Abstract
Kreft stilk-lignende side befolkningen (SP) celler har blitt identifisert i mange solide svulster; men de fleste av disse undersøkelsene er utført ved bruk av etablerte kreftcellelinjer. Kreftceller i tumorvevet inneholdende fibroblaster og mange andre typer celler er mye mer komplisert enn en hvilken som helst cancercellelinje. Selv om SP celler ble identifisert i strupehodet plateepitelkarsinom (LSCC) cellelinje Hep-2 i vår pilotstudie, er det ukjent om LSCC vev inneholder SP celler. I denne studien LSCC celler (LSCCs) var primært dyrket og renset fra en kirurgisk reseksjon LSCC prøven stammer fra en godt differensiert epiglottiske svulst i en kinesisk mann. Dette ble etterfulgt av kontroll av epitel-spesifikke egenskaper, for eksempel ultrastruktur og biomarkører. En distinkt SP undergruppe (4,45 ± 1,07%) ble isolert ved Hoechst 33342-utstrømning fra dyrkede analyse LSCCs ved hjelp av et flowcytometer. Cancer stamcelle (CSC) -associated analyser, blant annet uttrykk for selvfornyelse og CSC markørgener, spredning, differensiering, spheroid formasjon, kjemoterapi motstand, og tumorgenisiteten ble deretter gjennomført mellom SP og ikke-SP (NSP) LSCCs.
In vitro Hotell og
in vivo
analyser viste at SP celler manifestert fortrinnsrett uttrykk for selvfornyelse og CSC markørgener, høyere kapasitet for spredning, differensiering, og spheroid formasjon; forbedret motstand mot kjemoterapi; og større xenograft tumorigenicity i immunsvikt mus sammenlignet med NSP celler. Disse funnene tyder på at de viktigste kultur og renset LSCCs inneholde kreft stilk-lignende SP celler, som kan tjene som en verdifull modell for CSC forskning i LSCC
Citation. Wu CP, Zhou L, Xie M, Du HD Tian J, Sun S, et al. (2013) Identifisering av Cancer Stem-Like Side Befolknings Celler i Purified Primær dyrkede humane Strupe Plateepitelkarsinom epitel. PLoS ONE 8 (6): e65750. doi: 10,1371 /journal.pone.0065750
Redaktør: Jian Cao, Stony Brook University, USA
mottatt: 26 november 2012; Godkjent: 29 april 2013; Publisert: 11 juni 2013
Copyright: © 2013 Wu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble delvis støttet av Natural Science Foundation National of China (30872855) og Foundation Shanghai Science and Technology of China (12JC1402101). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Cancer stammelignende side populasjon (SP) celler har blitt identifisert i et bredt spekter av faste tumorer, inkludert brystkreft [1], [2], hepatocellulært karsinom [3] – [7], lunge kreft [8], [9], gastrointestinal kreft [10] – [12], prostatakreft [13], galleblærekreft [14], eggstokk-kreft [15], endometrial kreft [16], bukspyttkjertelkreft [17], [ ,,,0],18], urologisk kreft [19], [20], glioblastom [21], melanom [22], osteosarkom [23], [24], mesenchymale svulster [25], nasopharyngeal kreft [26], munnhulekreft [27], [28], og andre hode og nakke kreft [29], [30]. Men de fleste av disse undersøkelsene er blitt utført ved bruk av etablerte kreftcellelinjer. Selv etablerte kreftcellelinjer er nyttige verktøy i grunnleggende og preklinisk kreftforskning, er de forenklede etterligner av komplekse, heterogene, solide kreftvevet. Kreftceller i primær tumor vev inneholdende fibroblaster, stromaceller, lymfocytter og andre celletyper er mye mer kompleks enn cellene i en hvilken som helst cancercellelinje. Derfor kan primære dyrkede og renset kreftceller som stammer fra kreftvevet være en bedre representasjon av den opprinnelige svulsten.
Strupe plateepitelkarsinom (LSCC) er en av de vanligste kreftformen i hode og nakkeregionen. I de senere årene har LSCC pasienter i avansert stadium fortsatt en tendens til å gi etter for lokoregionalt tilbakefall og fjernmetastaser. Cancer stammeliknende SP-celler spiller en kritisk rolle i startfasen, vedlikehold, progresjon, og tilbakefall [31] – [33]. Derfor, for å pågående forskning på SP celler utvikle nye agenter som er rettet mot kreftstamceller (cscs) er stort behov for.
