Abstract
Med ferdigstillelsen av det menneskelige genom sekvens, biomedisin har skrevet inn i den «omics» era, hovedsakelig på grunn av high-throughput genomikk teknikker og den siste anvendelsen av massespektrometri til proteomikk analyser. Men det er fortsatt et etterslep mellom disse teknologiske fremskritt og deres anvendelse i klinisk setting. Vårt arbeid er utformet for å bygge broer mellom høy ytelse proteomikk og klinisk rutine. Proteinekstrakter ble oppnådd fra friskt frosset normal lunge og ikke-småcellet lungekreft prøver. Vi brukte et phosphopeptide berikelse fulgt av LC-MS /MS. Påfølgende label-fri kvantifisering og bioinformatikk analyser ble utført. Vi vurderte protein mønstre på disse prøvene, viser dusinvis av differensial markører mellom normal og svulstvev. Gene ontologi og interactome analyser identifiserte signalveier endres på svulstvev. Vi har identifisert to proteiner, PTRF /cavin-en og MIF, som er forskjellig uttrykt mellom normal lunge og ikke-småcellet lungekreft. Disse potensielle biomarkører ble validert ved hjelp av western blot og immunhistokjemi. Anvendelsen av funnbasert proteomikk analyser i kliniske prøver tillatt oss å identifisere nye potensielle biomarkører og terapeutiske mål i ikke-småcellet lungekreft
Citation. Gámez-Pozo A, Sánchez-Navarro jeg, Calvo E, Agulló-Ortuño MT, López-Vacas R, Díaz E et al. (2012) PTRF /Cavin-en og MIF Proteiner er identifisert som ikke-småcellet lungekreft Biomarkører ved Etikett-Free proteomikk. PLoS ONE 7 (3): e33752. doi: 10,1371 /journal.pone.0033752
Redaktør: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu «, Italia
mottatt: 01.12.2011; Akseptert: 16 februar 2012; Publisert: 26 mars 2012
Copyright: © 2012 Gámez-Pozo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet med tilskudd FIS CP05 /00248, PS09 /01 597, Red Tematica de INVESTIGACION Cooperativa en kreft (RTICC, RD06-0020-1022) fra Carlos III Institute of Health (spanske departementet for vitenskap og innovasjon, Spania) og forskningsmidler ved Mutua Madrileña Foundation. ISN er støttet av stiftelsen for Biomedical Research i La Paz universitetssykehus. ED er støttet av tilskuddet CA10 /01447 fra Carlos III Institute of Health. Spanish National Centre for Cardiovascular Research er støttet av det spanske departementet for vitenskap og innovasjon og ProCNIC Foundation. Den IdiPAZ Biobank er støttet av Carlos III Institute of Health, spansk helsedepartementet (Retic- RD09 /0076/00073) og Farmaindustria, gjennom samarbeidsprogrammet i klinisk og translasjonell forskning av Madrid. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall i verden. Den totale overlevelsesraten på 5 år er 15% og det har ikke blitt forbedret i flere tiår. To tredjedeler av pasientene er diagnostisert med avansert sykdom hvor behandlingsalternativer er palliativ, og opptil 55% av pasienter med begrenset sykdom slutt tilbakefall etter radikal kirurgi [1].
Gene uttrykk profilering har ført til identifisering av grupper av pasienter med forskjellig resultat, og således reflekterer heterogeniteten av denne sykdom [2]. Men analyser gen-nivå ikke oppdager hårfine endringer forårsaket av posttranslasjonelle modifikasjoner av proteiner [3]. En dyp forståelse av prosessene i kreftutvikling, tumorprogresjon og metastase krever analyse av både genomet og proteomet [4]. Proteomikk teknologier basert på massespektrometri (MS) har dukket opp som foretrukne komponenter i en strategi for å oppdage diagnostiske, prognostiske og terapeutiske protein biomarkører [5]. Fortsetter utviklingen på dette feltet gir denne strategien et enormt potensial for slike undersøkelser [6], [7].
Nye kliniske studier som viser god respons på nye legemidler i bestemte undergrupper av pasienter understreker behovet for molekylære tester som utfyller klassiske prosedyrer histopatologiske [8]. I denne sammenheng kan proteomikk profilering gir verdifulle biomarkør verktøy for effektiv lagdeling pasient og behandlingsvalg.
