjon. 22G nål ble anvendt til å suge hver node. En lufttørket og en alkohol-fast konvensjonell smøre ble fremstilt fra hver passering av en biomedisinsk vitenskapsmann og nål vaskevann ble skylt i balansert saltoppløsning: Aqsia ™ (Bausch Lomb, Kingston upon Thames, UK). Air-tørket utstryk farget med Hemacolor ™ (Merck KGaA, Nottingham, UK) for umiddelbar vurdering og alkohol fast lysbilder beholdt for senere Papanicoloau farging. evaluering på stedet (ROSE) av en konsulent cytopathologist gitt sanntid vurdering av aspirates og triage av cellesuspensjoner for celleblokkene, flowcytometri eller mikrobiologi som diktert av mikroskopi. Flere aspirates fra enkeltnoder fra hver nodal stasjon ble slått sammen for videre analyse. Det samme patolog anmeldt alle lysbilder og påfølgende forskjellige avdelings seksjoner, utstedt en diagnose og viderecelleblokkene til molekylær patologi laboratorium for mutasjon analyse. Lysbilder og alle celleblokkene ble også anmeldt, ifølge våre lokale kliniske retningslinjer, med panel av thorax histopatologer og cytopathologists. Endelig diagnose og stadium av sykdommen [49] ble enige etter diskusjon på thorax Kreft tverrfaglig møte. Alle påfølgende pasienter som gjennomgår eBUS-TBNA mellom mai 2009 og februar 2010, og som ble diagnostisert med NSCLC eller var iscenesatt for deres kjente NSCLC ble inkludert i denne studien. Mellom mars 2010 og februar 2011 skal alle påfølgende pasienter med ikke-plateepitel NSCLC ble evaluert.
Mutasjon analyse
Utvalgets behandling og celleblokk forberedelse for DNA-ekstraksjon.
Tre 10 micron seksjoner fra disse parafininnstøpte eBUS celleblokkene ble deparaffinized og DNA ble isolert fra vevene ved hjelp av Qiagen DNA isolasjonskit med en modifisert protokoll. Kort sagt ble deparaffinised vev suspenderes i 180 μ av vev oppløseliggjørende buffer og 70 pl av enzymet proteinase K, og inkubert ved 56 ° C over natten. Etter tilsetning av 200 ul DNA-bindingsbuffer, ble blandingen inkubert ved 70 ° C i 10 minutter etterfulgt av 100 ul isopropanol og sentrifugering ved 16 kg i 1 minutt for å fjerne vev rusk. Kvaliteten på DNA og dets egnethet for PCR amplifisering ble vurdert av DNA-OK PCR kit, i henhold til produsentens instruksjoner.
COLD-PCR
COLD-PCR ble utført i henhold til de prinsipper utviklet av Li J
et al product: [22] med mindre modifikasjoner flere primere (åtte-ti per fragment) ble designet og syntetisert for å forsterke eksoner 18-21 av
EGFR Hotell og kodon 12, 13 og 61 av
KRAS
. Muterte DNA for hver av target amplikonene ble syntetisert og seriefortynnet med villtype-DNA til maksimal fortynning av 5% (mutert til villtype-DNA). Standard og COLD-PCR reaksjoner ble så utført ved hjelp av ulike annealing og denaturering temperaturer med hver primer par. Den heterodupleks formasjonstemperaturen var nødvendig for å være signifikant høyere enn glødetemperaturen av primerne for å unngå for tidlig utvidelse.