Våre pilot studie identifisert kreft stilk-lignende SP celler i LSCC cellelinje Hep-2 [30] . Det er imidlertid ikke kjent hvorvidt den LSCC fast tumor inneholder SP-celler. I denne studien, for første gang, brukte vi Hoechst 33342 utstrømming analyse for å identifisere SP celler direkte fra rensede, primære dyrkede, godt differensierte LSCC celler (LSCCs) stammer fra en kinesisk mannlig pasient som gjennomgår laryngectomy for epiglottiske karsinom. Vi fant at de viktigste kultur LSCCs inneholdt også en tydelig SP undergruppe, som utgjorde 4,45 ± 1,07% av den totale kreftceller. I tillegg, ved å
in vitro Hotell og
in vivo
analyser dokumentert vi at SP cellene næret flere kreft stilk-lignende egenskaper sammenlignet med ikke-SP celler (NSP).
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Tumor prøven ble innhentet med godkjenning av etikkomiteen i øyet, øre-nese-hals Hospital, Fudan University, Shanghai, Kina. Signert informert samtykke ble innhentet fra pasienten. Protokollen ble godkjent av Shanghai Medical Experimental Animal Care Committee. Alle operasjoner ble utført under natrium pentobarbital anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
Pasientinformasjon
Pasienten var en ubehandlet 68-år gammel kinesisk mann som gjennomgikk laryngectomy for plateepitelkarsinom karsinom stammer fra strupelokket, Stage IVa, T4aN2M0, basert på den sjette utgaven Union for International Cancer Control (UICC) TNM klassifiseringssystem. Spesielt, gjorde han ikke har en familiehistorie med hode og nakke kreft, men har en 40-årige historie av røyking og 30-årige historie av alkoholbruk.
Primær Kultur og rensing av LSCCs
En kirurgisk reseksjon tumor prøven ble neddykket i kaldt trippel antibiotisk fosfatbufret saltvann (PBS) inneholdende 1% penicillin /streptomycin og amfotericin B (10 pg /ml) (Invitrogen, Buffalo, NY, USA), og scissored opp i små fragmenter, som deretter ble dissosiert enzymatisk i RPMI 1640 medium inneholdende type IV kollagenase (Sigma) til en sluttkonsentrasjon på 200 U /ml i minst 12 timer ved 37 ° C. Cellene og de gjenværende fragmenter ble deretter skylt og suspendert i BEGM ™ (bronkiale epitel cellevekstmedium) (katalog CC-3170; Lonza, Walkersville, MD, USA) supplementert med 1% penicillin /streptomycin. Suspensjonen ble deretter sådd ut i 60 mm petriskåler i en fuktet 5% CO
2 inkubator ved 37 ° C. Etter 3-4 dagers inkubering, noen av fragmentene og cellene som festet seg til skålen; de som ikke holder seg ble vasket bort før mediet ble fornyet. Fibroblaster ble fjernet ved kort eksponering til 0,25% trypsin-EDTA (Invitrogen, Buffalo). Kreftceller nærheten samløpet ble frittliggende med 0,25% trypsin-EDTA og dyrket. Celler ble oppbevart i flytende nitrogen fra passasjen 1.
morfologisk undersøkelse og Immunocytochemistry
Kultur LSCCs ble undersøkt under et fasekontrastmikroskop for morfologiske egenskaper. For å validere den epiteliale opprinnelse, ble LSCCs dyrking i 24 timer på dekkglass fiksert med 4% paraformaldehyd (PFA) i 10 minutter og deretter inkubert i 1% bovint serumalbumin (BSA) /10% normalt geiteserum /0,3% Triton X- 100 (BOOSTER, Wuhan, Kina) ved romtemperatur i 40 minutter for å blokkere ikke-spesifikke interaksjoner og permeabilisere cellene. Monoklonale antistoffer mot humant cytokeratin (CK) (pan) (1:50, klone AE1 /AE3; Maixin Biotech, Fuzhou, Kina), cytokeratin 5 (CK5) (1:50, kataloger C0246, Anbo, San Francisco, CA, USA ), og vimentin (01:50, klon SP20; Maixin Biotech) ble tilsatt og inkubert over natten ved 4 ° C, etterfulgt av tilsetning av sekundært antistoff og inkubering i mørke i 1 time ved 37 ° C. den kjerner ble farget med 4 «, 6-diamidino-to-phenylindole (DAPI, BOOSTER, Wuhan, Kina). Det sekundære antistoffet var Cy3-konjugert geit anti-mus /kanin-immunoglobulin (Ig) G tunge og lette kjeder (H + L). (1:100; Jackson, Lancaster, PA, USA)
transmisjonselektronmikroskopi
En pellet hentet fra høstet LSCCs ved passering 2 ble løst med 2,5% glutaraldehyd og postfiks i 1% osmiumtetroksyd. Prøven ble dehydratisert gjennom en gradert serie alkohol og innleiret i harpiks. Ultratynne snitt ble kuttet, farget med uranylacetat og føre citrate, og observert under en Philips CM120 transmisjonselektronmikroskop (TEM).