Selv om det er mulig å analysere proteiner fra vevene ved hjelp av massespektroskopi [3], [9], kompleksiteten av den kliniske prøven og mengden av tilgjengelig protein er begrensende faktorer. Derfor er utvalget anrikning av biologisk relevante analytter kreves [5]. De fleste eukaryote cellulære prosesser blir regulert av protein fosforylering, og deregulering av denne nøkkelen post-translasjonell modifikasjon er vanlig i kreft og andre sykdommer. Dette forklarer hvorfor proteinkinaser har dukket opp som den viktigste klassen av nye narkotika mål i onkologi og andre felt [10]. I dette arbeidet har vi brukt phosphopeptide berikelse kombinert med label-fri MS teknikker for å identifisere allerede kjent og nye potensielle biomarkører i ikke-småcellet lungekreft kliniske vev og validere dem ved hjelp av western blot og immunhistokjemi.
Materialer og Metoder
Etikk uttalelse
Institutional godkjenning fra vårt etiske komiteen ble innhentet for gjennomføringen av studien (Comité Ético de INVESTIGACION Clínica, Hospital Universitario La Paz). Data ble analysert anonymt. Pasienter gitt skriftlig samtykke, slik at deres prøver og kliniske data kan brukes til investigational formål.
Prøve utvalg
Frosne prøver fra pasienter diagnostisert med lungekreft ble hentet fra Institutt for patologi Hospital Universitario La Paz (Madrid, Spania): 5 lunge adenokarsinom (AC), 5 lunge plateepitelkarsinom (SC) og 5 normale lunge (NL) prøver. De histopatologiske funksjonene i hver prøve ble anmeldt av en erfaren lunge patolog for å bekrefte diagnosen og tumor innhold. Hadde minst 50% av en prøve for å bli tatt opp av tumorceller for at det skal være berettiget. Prøver fra pasienter ble vennlig levert av IdiPAZ Biobank (RD09 /0076/00073) integrert i den spanske Hospital biobank Network (RetBioH, www.redbiobancos.es). Prøvene ble registrert og behandlet etter gjeldende prosedyrer og fast /frosset umiddelbart etter mottak.
Total protein utvinning, løselighet og fordøyelsen
Prøver ble kuttet i en Leica CM3050S cryostat, skaffe 10 deler av 10 mikrometer tykkelse hvert. Vev ble behandlet med TRIzol reagens (Invitrogen) etter produsentens anvisninger. For MS-analyser, ble proteinpelletene resuspendert i guanidinhydroklorid 6 M og oppvarmet 10 minutter ved 95 ° C under omrøring. Deretter ble 950 ul 50 mM ammonium-bikarbonat (pH 7-9) per prøve tilsatt. Proteinprøvekonsentrasjon ble målt ved MicroBCA Protein Assay Kit (Pierce-Thermo Scientific). Trypsin MS Grade gull (Promega) ble tilsatt til hver prøve i et 01:50 forhold. Fordøyelse ble utført over natten ved 37 ° C. Den fordøyd Prøven ble delt i to porsjoner.
Parallel IMAC (PIMAC)
Phosphopeptide berikelse ble utført som beskrevet tidligere [11]. Kort fortalt ble Fe (III) -baserte IMAC utført i en delmengde av fordøyd protein ved hjelp av PHOS-Select Iron Affinity Gel (Sigma-Aldrich) etter produsentens anvisninger. Ga (III) -baserte IMAC ble utført i en annen delmengde av fordøyd protein bruker Phosphopeptide Isolation Kit (Pierce-Thermo Scientific) etter produsentens anvisninger. Eluatene ble blandet, vakuumtørket og lagret ved -20 ° C for senere MS-analyse.