Flowcytometer for renheten av Primary Dyrkede LSCCs
Kultur LSCCs var trypsinert, vasket i PBS, fiksert i 4% PFA i 10 min, og inkubert i 1% BSA /10% normalt geiteserum /0,3% Triton X-100 (BOOSTER) ved romtemperatur i 40 min for å permeabilisere cellene og blokkere ikke-spesifikk interaksjoner. Dette ble etterfulgt av inkubering i PBS inneholdende CK (pan) -fluorescein isotiocyanat antistoff (1:500, klon C-11; Sigma) i 30 minutter ved romtemperatur. Deretter ble cellene vasket to ganger med PBS og analysert ved hjelp av en cyan ADP flowcytometer (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA). Celler behandlet med PBS istedenfor CK (pan) fungerte som kontroll.
Deteksjon og Isolering av SP og NSP celler ved hjelp av flowcytometri
Kultur LSCCs i eksponentiell vekstfase ble skylt i PBS, trypsinert, og suspendert ved en konsentrasjon på 1 x 10
6 celler /ml i kald BEGM medium. Hoechst 33342 (Sigma) ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 5 ug /ml i nærvær eller fravær av verapamil (Sigma) ved 50 umol /l, preinkubert i 30 minutter ved 37 ° C. Dette ble etterfulgt av en 90-minutters inkubering i mørket ved 37 ° C med risting intervall. Etter vasking, ble 1 pg /ml propidiumjodid (Sigma) tilsatt for å ekskludere døde celler, og prøvene ble analysert på en EPICS ALTRA strømningscytometer (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA).
celleviabilitet Assay
Ferskt sortert SP og NSP LSCCs ble sådd i 96-brønns plater ved en densitet på 5000 celler /brønn i 0,2 ml medium BEGM og serumfritt medium (SFM, er beskrevet i det følgende sfæroide formasjon analyse). Hver gruppe ble gjentatt i 6 brønner, og medium uten celler som tjente som en kontroll. Celleviabilitet ble målt ved hjelp av celletelling Kit-8 (CCK-8; Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan), etter produsentens anvisninger. Inkuberingen varte i 3 timer, og analysen ble utført i tre eksemplarer. Ultrafiolett absorbans ble målt ved 450 nm med en enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) plateleser.
Kvantitativ Real-time PCR (QRT-PCR)
Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA , USA) ble anvendt for å ekstrahere total RNA fra isolerte SP og NSP celler ved hjelp av. Revers transkripsjon ble utført ved hjelp PrimeScript® RT reagenssett med gDNA viskelær (Takara, Dalian, Kina). Real-time PCR ble gjort med SYBR® Premiks Ex TaqTM kit (Takara) i en LightCycler 480 instrument (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Sveits). Termisk syklus inkluderte en innledende denaturering ved 95 ° C i 30 sekunder, etterfulgt av 40 sykluser ved 95 ° C i 5 s og 60 ° C i 30 sek. Beta-aktin (ACTB) ble anvendt som en endogen kontroll. Formelen
-ΔΔCT 2 ble anvendt for å beregne den relative mRNA-ekspresjon av SP versus NSP-celler. Primere som brukes til forsterkning er oppført i tabell 1.
Western Blot for CSC Markers
Om 30 mikrogram av proteinprøver fra cellelysater av sortert SP og NSP celler ble analysert ved hjelp natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgel gelelektroforese (Beyotime, Shanghai, Kina), elektrooverført til polyvinylidenfluorid membraner (Millipore, Bille, MA, USA), og undersøkt over natten med primær antistoff (Epitomics, Burlingame, CA, USA) for CD44 (1:1,000 , 1998-1), CD24 (1:500, T3445), CD133 (1:1,000, 3621-1), ABCG2 (1:1,000, 3765-1), BMI1 (1:10,000, 5590-1), OCT4 ( 1:1,000, 2876-1), SOX2 (1:1,000, 2683-1), og Nanog (1:1,000, 3369-1). Geit anti-kanin IgG (H + L) (1:5,000, Jackson) ble deretter påført, etterfulgt av signal deteksjon ved hjelp BeyoECL Plus (Beyotime, Shanghai, Kina). ACTB antistoff (1:5,000, R1207-1, Hua Biotech, Hangzhou, Kina) ble brukt til å normalisere mengden av prøven lastet
Proliferation Assay
Ordnet SP og NSP LSCCs ble sådd som. beskrevet ovenfor. På dag 1, 3, 5 og 7 etter sortering, ble cellevekst analysert ved hjelp av CCK-8, etter produsentens anvisninger. Inkuberingen varte i 3 timer, og analysen ble utført i tre eksemplarer. Ultrafiolett absorbans ble målt til 450.
Differensiering analysen
Isolert SP og NSP celler ble dyrket i BEGM medium i 18 dager der prøvene ble restained av Hoechst 33342 på dag 6, 12, og 18 for å kvantifisere prosentandel av SP-celler i hver gruppe. Vi brukte et strømningscytometer for analyse
sfæroide Formation Assay
Ordnet SP og NSP-celler (5.000 celler /ml) ble dyrket ved hjelp av StemPro_ NSC SFM kit (A10509-01;. Invitrogen, Karlsbad), og med SFM inneholdende Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) /F12, 20 ng /ml fibroblast vekstfaktor, og 20 ng /ml epidermal vekstfaktor. I tillegg, 1% 200 mmol /l L-glutamin (25030; Invitrogen, Grand Island, NY, USA) ble tilsatt. Etter såing ble spheroid dannelsen evne av de to undergrupper observert over tid.
Drug Følsomhet Analyse
Ordnet SP og NSP LSCCs ble sådd på 5 × 10
3 celler /brønn i 96-brønners plater og dyrket i BEGM medium inneholdende cisplatin (Pharmaceutical Factory, Nanjing, Kina) i en konsentrasjon-gradient (0, 1, 3, 5, 7, 9, 11 ug /ml). Hver konsentrasjon ble gjentatt i 6 brønner. De andre seks parallelle brønner ble preinkubert med 50 umol /l verapamil som en chemosensitizer til cisplatin i 30 minutter ved 37 ° C. En konsentrasjon av 0 ug /ml tjente som kontroll. En ekstra 6 brønner som inneholder medium bare fungerte som en blank kontroll. Cellene, dyrket i 48 timer, ble vurdert ved å inkubere med CCK-8 i 3 timer. Inhiberings-graden (IR) ble evaluert ved bruk av formelen IR = 100% overlevelsesverdien (SR), og SR ble målt ved anvendelse av formelen SR = (gjennomsnittlig absorbans av testbrønnene /bety Absorbansen av kontrollbrønnene) x 100% .
Xenotransplantat tumorigenitet analysen
in vivo
Mann nonobese diabetiker (NOD) /alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) mus, 6-8 ukers alder (SLAC Laboratory Animal selskapet , Shanghai, Kina), ble matet i laminær skap under patogenfrie forhold. Sortert SP, NSP-celler, og moder LSCCs uten sortering ble suspendert i 0,2 ml PBS og injisert i armhulen hos hver mus. Musene ble palpated to ganger hver uke for tumordannelse og ble avlivet 6 uker senere. Alle tumorknuter ble fotografert, veiet, og bekreftet med hematoxylin og eosin-farging. P-verdier ble beregnet i henhold til vekten av SP tumorer i forhold til de av NSP tumorer.
Statistical Analysis
Resultatene ble angitt som middelverdi ± standardavvik (SD) på minst 3 uavhengige eksperimenter. The Student t eller
Mann-Whitney
test ble brukt med GraphPad Prism programvare versjon 5.00 for Windows (GraphPad Software, San Diego CA, USA) for å undersøke forskjellene. Verdier for P 0,05 ble vurdert som signifikante
Resultater
morfologiske, immunocytokjemisk, og ultrastructural Funksjoner
De dyrkede LSCCs vokste som et monolag i en brostein mønster, demonstrere sin epitel. opprinnelse. Dessuten oppviste de typiske egenskaper ved ondartet endring (fig. 1 A-C). Positiv farging av CK (pan) og CK5 og negativ farging av vimentin bekreftet sin epitel avstamning (Fig. 1D-F). Den transmisjons-elektronmikroskopibilde avslørte typiske epitelceller kjennetegn ved LSCCs, inkludert mange mitokondrier, grove endoplasmatiske Reticuli, ribosomer, store uregelmessige kjerner med kjernemembranen viser dype hakk, og microvillus-lignende fremspring på celleoverflaten. Bunter av tonofilaments i cytoplasma og mange desmosomes i intercellulære forbindelser ble ofte observert (Fig. 1G-I).