LC-MS /MS-analyser
Peptide blandingene ble underkastet nano-væskekromatografi kombinert med MS for protein identifikasjon. Peptidene ble injisert inn i en C-18 reversfase (RP) nano-kolonne (100 um ID og 12 cm, Mediterranea sjø, Teknokroma) og analysert i en kontinuerlig acetonitril-gradient bestående av 0-40% B i 90 min, 50-90 % B i 20 min (B = 95% acetonitril, 0,5% eddiksyre). Ved slutten av gradienten ble kolonnen vasket med 90% B og ekvilibrert med 5% B i 20 min. En strømningshastighet på 300 nl /min ble anvendt for å eluere peptidene fra RP nano-kolonne til en emitter nanospray nål for sanntids ionisering og peptidet fragmentering på en LTQ-Orbitrap XL massespektrometer (Thermo-Fisher). En forbedret FT-oppløsning spektrum (oppløsning = 60 000), etterfulgt av MS /MS-spektrene fra de fem mest intense moderioner ble analysert langs den kromatografiske løp (130 min). Dynamisk eksklusjon ble satt til 1 min. For protein identifikasjon fragmentering spektra ble søkt mot msdb database (versjon 091509) ved hjelp av Mascot 2.1 programmet (Matrixscience). To savnet skillelinjer ble tillatt, og en feil på 10 ppm eller 0,8 Da ble satt i full MS eller MS /MS spektra søk, henholdsvis. Alle identifikasjoner ble utført av Proteome Discoverer 1.0 programvare (Thermo-Fisher). Decoy databasesøk for falske funnrate analyse ble satt til 0,05 ved å bruke tilsvarende filtre. Rådatafiler ble behandlet og sammenlignet med SIEVE versjon 1.2 (Thermo-Fisher). Protein identifikasjoner ble validert ved hjelp av BLAST verktøyet fra blastp suite (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov). For detaljerte peptid masse fingeravtrykk og protein identifikasjonsinnstillinger, se tabell S4.
Inmunoblotting analyser
For inmunoblotting analyser, protein pellets ble resuspendert i 2% SDS og oppvarmet 10 minutter ved 95 ° C under omrøring . Protein prøvekonsentrasjon ble målt ved MicroBCA Protein Assay Kit (Pierce-Thermo Scientific) .Western blotter ble utført ved hjelp WesternDot system (Invitrogen) i en SNAP i.d. enhet (Millipore). MIF antistoff 1: 250 fortynning (R 0,05 ble betraktet som signifikant. Sil og densitometry verdier ble sammenliknet med Pearsons korrelasjonskoeffisient
Bioinformatikk
Protein listene ble behandlet ved hjelp av databasen for kommentering, visualisering og integrert Discovery (DAVID) versjon 2.0 (http:. //David. abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) [12], [13]. Å identifisere under- og over-representert funksjonelle kategoriene vi brukte Protein analyse gjennom evolusjonære relasjoner (PANTHER) database v 6.1 (www.pantherdb.org) [14]. Tumor protein liste ble sammenlignet med normal lunge listen ved hjelp av binomisk test [15] for hver molekylær funksjon, biologisk prosess eller sti sikt i PANTHER. Protein-protein interaksjoner ble hentet fra Search Tool for henting av å samhandle gener /proteiner (STRING) database v9.0 inneholder kjente og spådd fysiske og funksjonelle protein-protein interaksjoner [16]. STRING i protein-modus ble brukt, og bare interaksjoner basert på eksperimentelle protein-protein interaksjon og kuratert databases- med tillit nivåer i løpet av 0,5- ble holdt.
Resultater
I denne studien, vurderte vi forskjeller på proteinnivå mellom ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og lunge normalt vev ved hjelp av en phosphopeptide berikelse strategi og en etikett-fri tilnærming. Prøvene ble analysert på en LTQ-Orbitrap XL etter å ha blitt underkastet væskekromatografi. Siden det er kjent at forskjellige teknikker for å isolere forskjellige og overlappende segmenter av phosphoproteome [17], blant Fe (III) og Ga (III) IMAC [18], blandet vi det Fe (III) og Ga (III) IMAC fraksjoner fra hvert prøve og analysert dem sammen.
Vi evaluerte antallet unike peptider og deres tilsvarende proteiner, så vel som fosforpeptider og deres tilhørende fosfoproteiner, identifisert i lunge adenokarsinom (AC), lunge squamous cell carcinoma (SC) og normal lunge (NL) prøver søker en lokkedue database søk på falske funnraten 0,05. Den omfattende analyse utført hos NSCLC og NL prøver ved hjelp av LC-MS /MS tillatt oss å identifisere et gjennomsnitt på 381 unike peptider per prøve, hvorav et gjennomsnitt på 56 var fosfor. Disse peptidene tilsvarer et gjennomsnitt på 138 unike proteinene identifisert per prøve, hvorav et gjennomsnitt på 39 ble fosforylert. Fraksjonen av fosforpeptider som er identifisert (antall fosforylerte peptider * 100 /antall identifiserte peptider) var 19,9%.
Gene ontologispråk analyser ble utført ved anvendelse av alle identifiserte proteiner. Svulsten protein Listen ble sammenlignet med normal lunge protein liste for hver molekylær funksjon (figur S1), biologisk prosess (figur S2), eller sti (figur 1) ord ved bruk PANTHER. Denne fremgangsmåten viste signifikante forskjeller mellom normale lunge og tumorprøver (komplett analyse er gitt i tabell S1). Forskjeller i molekylære funksjoner er i hovedsak knyttet til samspillet med nukleinsyrer og regulering av protein syntese og aktivitet. Prosessene som styrer eksocytose, immunrespons, respons på stimuli, respons på stress og transport var betydelig underrepresentert i tumorer, mens kategorier relatert til celle-matrix adhesjon eller respons på toksin ble overrepresentert. På den annen side, Homeostase kategoriene var underrepresentert, mens kategorier relatert med energiproduksjon og celleproliferasjon ble overrepresentert i svulster. Bemerkelsesverdig forskjeller i pathway analyse dukket opp i kategorier relatert med signaltransduksjon kontroll. Mens cytoskeletal regulering av Rho GTPase, betennelse mediert av chemokin og cytokin signalveien, intesignalveien og Wnt signalveien ble underrepresentert i tumorprøver, EGF reseptor signalveien, Glycolysis, p53 sti og PI3 kinase veien var overrepresentert.
Sammenligning av antall proteiner tildelt hver GÅ vei kategori. Normale vevsprøve romkategorier er representert som fold-endring i forhold til denne kategorien. Statistisk signifikans er testet ved hjelp av binomisk test. Kun signifikante kategorier (p 0,05) er vist
ble utført Differensial uttrykk analyse mellom NSCLC vs. normal lunge hjelp SIEVE 1.2-programvaren.. Totalt 296 differensielt uttrykte m /z topper ble funnet, 115 som hadde tilgjengelig MS2-spektra, som fører til identifisering av proteiner differensielt uttrykte mellom normal lunge og NSCLC-prøver (tabell 1). Alle data innhentet fra SIEVE analyser, inkludert relative uttrykk verdier, er gitt i tabell S2.
PTRF /cavin-en og MIF outstand blant de forskjellig uttrykt biomarkører mellom NSCLC og normal lunge prøver i label-fri analyser som den mest ned-regulert og oppregulert på henholdsvis (figur 2). PTRF /cavin-en viste tap av uttrykk i både adenokarsinom og plateepitelkarsinom prøver. På den annen side, MIF viste økt ekspresjon i disse prøvene. For å unngå falske positive identifikasjoner, ble mer enn tjue MS2 spektra for hver MIF og PTRF /cavin-1 peptider vurderes manuelt (Tall S3 og S4 og Tabell S3). Endringer i PTRF /cavin-en og MIF uttrykk i NSCLC prøvene ble validert ved hjelp av immunhistokjemi (IHC) og western blot analyser. De samme prøvene som brukes for MS /MS analyser og ytterligere ni prøver av adenokarsinom, plateepitelkarsinom og normal lunge ble evaluert for MIF og PTRF hjelp western blot. Fem ekstra prøver av adenokarsinom, plateepitelkarsinom og normal lunge ble evaluert for MIF og PTRF hjelp IHC. Alle svulster viser positiv farging for MIF og negativ farging for PTRF, mens alle normale vev var negative for MIF og positivt for PTRF farging. MIF over-uttrykk i tumorvev ble bekreftet både av IHC og western blot (figur 3 og 4). På den annen side, viste prøver bekreftet tap av PTRF /cavin-1-ekspresjonen sammenlignet med normal lunge (figur 3 og 4) ved hjelp av begge teknikker. Pearsons korrelasjon mellom Sikte label-frie uttrykk verdier og western blot kvantifisering var r = 0,723 og r = 0,754 (p 0,005) for MIF og PTRF /cavin-1 henholdsvis