(A) Laryngeal plateepitelkarsinom celler (LSCCs) vokste direkte fra eksplantering 48 timer etter seeding omgitt av fibroblaster (pil). (B) Ved passering 1, LSCCs vokste med coexisting fibroblaster (pil). (C) Ved passering 4, LSCCs vokste kraftig uten fibroblaster og utstilt typiske kjennetegn ved ondartet forandring, inkludert mange mitotiske tall, en stor kjernefysisk til cytoplasma ratio, fremtredende flere nucleoli, sporadisk flerkjernede kjempeceller, cytoplasmatiske vakuoler, runde og selvlysende celler, og kjernekraft unormalt. Positiv farging av cytokeratin (CK) (pan) (D) og CK5 (E), og negativ farging av vimentin (F). Ultra funksjoner (piler) av LSCCs viser desmosomes i intercellulære tilkoblinger (G), tonofilaments i cytoplasma (H), og innrykket atom membran (I).
Purity og sortering av SP Celler i Purified primære dyrkede LSCCs
renheten av primære dyrkede LSCCs bestemmes av flowcytometri var 98,32 ± 0,93% (fig. 2A, B). Cellesortering ble utført etter eksklusive døde celler og cellerester basert på spredningssignaler og propidiumjodid fluorescens. R2 gate viste SP celler som var Hoechst 33342 negativ /dim, og R4 gate angitte NSP celler som var Hoechst 33342 positiv. SP celler okkupert noen 4,45 ± 1,07% av totalt antall celler. Når preinkubert med verapamil i 30 minutter, prosentandelen av SP-celler krympet til 0,14 ± 0,13% av det totale antall celler (Fig. 2C, D). SP og NSP celler ble samlet inn for senere eksperimenter. Renheten av fersk sortert SP og ikke-SP celler var 99,25 ± 0,23% og 98,98 ± 0,22%, henholdsvis (Fig. 2E, F).
(A) Purity av dyrkede LSCCs bestemmes av flowcytometer hjelp cytokeratin (CK) (pan) (98,32 ± 0,93%) og (B) kontroll. (C) for sortering av LSCCs ved hjelp av Hoechst 33342. Den R2 porten representerer den side populasjonen (SP) -celler (4,45 ± 1,07% av totale celler) og R4 porten er den ikke-SP (NSP) celler. (D) SP andel etter verapamil behandling var 0,14 ± 0,13%. Renheten av fersk sortert SP (99,25 ± 0,23%) (E) og NSP celler (98,98 ± 0,22%) (F).
celleviabilitet etter sortering
Ingen signifikant ble påvist forskjeller i cellelevedyktighet mellom den ferske sortert SP og NSP LSCCs opprettholdt i både BEGM og SFM-medium (P 0,05) (fig. 3A), som indikerer at den Hoechst konsentrasjon (5 ug /ml) brukt i denne studien ikke potensielt endre celleviabilitet av NSP LSCCs.
. (A) Celleviabilitet etter sortering. ble påvist noen signifikant forskjell i celleviabilitet mellom side populasjon (SP) og ikke-SP (NSP) celler i bronkial epitelial cellevekstmedium (BEGM) og serumfritt medium (SFM). Relativ (B) mRNA og (C) protein nivåer av selvfornyelse og CSC markørgener i SP og NSP celler. (D) Cell vekst på SP og NSP celler i både BEGM og SFM bestemmes av Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (*** P 0,01, ** P 0,05, * P 0,05).
uttrykk for selvfornyelse og CSC markørgener i mRNA nivå
De relative mRNA uttrykk for ABCG2, BMI1, OCT4, Nanog, SOX2, CD44, CD24, og CD133 i sorterte SP og NSP celler ble bestemt ved QRT-PCR. Resultatene viste at SP celler viste høyere mRNA uttrykk i ABCG2, BMI1, OCT4, Nanog, SOX2, og CD44 sammenlignet med NSP celler. Imidlertid, ingen signifikant forskjell fra CD24 og CD133 mRNA-ekspresjon ble påvist mellom SP og NSP-celler (fig. 3B).