boksplott, er gjennomsnittet og 25.-75. persentil. ; værhår representerer minimun og maksimum. Målinger ble oppnådd fra fem forskjellige prøver i hver tilstand. Kruskall-Wallis test p-verdier vises. AC: Adenocarcinoma; SC: Plateepitelkarsinom; NL. Normal lunge
a) Western blot av total protein hentet fra angitte prøver, ved hjelp av anti-MIF og anti-PTRF /Cavin-1 primære antistoffer. b) Densitometrisk analyser av western blot. ImageJ 1.38e programvare ble benyttet for å måle intensiteten av båndene. Alle verdier i arbitrære enheter. c) Immunhistokjemi av angitte eksempler, ved anvendelse av anti-MIF og anti-PTRF /Cavin-1 primære antistoffer. AC: Adenocarcinoma; SC: Plateepitelkarsinom; NL. Normal lunge
Box-plot grafer som viser PTRF og MIF western blot kvantifisering ved hjelp ImageJ 1.38e programvare. Alle verdier i arbitrære enheter. Hver boks inneholder verdier fra ni forskjellige prøver. Forskjeller mellom normale og tumorprøver var p. 0,005 i begge tilfeller (Kruskall-Wallis test)
Vi søkte i STRING database for interactomic tilkoblinger av MIF og PTRF. For å minimere antall falske positiver, eliminert vi partnere ved hjelp av strenge kriterier, og bare eksperimentelle protein-protein interaksjoner og trasé fra kuraterte databaser ble tatt hensyn til. PTRF er inkludert i RNA-transkripsjon vei, og fysisk kommuniserer med TTF1. Andre PTRF interaksjoner omfatter proteiner involvert i transkripsjon regulering og EGFR (figur 5). MIF er relatert til fenylalanin metabolisme vei, og interagerer med p53 og proteiner av COP9 signalosome kompleks, et kompleks som er involvert i ulike cellulære og utviklingsmessige prosesser, inkludert p53-mediert fosforylering degradering [19]. Andre interaksjoner omfatter proteiner relatert med celledød regulering og betennelsesprosessen (figur 6).
Vises
En graf med PTRF nettverk bygget med STRING v9.0. Ulike linje farger representerer hvilke typer bevis for foreningen. Rosa for eksperimenter og blått for databaser
En graf med MIF nettverk bygget med STRING v9.0 vises. Ulike linje farger representerer hvilke typer bevis for foreningen. Rosa for eksperimenter og blått for databaser
Diskusjoner
Proteomics generelt og phosphoproteomics spesielt blir den foretrukne metoder protein discovery-baserte analyser. Bruken av label-free, søkebaserte tilnærminger kan bidra til å oppdage uventede biologiske forbindelser på grunn av fravær av forkunnskaper bias. Bioinformatikk verktøy, for eksempel genet ontologi og interactome analyser, brukt på kliniske prøver har stort potensial til å identifisere stier og molekyler med implikasjon ved terapeutisk nivå, og kan tilby ledetråder til dannelsen av sykdommer og deres underliggende molekylære endringer. Imidlertid bør både selve teknologien og verktøyene dataanalyse bli ytterligere raffinert før de trer i klinikken.
Phosphopeptide berikelse av prøvene før MS-analyse ved hjelp PIMAC fungerte rimelig bra, som 20% av målte peptider var fosforylert. Tidligere studier har vist en berikelse av fosfor på ca 50% ved hjelp av en IMAC protokoll som ligner våre på tryptisk sammendrag av en blanding av flere referanse proteiner [20]. Tatt i betraktning at våre prøvene var svært komplisert, og at vi ikke bruker noen fraksjoneringstrinn, phosphopeptide berikelse var vellykket og kan sammenlignes med det som oppnås i tidligere arbeider [21], [22]. Men de fleste av de spektra som viser et fosfat tap presentert en dårlig fragmentering, og ingen identifikasjon peptid ble dannet. Bruk av nye teknikker for fragmentering, som høyere energi collisional dissosiasjon, forbedre kvaliteten av fragmentering spektra [23], slik at for å utføre i stor skala phosphoproteome analyse.
Gene ontology analyser av biologisk prosess og trasé viste en økning i kategorier knyttet til energiproduksjon i cellene, slik som glykolyse og generering av forløper metabolitter og energi. Disse forskjellene i energiomsetningen mellom normale og kreftceller er kjent som Warburg effekten [24]. Fra signalveier underrepresentert i NSCLC vev, har chemokine- og cytokin-mediert inflammasjon er tidligere vist seg å være underrepresentert i NSCLC [25]. Det er bemerkelsesverdig at overrepresentasjon av proteiner som tilhører EGFR signalveien, i en kontekst hvor klinisk bruk av EGFR-hemmere har blitt paradigme personlig terapi for NSCLC [26], [27], [28].
Mer enn 10% av oppdaget peptider viste en differensial uttrykk mellom normale og tumorprøver. Prosentandelen av differensial peptider var mindre enn 2% når man sammenligner adenokarsinom og squamous celle lungekarsinom prøver, men fortsatt var det store forskjeller mellom disse to NSCLC histologiske subtyper, som vi tidligere har vist [11].
Vi var i stand til å validere NSCLC potensielle biomarkører er identifisert i hagle proteomikk analyser med IHC og vestlige blot tilnærminger. MIF (makrofag migrasjon hemmende faktor) diskriminert mellom normal lunge og NSCLC prøvene. Denne kjente faktoren er et proinflammatorisk cytokin som er i stand til å virke som oppløselig vekstfaktor, uttrykt og utskilt som respons på mitogener og integrin-medierte signaler. MIF protein er involvert i mange kreftformer, da det fremmer cellulær transformasjon, hemmer cytolytiske immunrespons mot tumorceller og fremmer neovaskularisering [29]. Interactome analyser viste en nær sammenheng mellom celledød regulering og MIF, og det er ikke overraskende at MIF over-ekspresjon ble beskrevet i mange typer kreft, inkludert kolorektal, bryst, prostata, hud og lungekreft [30], [31], å ha en viktig rolle i utviklingen av tumorer i sentralnervesystemet [32]. Svulster som samtidig uttrykte MIF og dens membran reseptor (CD74 protein) har økt vaskularisering [33]. Selv om det er flere molekyler som hemmer enzymatisk aktivitet av MIF har sin høye IC50 begrenset klinisk bruk så langt [34], men nye molekyler er under dagens utvikling [35]. Våre resultater viser en økt uttrykk for MIF i NSCLC prøver ved label-fri proteomikk, bekreftet av både western blot og immunhistokjemi.
PTRF (Polimerase jeg og transkripsjon Slipp Factor), også kjent som cavin-en, er en protein viktig for RNA transkripsjon [36] og caveolae formasjon [37]. Disse invaginations av celleoverflaten er forbundet med prosesser av vesikulært transport, kolesterol homeostase, signaltransduksjon [38] og lipolyse kontroll [39]. Derfor er det ikke overraskende at PTRF /cavin-1 mutasjoner er forbundet med medfødt generalisert lipodystrofi, type 4 hos mennesker [40]. PTRF /cavin-1 colocalizes med caveolin 1 (CAV1) innen caveolae [41], og positivt modulerer dens uttrykk [42]. Interactome analyser tyder på at PTRF havner ukjente funksjoner utover noen nylig beskrevet [43], [44], [45]. Tap av PTRF /cavin-1-ekspresjon i prostata cancer har vært forbundet med progresjon [46], og det har vist seg at dets ekspresjon reduserer migreringen av PTRF /Cavin-1-manglende prostatakreftceller [47]. Tapet av PTRF /cavin-1-ekspresjon i tumorigen HBe-celler sammenlignet med normale humane bronkiale epitelceller har vist seg nylig [48]. Bai og kolleger har rapportert nylig at PTRF protein ble nedregulert i brystkreftcellelinjer og brystsvulstvevet, og at nedregulering av PTRF i brystkreftceller ble assosiert med arrangøren metylering [49]. PTRF /cavin-1 fosforylerte arter er blitt beskrevet i celler som overuttrykker EGFR, noe som antyder en funksjon i denne signalveien [50]. Våre tape-free proteomikk resultater indikerer at PTRF uttrykk er tapt i NSCLC prøvene. Disse resultatene ble bekreftet ved hjelp av både western blot og immunhistokjemisk farging. Dette er den første studie som viser PTRF /cavin-1 tap av ekspresjon i NSCLC tumorvev på proteinnivået. Dette tapet av uttrykk, sammen med PTRF-EGFR samhandling og EGFR sti deregulering i NSCLC prøvene, antyder en rolle PTRF i NSCLC utvikling.