Proteinnivåer CSC Markers
SP-celler ble funnet å ha økt protein nivåer av CD44, ABCG2, BMI1, OCT4, SOX2, og Nanog sammenlignet med NSP celler. ble påvist noen signifikante forskjeller i CD24 og CD133 proteinnivåer mellom SP og NSP celler (fig. 3C).
Cell vekstrate
På dag 1, 3, 5 og 7 etter sortering, absorbansen for SP og NSP-celler ble målt ved bruk av CCK-8 for å bestemme veksthastigheten. I BEGM medium, både SP og NSP cellene proliferated over tid. SP cellene nådde en eksponentiell vekstfase 3 dager etter såing og dag 7 hadde de nådd et platå. I kontrast, NSP cellene fortsatte å vokse sakte til dag 7 før du flytter inn en oppgradering fase (P 0,001). I SFM, SP-celler proliferert stabilt med en hastighet lavere enn det i den BEGM. I kontrast, NSP celler neppe spredte (Fig. 3D).
Differensiering Analyse
På dager 6, 12 og 18 etter såing, den kultiverte SP og NSP celler ble restained med Hoechst 33342 til måle forskjeller i deres differensiering evne. Dataene viste at prosentandelen av SP-celler i kultur ble redusert over tid, ved 17,67 ± 1,45% på dag 6, 9,08 ± 0,61% på dag 12, og 4,45 ± 0,63% på dag 18 (fig. 4A-F). På dag 18 var prosentandelen av Hoechst 33342-matte /negative celler i dyrkede SP-celler var lik som fra usorterte LSCCs, mens dyrkede NSP-celler inneholdt bare 0,07 ± 0,03% SP-celler (fig. 4G-H), som kan ha oppstått fra rest SP celler fra siste sorteringen.
andelen side befolkningen (SP) celler oppdaget i dyrkede SP celler ble redusert over tid. Prosentandelen av SP-celler var 17,67 ± 1,45% på dag 6 (A, B), 9,08 ± 0,61% på dag 12 (C, D), og 4,45 ± 0,63% på dag 18 (E, F). I kontrast, andelen av SP celler i dyrkede ikke-SP (NSP) celler var 0,07 ± 0,03% (G, H).
Sphere Dannelse
Isolerte SP celler proliferated stabilt i stammen cellekulturmedium. Flytende kuler i suspensjon som genereres fra en enkelt celle av SP LSCCs økte i størrelse i løpet av tiden (fig. 5A-C). I motsetning til enkelte NSP celler døde og andre spredte veldig sakte og ikke kunne danne visuelle sfærer (Fig. 5D).
På dag 3 (A, × 100), dag 5 (B, × 100), og dag 7 (C, x 400), flytende sfæriske klynger av side populasjon (SP) celler ekspandert på en trinnvis måte over tid. I motsetning til dette kunne ikke-SP (NSP) celler danner ikke klynger sfæriske etter å ha blitt dyrket i 7 dager (D, x 100). (E) Sensitivitet av nylig sortert SP og NSP til cisplatin. Inhiberings-graden (IR) av SP-celler viste en signifikant forskjell fra NSP-celler ved hver konsentrasjon (P 0,001), med unntak av 11 ug /ml (P 0,05). SP-celler var mer resistente overfor cisplatin enn NSP-celler; dette kan bli reversert ved verapamil forbehandling.