Vårt arbeid viser at det er mulig å identifisere potensielle biomarkører ved hjelp av en etikett fritt differensial proteomikk strategi på virkelige kliniske prøver. Vi identifiserte flere differensial markører, hvorav to ble validert av alternative klassiske proteomikk metoder. Videre viser vi at genet ontologi og samhandling analyser kan identifisere stier og prosesser endret på svulstvev, noe som kan gi ledetråder til opprinnelsen til sykdommen og dens underliggende molekylære forandringer, og kan være utsatt for terapeutisk intervensjon. I denne forstand, indikerer dette arbeidet som PTRF rolle i NSCLC og sitt forhold til EGFR pathway fortjener videre leting.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Analyse av forskjeller i GO Molecular Funksjon mellom NSCLC og normal lunge. Sammenligning av antall proteiner som er tildelt hver GO pathway kategori. Normale vevsprøve romkategorier er representert som fold-endring i forhold til denne kategorien. Statistisk signifikans er testet ved hjelp av binomisk test. Kun signifikante kategorier (p 0,05) er vist
doi: 10,1371 /journal.pone.0033752.s001 plakater (TIF)
Figur S2..
Analyse av forskjeller i GO biologisk prosess mellom NSCLC og normal lunge. Sammenligning av antall proteiner som er tildelt hver GO pathway kategori. Normale vevsprøve romkategorier er representert som fold-endring i forhold til denne kategorien. Statistisk signifikans er testet ved hjelp av binomisk test. Kun signifikante kategorier (p 0,05) er vist
doi: 10,1371 /journal.pone.0033752.s002 plakater (TIF)
Figur S3..
Fragmentering spektra fra PTRF SLKESEALPEK tryptisk peptid. Diagrammet viser fragmentioner som tilsvarer hoved fragmentering serie (b-amino og y-karboksy). * Viser vanntap; 2+, dobbelt belastet fragment. Foreldre ion er merket med en pil
doi:. 10,1371 /journal.pone.0033752.s003 plakater (TIF)
Figur S4.
Fragmentering spektra fra MIF PMFIVNTNVPR tryptisk peptid. Diagrammet viser fragmentioner som tilsvarer hoved fragmentering serie (b-amino og y-karboksy). * Indikerer vanntap. Foreldre ion er merket med en pil
doi:. 10,1371 /journal.pone.0033752.s004 plakater (TIF)
Tabell S1.
Gene ontologi analyser utført med PANTHER. Normal lunge protein listen ble brukt som referanselisten
doi:. 10,1371 /journal.pone.0033752.s005 product: (PDF)
Tabell S2.
SIEVE label-free kvantifisering. Data innhentet fra SIEVE analyser, inkludert relative uttrykk verdier
doi:. 10,1371 /journal.pone.0033752.s006 product: (PDF)
tabell S3.
PTRF og MIF MS2 spektra.
doi: 10,1371 /journal.pone.0033752.s007 product: (PDF)
Tabell S4.
Peptide Mass Fingeravtrykk og protein identifikasjon innstillinger.
doi: 10,1371 /journal.pone.0033752.s008 plakater (DOC)
Takk
Vi vil spesielt erkjenner pasientene i denne studien for deres deltakelse og IdiPAZ Biobank integrert i den spanske Hospital biobank Network (RetBioH; www.redbiobancos.es), for de generøse gaver av kliniske prøver som brukes i dette arbeidet
.