Drug Følsomhet Forskjeller mellom SP og NSP Cells
Ulike konsentrasjoner av cisplatin ble brukt til å vurdere forskjellene narkotika følsomhet mellom SP og NSP celler i tilstedeværelse eller fravær av verapamil, en blokkering av celleoverflaten ABCG2 transportøren som er ansvarlig for kjemoterapeutisk resistens. Ved behandling med cisplatin alene, SP-celler viste sterk motstand inntil konsentrasjonen av cisplatin nådde 9 ug /ml, og den IR av SP-celler viste ingen signifikant forskjell fra NSP i en konsentrasjon på 11 ug /ml (P 0,05). Sammenlignet med SP-celler, IR av NSP-celler viste signifikant forskjell ved hver konsentrasjon (P 0,001), bortsett fra ved 11 ug /ml. IR av SP-celler forbehandlet med verapamil økes uten signifikant forskjell sammenlignet NSP celler (P 0,05), men med signifikant forskjell sammenlignet med SP-celler uten forbehandling verapamil (P 0,001). Ingen store forandringer ble påvist i IR av NSP celler i nærvær eller fravær av verapamil (P 0,05). (Fig. 5E)
Høyere Svulst kapasitet SP celler i NOD /SCID mus
Vi brukte usorterte LSCCs for den foreløpige eksperiment og valgte 4 × 10
5 som høyeste vaksinasjonen celle nummer for SP og NSP celler. Med den laveste vaksinasjon celle nummer (2 × 10
4), SP celler dannet to tumorer (n = 4); i motsetning til den laveste injeksjons celle nummer for NSP-celler for å danne to tumorene var 2 x 10
5 (n = 4). Signifikante forskjeller ble oppdaget mellom vekten av SP svulster og NSP tumorer. De patologiske Resultatene bekreftet at begge svulster som dannes av SP og NSP celler var godt differensierte LSCCs, lik den opprinnelige svulsten (figur 6;. Tabell 2).
(A) Injeksjons av nonobese diabetiker (NOD) /alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) mus. Hematoxylin og eosin-farging av tumorer avledet fra pasienten (B), mus (C, tumor dannet av side populasjon (SP), D, tumor dannet ved ikke-SP (NSP) celler). Både de opprinnelige og xenopodet svulster var typisk, godt differensiert, plateepitelkarsinom med keratin perler observert hyppig (piler). (E) med 2 × 10
5 celler injisert, SP celler dannet fire større svulster (4/4), mens NSP celler dannet to mye mindre svulster (2/4). (F) Statistisk analyse av SP og NSP tumor vekter på ulike injisert celle mengder (*** P 0,01, ** P 0,05).
Diskusjoner
i denne studien beskrev vi vellykket isolering og identifisering av kreft stilk-lignende SP celler direkte fra et kirurgisk reseksjon LSCC prøven stammer fra en godt differensiert epiglottiske svulst i en kinesisk mannlig pasient. Selv om primær LSCCs er vanskelige å dyrke
in vitro
, før isolasjon vi forsøkt primærkulturen på 40 LSCC prøver og lykkes i ett tilfelle. Vi deretter renset de dyrkede LSCCs ved gjentatt differensial trypsinering å eliminere kjøl fibroblaster.
Den mono og brostein mønster av LSCCs identifisert av fasekontrastmikroskopi, positiv farging av CK (pan) og CK5, negativ farging av vimentin, og epitel ultrastructure (inkludert tonofilaments og desmosomes) avslørt av transmisjonselektronmikroskopi bekreftet epithelial avstamning av de dyrkede LSCCs (fig. 1).
Siden de ondartede plateepitel celler er fenotypisk bestemmes av cytokeratin, vi brukte en flyt cytometer med CK (pan) antistoff for å bedømme renheten av dyrkede LSCCs. Selv om resultatene skal være 100%, renheten var 98,32 ± 0,93%, som kan være et resultat av den ufullkomne virkning av antistoffet (Fig. 2A, B). Vi demonstrerte at de rensede primære dyrkede LSCCs inneholdt en distinkt SP subpopulasjon (4,45 ± 1,07%), basert på deres evne til å utelukke Hoescht 33342 fargestoff, og denne kapasitet kan bli blokkert av verapamil, i samsvar med tidligere rapporter om at Hoechst 33342 utelukkelse verapamil sensitive (fig. 2C-F).
Som et DNA-bindende fargestoff, er Hoechst giftig for celler, spesielt ved høye konsentrasjoner. For å eliminere det problem som NSP-celler fortrinnsvis beholde cytotoksisk Hoechst 33342, noe som kan endre kapasiteten proliferasjon, ble en cellelevedyktighet analyse utført etter sortering. Resultatene viste ingen signifikante forskjeller i cellelevedyktighet mellom den ferske sortert SP og NSP-celler (P 0,05) (Fig. 3A), noe som indikerer at cellelevedyktigheten til NSP LSCCs ikke var potensielt påvirket av 5 ug /ml Hoechst, en konsentrasjon utbredt i SP cellen forskning [34].
i forhold til NSP celler, har SP celler økt uttrykk av gener som OCT4, Nanog, BMI-en, ABCG2, og SOX2 [31], som er involvert i reguleringen av stamcelleselvfornyelse. Interessant nok har disse fem genene også fungere som CSC markører i faste tumorer [35], [36]. I tillegg, CD44, CD24, CD133 og er velkjente CSC markører i faste tumorer [37]. Vi undersøkte ekspresjonen av de åtte gener i både mRNA og proteinnivåer. I samsvar med tidligere rapporter, ble SP celler funnet å ha signifikant oppregulert uttrykk for OCT4, Nanog, BMI-en, ABCG2, SOX2, og CD44 i både mRNA og protein nivå sammenlignet med NSP celler. Av notatet, NSP celler også utstilt uttrykk for CD44 protein, i samsvar med tidligere rapporter at CD44 er uttrykt i nesten alle kreftceller; dette gjenspeiler den tvetydigheten CD44 i CSC vedlikehold [38]. SP-celler ble også funnet å ha tilsvarende ekspresjon av CD24 og CD133 i både mRNA og proteinnivåene sammenlignet med NSP-celler, i overensstemmelse med tidligere rapporter om at CSC fenotyper for faste tumorer ikke nødvendigvis er ensartet mellom forskjellige krefttyper eller til og med svulster av samme histologiske subtype (fig. 3B, C) [37].
selvfornyelse og differensiering er sentrale egenskaper av stamceller som tillater dem å gi opphav til avkommet, inkludert cscs, som rommer ubegrenset proliferativ potensial, og til fenotypisk forskjellige celler som danner hoveddelen av tumoren. I spredning analysen, SP cellene vokste betydelig raskere enn NSP celler i både BEGM og SFM medium (Fig. 3D), bekrefter ubegrenset proliferativ potensialet i SP celler. Asymmetri er en bestemt type av celledeling med en attraktiv mekanisme i CSC, fordi den bare krever en inndeling for både selvfornyelse og differensiering [39]. I differensiering analysen, prosentandelen av SP-celler fra dyrkede SP-celler i kultur ble redusert over tid, med en trinnvis økning i andelen av NSP celler. Selv på dag 18, dyrkede celler NSP inneholdt bare 0,07 ± 0,03% SP-celler (fig. 4), og disse kan ha oppstått fra rest SP-celler fra den siste sortering. Dette tyder på at SP celler kan gjennomgå asymmetrisk celledeling å fornye seg selv og generere heterogene fenotyper av lav-tumorigent celler, inkludert NSP celler; kan imidlertid NSP celler ikke omvendt differensierer til SP-celler.
Neurale stamceller har evnen til å vokse i SFM og danner en neurosfære. Disse egenskaper er utnyttet for valg av stilk-lignende celler i humane kreftformer, representert hovedsakelig ved brystkreft. I vår studie, evne til SP-celler for å generere kuleformede kolonier var signifikant høyere enn den til NSP-celler, i overensstemmelse med tidligere studier (fig. 5A-D) [8], [30].
i stoffet følsomhet analysen har vi målt narkotika følsomhet forskjeller mellom SP og NSP celler. Mekanismen regulerer utstrømningen av Hoechst fargestoff er overdratt delvis gjennom uttrykket av ATP-binding cassette protein (ABC) transportører, hovedsakelig ABCG2, involvert i utstrømming av kjemoterapeutika [40], [41]. Derfor brukte vi verapamil å blokkere membranen ABCG2 transporter og observert toksisitet endringer av cisplatin. Vi har funnet at SP-celler var mye mer resistente overfor cisplatin enn NSP-celler ved hver konsentrasjon (P 0,001), bortsett fra ved 11 ug /ml (P 0,05) Denne situasjonen kan bli reversert ved forbehandling med verapamil, noe som indikerer at ABCG2 transporter kan spille en viktig rolle i medikamentresistens (fig. 5E). Imidlertid bør det bemerkes at Mdr1a /b /Bcrp1 trippel knockout-mus er levedyktige og fortsatt inneholde noe SP-celler i benmargen [42], som tyder på at mekanismen hvori SP-fenotypen blir bestemt ikke utelukkende tildeles gjennom ekspresjon av ABC transportørproteiner. Derfor forblir den eksakte mekanismen for Hoechst fargestoff utelukkelse ikke helt klarlagt.
Data fra uavhengige laboratorier, hovedsakelig basert på studier av kreft cellelinjer, har vist at sammenlignet med NSP befolkningen, kreft stilk-lignende
